Le plancher est une structure essentielle des neurones de la moelle épinière en développement, fournissant des signaux diffusibles de progéniteurs et la différenciation. Nous décrivons une méthode pour produire des varangues milieu conditionné, à appliquer au tissu de la moelle épinière frais, et d'évaluer les conséquences sur les protéines d'intérêt par la biochimie.
Au cours du développement, les progéniteurs et les neurones post-mitotiques reçoivent des signaux de territoires adjacents qui régulent leur sort. La plaque de sol est un groupe de cellules gliales tapissant le canal épendymaire en position ventrale. La plaque de sol exprime morphogènes clés contribuant à la structuration de lignées de cellules dans la moelle épinière. À des stades de développement plus tard, la plaque de sol réglemente la navigation des axones de la moelle épinière, agissant comme une barrière pour empêcher le passage des axones homolatéraux et franchissement de la ligne médiane de contrôle par les axones commissure 1. Ces fonctions sont réalisées grâce à la sécrétion de diverses signaux de guidage. Certains de ces indices agir comme attractifs et répulsifs pour les axones en croissance tandis que d'autres réglementent les récepteurs d'orientation et de signalisation en aval de moduler la sensibilité des axones aux 2,3 signaux de guidage locales. Nous décrivons ici une méthode qui permet l'étude des propriétés des signaux provenant du sol plaque dans une variété de dévecontextes lopmental, sur la base de la production de support de plancher Plate conditionné (FP cm) 4-6. Nous illustrons ensuite l'utilisation de ce FP cm dans le cadre de guidage axonal. Tout d'abord, la moelle épinière est isolé à partir d'embryons de souris à E12.5 et de la plaque de fond est disséqué et cultivées dans une matrice plasma-thrombine (figure 1). Deuxième deux jours plus tard, le tissu commissure sont disséqués à partir d'embryons E12.5, trituré et exposé à la FP cm. Troisièmement, le tissu est traité pour analyse par Western blot de marqueurs commissure.
La plaque de sol est un centre de formation de motif bien connu de la moelle épinière en développement, jouent un rôle clé dans la spécification des progéniteurs et les lignées de cellules post-mitotiques et contrôler la navigation des axones 7,8. La procédure expérimentale décrite ici pour produire FP cm permet aux enquêteurs d'évaluer les propriétés fonctionnelles des signaux de plaque dérivé étage dans un des contextes différents des processus de développement, de la structuration et la survie cellulaire à cellulaire et la migration des axones.
Pour illustrer l'utilisation de tels FP cm, les tissus de la moelle épinière dorsale contenant des neurones commissurales sont disséqués, dilacérées et stimulées avec du FP cm. Les tissus peuvent ensuite être traitées pour l'analyse Western blot. Cela permet d'instruction des règlements de la machine de guidage axonal par des signaux libérés plancher plat. Procédé de traitement de tissu frais dilacérées maintient le grand avantage de conserver le micro-environnement des cellules au sein de ee tissu. Ainsi, les conséquences du traitement par FP cm ou n'importe quels types de traitement sont évaluées de façon plus physiologique que dans des conditions de culture cellulaire et tissulaire.
La production de plaque de sol milieu conditionné fournit un moyen simple et efficace pour évaluer les propriétés biologiques des signaux libérés de la plaque de sol.
La matrice de plasma-thrombine offre une excellente condition de la survie de tissu. Néanmoins, cet environnement enrichi pourrait être une limitation pour certains types d'expériences. Ainsi, le tissu de la plaque de fond peut également être cultivé dans une matrice d'agarose. La qualité de la plaque de so…
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions Karine Kindbeiter, Muriel Bozon, et Florie Reynaud pour leur aide. Le travail est soutenu par le CNRS, le programme ANR YODA et Labex DevWeCan.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
REAGENTS REQUIRED | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PBS | Invitrogen | 14190-094 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HBSS, Ca2+/Mg2+– free | Invitrogen | 14170-088 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glucose | Sigma | G-7021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Neurobasal | Invitrogen | 21103-049 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Plasma | Sigma | P-3266 | 1mg/ml (Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thrombin | Sigma | T-4648 | 10mg/ml(Reconstitute in H2O and filtrate) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
B27 | Invitrogen | 17504-044 | 50X | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hepes (260g/mol) | Sigma | H-7006 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
EDTA | Sigma | E-5513 | 0,5M pH8 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MgCL2 | Euromedex | 2189 | 1M | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | VWR | 24388.295 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IGEPAL | Sigma | I-3021 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Complete Protease inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Sigma | S-6508 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
distilled H2O | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 1. Reagents required | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TOOLS AND MATERIAL | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Adson forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dumont #5 Fine Tips forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
micro knives | Fine Science Tools | 10136-14 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Table 2. Tools and material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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