Summary
Descriviamo un protocollo per la destabilizzazione del menisco mediale (DMM) modello nei topi, uno strumento efficace per l'osteoartrite (OA) la ricerca. Inoltre, abbiamo dimostrato che la carenza di progranulincan esagerata sviluppo OA e progressione utilizzando questo modello, indicando che progranulin svolge un ruolo protettivo nella patogenesi di OA.
Abstract
Destabilizzazione del menisco mediale (DMM), il modello è uno strumento importante per studiare i ruoli fisiopatologici di numerosi artrite molecole associate nella patogenesi dell'osteoartrosi (OA) in vivo. Tuttavia, il dettaglio, in particolare il protocollo visualizzato per la creazione di questo modello complicato nei topi, non è disponibile. Qui abbiamo approfittato di tipo selvatico e progranulin (PGRN) - / - mice come esempi di introdurre un protocollo per indurre il modello DMM nei topi, e confrontato l'insorgenza di OA in seguito all'istituzione di questo modello indotta chirurgicamente. Le operazioni eseguite su topi erano o operazione simulata, che ha appena aperto capsula articolare, o il funzionamento DMM, che ha tagliato il legamento menisco-tibiale e ha causato la destabilizzazione del menisco mediale. Artrosi gravità è stata valutata utilizzando test istologico (ad es safranina O colorazione), espressioni di geni OA-associati, la degradazione della cartilagine molecole della matrice extracellulare, e osteofiti formazione. Funzionamento DMM indotto successo OA iniziazione e la progressione sia di tipo selvatico e PGRN-/ - mice, e la perdita del fattore di crescita PGNR portato ad una più grave fenotipo OA in questo modello indotta chirurgicamente.
Introduction
L'osteoartrite (OA), noto anche come l'artrite degenerativa, colpisce il 15% della popolazione mondiale e più di 46 milioni di persone negli Stati Uniti, ed è caratterizzata da sinovite, degenerazione della cartilagine, e la formazione di osteofiti 1. Può essere il risultato di una complessa interazione di fattori genetici, metabolici, biomeccanici e biochimici. I meccanismi alla base di OA continuare a sottrarsi alla comunità scientifica. Attualmente ci sono numerosi modelli animali che possono mimare la patogenesi dell'OA 2,3. È importante stabilire modelli animali nei topi a causa sia della disponibilità di vari topi geneticamente modificati e la convenienza di sperimentazione. Tra i diversi tipi di modelli OA sperimentali, la destabilizzazione indotta chirurgicamente del menisco mediale (DMM) è un modello ben accettato OA per la sua buona riproducibilità e una progressione relativamente più lenta durante lo sviluppo OA. Entrambi questi attributi hannostato fondamentale per la valutazione della progressione OA in differenti trattamenti o transgeni 3-8. Tuttavia, la consistenza del modello OA chirurgica è influenzata da diversi fattori durante l'intervento chirurgico e, di conseguenza, l'applicazione del modello chirurgica topo è limitato.
Progranulin (PGRN) è un fattore di crescita multi-funzionale espressa in varie cellule. E 'noto che PGRN gioca un ruolo critico in vari processi fisiologici e malattie come la guarigione delle ferite 9, tumorigenesi 10, 11-15 e infiammazione. Studi hanno anche dimostrato che l'insufficienza di PGRN può causare malattie degenerative del sistema nervoso sia in esseri umani e topi 16-18. E 'noto che PGRN è espresso nella cartilagine articolare umana, e il suo livello è significativamente elevato nella cartilagine di pazienti con OA e artrite reumatoide 19. Inoltre, PGRN gioca un ruolo cruciale nella proliferazione di condrociti 20, differenziazione e endochondralossificazione della cartilagine di accrescimento durante lo sviluppo 21,22. Recentemente, abbiamo riportato che PGRN antagonized TNF-α attraverso il legame a recettori TNF ed espone una funzione anti-infiammatoria in modelli di artrite infiammatoria 13,14,23,24. Tuttavia, il ruolo di PGRN in OA, specialmente in vivo, resta un enigma. Qui, vi presentiamo la procedura di indurre un modello DMM chirurgico, e indagare il ruolo della PGRN nello sviluppo OA attraverso la creazione del modello DMM in WT e PGRN-/ - mice.
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Protocol
Tutte le procedure chirurgiche relative agli animali devono essere approvati dalla cura degli animali e Comitato Etico della Istituzione locale, con uno sforzo fatto per ridurre al minimo il dolore e il disagio causato da un intervento chirurgico.
1. Preparazione
- Selezionare 8-12 settimane maschio C57BL / 6 topi con un peso corporeo di circa 25 g per la chirurgia.
- Anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale di un cocktail contenente sia xilazina (5 mg / kg) e ketamina (40 mg / kg).
- Shave il ginocchio con rasoi, quindi chirurgicamente drappo l'animale e sterilizzare il sito chirurgico con Betadine e alcool (3x) e coprire gli occhi del mouse con unguento.
2. Processo chirurgico
- Fare un 1 centimetro longitudinale mediale para-rotulea incisione per esporre ginocchio.
- Aprire il ginocchio dolcemente attraverso dislocazione laterale della rotula e del legamento rotuleo.
- Tagliare la capsula articolare del ginocchio longitudinalmenteattraverso l'incisione mediale para-rotulea nel passo 2.1.
- Sezionare capsula articolare del ginocchio con una pinza.
- Afferra la parte distale del posteriore zampa con la mano sinistra, ed eseguire dislocazione laterale della rotula e del legamento rotuleo con una pinza. Tenere la zampa posteriore delicatamente e fare in modo di evitare traumi nella zampa. La migliore è la capsula articolare è sezionato, la forza di meno sarà necessario per rendere la dislocazione.
- Gocciolare salina sterile sulla superficie della cartilagine articolare durante il funzionamento per evitare l'essiccamento su superficie cartilaginea.
- Tagliare il legamento mediale meniscotibial che àncora menisco mediale al piatto tibiale. Evitare lesioni della cartilagine sotto il menisco mediale.
- Identificare il menisco mediale che individua tra condilo mediale del femore e plateau mediale della tibia.
- Identificare il legamento meniscotibial che collega parte laterale del menisco mediale con eminenza intercondiloidea della tibia.
- Tenere il hind zampa delicatamente con la mano, e tagliare il legamento mediale meniscotibial accuratamente utilizzando una lama chirurgica No. 10. Assicurarsi di non provocare ferire alla cartilagine articolare e di altri legamenti. In molti casi, il cuscinetto di grasso che copre deve essere tirato verso il lato ma non deve essere rimosso al fine di identificare il legamento.
- Chiudere la capsula articolare del ginocchio con una sutura assorbibile 6-0.
- Chiudere la pelle con 6-0 sutura in seta.
3. Assistenza post-operatoria
- Applicare una goccia di 0,25% bupivacaina nel sito chirurgico di ogni mouse per minimizzare il dolore post-operatorio.
- Lasciare i topi operati gratuitamente per ottenere acqua e cibo.
4. Segnare istologica di DMM chirurgico Modello
- Sacrifica il mouse nei punti indicati tempo (ad esempio 4 settimane, 8 settimane e 12 settimane. Qui abbiamo mostrato i risultati di 8 settimane come rappresentante) dopo l'intervento chirurgico.
- L'intero articolazioni del ginocchio sono fissi, decalcificata, embedded da paraffina e poi sezionati in serie a intervalli di 5 micron.
- Tagliare l'intero arti posteriori con n ° 10 lame.
- Sezionare la pelle ed i muscoli degli arti posteriori con attenzione, e fissare i campioni con PFA 4% per 3 giorni in RT.
- Rimuovere il PFA, e pulire i campioni con acqua. Successivamente, disincrostare i campioni in EDTA a 4 ° C per 2 settimane.
- Disidratare i campioni in un gradiente di etanolo. In dettaglio, mantenere i campioni in etanolo al 70% per 1 ora, quindi modificare l'etanolo e conservare i campioni in una nuova serie di etanolo al 70% per O / N. Successivamente, mettere i campioni a 80% e 90% etanolo conseguenza, e tenerli per 1 ora, rispettivamente, seguito da 100% di etanolo per O / N.
- Rimuovere l'etanolo. Conservare i campioni in oxylene per 1 ora, e passare a una nuova serie di oxylene. Ripetere questa operazione 3 volte.
- Incorporare i campioni in uno stampo di paraffina utilizzando il centro incorporamento Leica. Successivamente, i campioni sono sezionati a 5 micron utilizzando un microtomo rotativo (Leica RM2255, Germania) e poi raccolte su vetrini.
- Sezioni sagittali seriali sono tagliati per ogni campione attraversa una regione dal centro del condilo laterale al centro del condilo mediale.
- Viene eseguita safranina O colorazione, seguita da scoring e analisi statistiche mediante sistema di punteggio OARSI come descritto in precedenza 25.
- Primo, Deparaffinare i vetrini in oxylene, e li idratare in un gradiente di etanolo all'acqua distillata. Successivamente, si procede alla colorazione attraverso Ferro soluzione ematossilina di Weigert, 0,05% Verde veloce (FCF) Soluzione, 1% Acido acetico soluzione, e 0,1% safranina O Solution. Montare i vetrini con mezzo resinoso.
- Punteggio ottenuto i vetrini colorati safranina O basati sulla perdita di proteoglicani (colore rosso) nella cartilagine e la percentuale di distruzione nella struttura della cartilagine, fare analisi statistica per il punteggio istologico.
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Representative Results
Modello DMM è stato istituito con successo nei topi, e la carenza di PGRN esagerato sviluppo OA chirurgicamente indotto.
Operazioni fittizie e DMM (Figura 1) sono stati eseguiti in WT e PGRN-/ - mice. 8 settimane dopo l'operazione, i topi sono stati sacrificati, e safranina O colorazione è stata eseguita su sezioni di articolazioni del ginocchio, seguito da analisi statistica del punteggio artrite basata sulla istologia. Come mostrato in Figura 2A, non vi era alcuna degenerazione della cartilagine evidente in entrambi i genotipi in gruppi operativi sham basato su safranina O colorazione, che implicava condizioni simili al basale (pannelli superiori). 8 settimane dopo l'operazione DMM (pannelli inferiori), non vi era la perdita di proteoglicani e la distruzione della struttura della cartilagine sia WT e PGRN-/ - mice (frecce rosse). Sia la perdita di proteoglicani e degradazione della cartilagine suggeriscono l'induzione successo del fenotipo OA. Le barre delle colonne indicatEd la variazione tra i membri del gruppo intra seguente operazione DMM. Tuttavia, la barra è relativamente breve, e ko PGRN visualizzata una maggiore perdita di proteoglicani e della struttura cartilaginea era più gravemente distrutta rispetto al tipo selvatico razza. Inoltre, l'analisi statistica per il punteggio della cartilagine è stata eseguita come descritto in precedenza 25, e il punteggio cartilagine era significativamente più alta nel ko PGRN rispetto al gruppo WT. I nostri risultati hanno dimostrato che una perdita di PGRN dato più grave fenotipo OA.
Figura 1. Procedura chirurgica per l'induzione DMM. a. Un mediale para-rotulea incisione è realizzata in pelle di ginocchio. b. Esposizione ginocchio spazio articolare dopo la lussazione laterale della capsula articolare. c. interno sTRUTTURA del ginocchio. Freccia blu indica menisco mediale. Freccia gialla indica legamento meniscotibial. D. Menisco mediale è destabilizzato. Freccia blu indica il menisco mediale, che è dislocato dal sito originale. Freccia gialla mostra parte residua del legamento meniscotibial che è stato sezionato. D. La capsula congiunta è chiusa. F. La pelle è chiusa. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
Figura 2. Immagini rappresentative di istologia e analisi statistica per il punteggio di osteoartrosi A. rappresentativi immagini istologiche di WT e PGRN-/ -. Topi otto settimane seguenti operazioni sham o DMM, Dosati con safranina O colorazione. Le frecce rosse indicano la distruzione della cartilagine. Perdita di colore rosso nella cartilagine comporta la perdita di proteoglicani. Barra della scala, 100 micron B. Analisi statistica per un punteggio di osteoartrite in entrambe PGRN-/ -.. Topi e WT Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.
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Discussion
È stato riferito che il ceppo di topi è molto importante per il modello DMM induzione, come diversi ceppi di topi sono meno gravi di OA dopo DMM, con livello più alto nel ceppo 129/SvEv, seguita da C57BL6, 129/SvInJ e poi FVB / n 26. Una gran parte di transgeni sono stabiliti nei topi C57BL6, come PGRN-/ - mice che abbiamo usato in questo studio, che sono relativamente sensibili alla DMM. Tuttavia, se il transgene si riferiscono al ceppo insensibile come FVB / n topi, è necessario backcross questi topi con ceppi sensibili prima dell'induzione DMM. Il genere di topi utilizzati per l'induzione DMM è anche molto importante in quanto studi hanno già dimostrato che i topi femmine sono meno sensibili rispetto ai topi maschi 27. Inoltre, l'età di topi per il funzionamento DMM varia da 8 settimane a 12 settimane a base di letteratura 29, che gioca un ruolo critico nella patogenesi di OA. Pertanto, i topi della stessa età devono essere manovrati per eliminare questo effetto. Controllo del dolore postoperatorio è necessario per migliorare la circolazione dei topi dopo l'intervento chirurgico. Come modello DMM porta ad OA attraverso il movimento mediata usura nella cartilagine, movimento inadeguata a causa del dolore post operatorio può causare incoerenza di sviluppo OA. Attualmente vi è una discrepanza relativo alla definizione della DMM per quanto riguarda se o non rimuovere il menisco mediale 4,28. Nel nostro studio attuale, ci limitiamo destabilizzato menisco mediale, ma non abbiamo rimuoverlo. Lesioni nel modello DMM erano situati principalmente sulla regione centrale portante del piatto tibiale mediale, e la gravità delle lesioni aumentati durante il decorso (dati non pubblicati), ei risultati erano coerenti con le relazioni precedenti 5. Inoltre, il punteggio OARSI seguente operazione DMM è stato relativamente costante tra i diversi membri dello stesso gruppo genetico.
PGRN svolge un ruolo importante nello sviluppo della cartilagine e artrite 14,21. Abbiamoprecedentemente riportato che concatenamento PGRN con metalloproteasi ADAMTS-7 e ADAMTS-12, e protegge cartilagine matrice proteina COMP dalla degradazione 19. Inoltre, è ben stabilito che TNF-α svolge un ruolo critico nella cartilagine distruzione 24. Recentemente, abbiamo scoperto che PGRN antagonized TNF-α e protetta contro la distruzione della cartilagine nei modelli di artrite infiammatoria 14. In questo studio, abbiamo indotto modello DMM in WT e PGRN-/ - mice, e come previsto, PGRN-/ - mice esposto esagerata progressione dell'OA dopo induzione della DMM, che è stato indicato da più grave perdita di proteoglicani in safranina O colorazione e significativamente più alto punteggio artrite basato su istologia (Figura 2). Inoltre, le espressioni dei marcatori catabolici sono stati drammaticamente elevati in PGRN-/ - gruppo (dati non pubblicati), suggerendo la progressione OA accelerata in carenza di PGRN.
In conclusione, il nostro protocollo per la creazione di DMM modello successfully indotto fenotipo OA in WT e PGRN-/ - mice, e l'induzione era coerente e riproduttiva. La generazione di successo del modello di DMM in C57/B6 topi fornisce uno strumento utile per valutare agenti terapeutici e geni correlati OA per l'OA in futuro. In questo studio, il risultato del modello di DMM documenta un ruolo protettivo di PGRN nello sviluppo OA.
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Disclosures
Siamo qui dichiarare che non abbiamo alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal NIH borse di ricerca R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, e una malattia mirata Research Grant da Rheumatology Research Foundation (a CJ Liu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
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