Summary
최근 몇 년 동안, 살아있는 세포 기반 분석은 표면과 형태 적 항원에 대한 항체를 검출하기 위해 성공적으로 사용되어왔다. 여기서, 우리는 많은 환자 코호트의 분석을 가능 계측법 높은 처리량의 흐름을 사용하는 방법을 설명한다. 새로운 항체의 검출은 면역 매개 질환의 진단과 치료를 향상시킬 것입니다.
Abstract
최근 몇 년 동안, 표면 및 신경 전달에 관여 구조적 단백질에 대한 항체는 어린이와 성인자가 면역 CNS 질환에서 검출되었다. 이 항체는 진단과 치료를 안내하는 데 사용되었습니다. 세포 기반 분석은 환자의 혈청에서 항체의 검출을 개선했습니다. 그들은 다음 형광 색소 - 복합 이차 항체 다음에 희석 한 환자의 혈청으로 배양하는 진핵 세포에서 뇌 항원의 표면 발현을 기반으로합니다. 세탁 후, 바인딩 차 항체는 다음 유동 세포 계측법에 의해 분석된다. 우리 그룹은 안정적으로 특정 신경 전달 물질 수용체에 대한 항체를 검출하는 살아있는 세포 기반 분석 세포 계측법 높은 처리량의 흐름을 개발했다. 이 유동 세포 계측법 방법 곧장 앞으로, 양적, 효율적이며, 많은 환자 코호트 쉽게 짧은 시간으로 측정 될 수 있도록 높은 처리량 샘플러 시스템의 사용을 허용한다. 또한,이 같은 셀 기반말할 간단 중추 신경계 및 말초 신경계 모두에서 많은 다른 항원 표적으로하는 항체를 검출하도록 구성 될 수있다. 추가로 새로운 항체 바이오 마커를 발견하는 것은 신속하고 정확한 진단을 가능하게하고 면역 매개 질환의 치료를 향상시킬 것입니다.
Introduction
최근 몇 년 동안, 중추 신경계 (CNS) 질병의 면역 형태가 확인되었다. 이들 질환과 연관된자가 항체의 존재에 의해 정의되는 것으로 밝혀졌다. 이 항체는 신경 세포의 수용체 나 신경 전달의 1,2에 관련된 시냅스 단백질에 결합한다. 다른 항원은 N-메틸-D-아스파 테이트 수용체 (NMDAR) 3-5, γ-아미노 낙산의 B 수용체 (GABA의 B) 수용체 6, α-아미노 -3 - 히드 록시 -5 - 메틸 -4 -로서, 탐지 된 isoxazolepropionic 산 (AMPA) 수용체 7, 전압 - 문이 칼륨 채널 (VGKC) 관련 단백질 : 류신이 풍부한 신경 교종 활성 단백질 1 (LGL-1) contactin 관련 단백질 2 (capsr2) 8,9, 글루타민산 염 수용체 5,10 , 그리고 도파민 2 수용체 (D2R) 11. 과거에는 (주로 뇌염이라는) 이러한자가 면역 CNS 장애는 종종 진단되지 및 치료했다. 이 소설 항체 바이오 마커, 예를 들어,NMDAR의 항체 또는 D2R 항체는 실질적으로 진단과 인식을 개선하고, 환자에 대한 치료 옵션을 열었습니다. 사실, 면역 요법과 조기 치료가 개선 된 결과 (11, 12)와 연결되어 있습니다.
이러한 효소 결합 면역 분석 (ELISA)과 웨스턴 블롯으로 항체를 검출하는 전통적인 방법은 혈청에있는 항체의 검출에 사용되었다. 그러나, 그들은 쉽게 세포 또는 표면 항원의 인식을 사용하지 않고, 오히려 세포 내 항원으로 면역 반응을 보여줄 수 있습니다. 또한, 신경 전달에 관련된 중요한 단백질의 세포 외 도메인에 결합하는 항체는 병원성 2,3,7,13,14 될 가능성이있다. 따라서, 관련 세포 표면 또는 환자의 세포 항체 표적을 발견 할 수있는 정확하고 민감한 분석의 개발이 가장 중요하다. 필드 금 표준 방법은 소위 "휴대 BA에서, 생균의 사용에 기초SED 분석 ". 이 방법은 또한 포유 동물 세포의 항원의 완전한 cDNA의 서열을 함유하는 벡터의 형질 감염에 의해 네이티브 형태 (대부분 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포)의 표면 항원의 발현을 포함한다. 라이브 nonpermeabilized 세포는 다음 희석 된 환자의 혈청 배양 및 형광 색소 - 복합 항 - 인간 면역 글로불린 (ig으로) 이차 항체에 의해 따른다. 형광의 강도 또는 레벨은 검출되고 결합자가 항체의 수준으로 연관된다. 하나의 항원이 세포에서 과다 발현으로이 기술은 고유합니다. 가장 널리 "판독"을 사용은 면역 세포 화학 4,5,8-10 후 공 초점 현미경 분석하고있다. 그러나, 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 성공적으로 탈수 초성 질환 15 ~ 17 환자에서 항체를 감지하는 데 사용되었다. 특히, 워터스 외. 15은 팬을 사용하여 항체의 검출을 비교셀 기반 현미경으로 다음 분석이나 흐름 등의 항체 검출 기술의 엘 세포 계측법 분석하고, 가장 민감한 정확하고 신뢰할 수있는 방법으로 세포 기반 분석 유동 세포 계측법 보여 주었다. 그것은 조사 의존 정량없고, 방사성 물질의 사용을 포함하지 않는 때문에, 세포 기반 분석법 유세포 유리하다. 이 큰 환자의 코호트는 단시간으로 측정 할 수로서 또한 편리하다.
더 최근에, 우리는 면역 CNS 질환 환자 11 NMDAR 항체 및 D2R 항체를 검출하는 세포 기반 분석 계측법 높은 처리량의 흐름을 최적화했다. 우리 그룹은 최근 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 사용하여 환자의 혈청에서 NMDAR 항체를 발견했습니다. 이러한 NMDAR 항체 - 양성 혈청 기계 공 촛점 현미경을 사용하여 분석하고, 또한 11 개의 긍정적 인 것으로 밝혀졌다. 이 프로토콜은 C의 탐지를위한 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 설명자동 높은 처리량 샘플러를 이용하여 환자의 혈청에서 onformation 민감한 CNS 항체.
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Protocol
1. 전략 pIRES2-EGFP 벡터 인코딩 D2R 또는 NMDAR을 구성하는 서브 클로닝
- 인간 D2R 또는 NMDAR의 서브 유닛 1 (NR1)의 전체 길이의 cDNA 클론을 구하십시오.
- 등의 동시 발현되는 항원 및 GFP를 모두 가능하게하는 강화 된 녹색 형광 단백질 내부 ribosome 항목 사이트 (IRES)의 통제하에 (GFP) 기자와 횡단 단백질의 발현에 적합한 pIRES2-EGFP와 같은 발현 벡터를 선택 별도 세포.
- pIRES2-EGFP 벡터 내에서 인간의 cDNA를 서브 클론.
- cDNA를 서브 클로닝 적절한 제한 효소를 사용하려면 (인간 D2R cDNA를 예를 들어 NHEI 및 XhoI에 대한).
- 결찰 컷 cDNA를 제한 pIRES2-EGFP 벡터 내에 삽입합니다.
- 순서는 벡터가 올바른 순서로 포함되어 있는지 여부를 확인하기 위해 pIRES2-EGFP D2R 또는 NMDAR 벡터를 결찰.
- 정화 및 형질에 나중에 사용하기 위해 pIRES2-EGFP의 D2R 또는 NMDAR 벡터를 증폭.
- 신선한 둘 베코 변형 이글 매체 (1X) (DMEM) 4.5 g / L에 D-글루코오스, L-글루타민 및 110 mg의 10 % 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충 / L 피루브산 나트륨 완전한 가진 조직 배양 플라스크에서 배양 HEK293 세포 2 ㎜ 루타, 50 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신.
- 트립신 및 전송을 원뿔 튜브를 사용하여 HEK293 세포를 분리합니다.
- 6 분 250 XG에서 세포를 원심 분리하여 세척하고 신선한 완전한 DMEM에있는 세포 펠렛을 resuspend.
- 약 8 × 10 5 세포 / 웰과 문화 하룻밤 2 ML DMEM에서 37 ° C에서 5 % 인큐베이터에서 CO 2의 세포와 씨앗 6 웰 플레이트를 계산합니다.
- 그들은 약 70 %의 포화 상태에 도달 한 후, pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + 세포), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + 세포)와 HEK293 세포를 형질 및 pIRES2-EGFP (HEK293 CTL 세포, 벡터 제어)은 다음과 같이.나중에 보상에 대한 몇 가지 형질 감염되지 않은 HEK293 세포를 유지합니다.
- 2.5 μg DNA, 200 ㎕의 0.9 % 염화나트륨 및 4 ㎍ / ml의 폴리에틸렌 이민 / 웰 (각 2 ㎖ 신선한 완전 DMEM을 포함)를 포함하는 형질 전환 혼합물의 필요한 양을 준비한다.
- 즉시 10 초 동안 혼합하고 와동 적절한 웰에 형질 전환 혼합물의 양을 첨가하기 전에, 10 분 동안 실온 (RT)에서 배양한다.
- , 플레이트를 커버 파라 필름과 측면을 감싸, 세포 형질 전환을 지원하기 위해 5 분 280 XG에 원심 분리기.
- 파라 필름을 제거한 후 37 ℃에서 문화 인큐베이터에 배치
- 신선한 완전한 DMEM으로 18 시간 후 배양 배지를 교체하고 또 다른 72 시간 동안 문화를 유지한다.
- 선택적 : 72 시간 후 - 형질 감염, 형질 전환 된 세포는 형질 안정한 클론을 얻기 위해, 250 ㎍ / ml의 제 네티 신으로 보충 된 완전 DMEM에 배양하여 선택 될 수있다.
- 37 ° C에서 약 5 분 동안 500 μL / 잘 센과 배양 HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + 및 HEK293 CTL 세포를 분리
- PBS의 2ml/well에 재현 탁 (-CA 2 + / -의 Mg 2 +) 2 % FBS (PBS / FBS) 및 15 ㎖의 50 ML 원뿔 튜브로 전송 보충.
- 6 분 250 XG에서 원심 분리하여 세포를 세척하고 15 ~ 50 ㎖의 PBS / FBS에있는 세포 펠렛을 resuspend. 세척 배를 반복합니다.
- 세포를 계산 한 후 1 × 10 6 세포 / ml에서 PBS / FBS에 재현 탁.
- HEK293 D2R + 또는 HEK293 NMDAR + 세포뿐만 아니라, HEK293 CTL 세포가 각각의 환자 샘플 또는 기본 항체와 함께 배양 할 수있을 것이라는 점을 고려하여, 유동 세포 계측법 획득을위한 96 - 웰 템플릿을 디자인합니다.
- 50,000 세포 / 우리의 V-바닥 96 - 웰 플레이트의 씨앗 세포LL 취득 템플릿 유동 세포 계측법에있어서.
- 5 분 450 XG에 96 - 웰 플레이트를 원심 분리하고 부드럽게 전자 또는 수동 멀티 채널 피펫을 사용하여 상층 액을 제거, 각도에 접시를 기울 세포 펠렛을 대기음되지 않도록주의하여 세포 펠렛.
- HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, 그리고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 HEK293 CTL의 세포를 품어 :
- 항원 표면 발현을 평가하기 위해 차 항체의 희석으로.
- 항체를 검출하기 위해 환자 샘플.
- 예를 들어, 보상 컨트롤 세포 계측법 적절한 흐름을 사용합니다. 형질 감염되지 않은 흠 HEK293 세포, GFP + HEK293 세포 (AF647 -) 및 형질 감염되지 않은 AF647 + HEK293 세포 (GFP).
- 5 분 450 XG에서 원심 분리하여 세포를 세척하고 170 ㎕의 PBS / FBS에있는 세포 펠렛을 resuspend. 세척 단계 두 개 더 번 반복합니다.
- 1 시간 동안 세포를 품어(안티 NR1 또는 항 D2R 차 항체 환자의 혈청과 항 - 마우스 IgG 안티 인간 IgG) AF647 - 복합 이차 항체의 1:100 희석 어둠 속에서 실온에서 연구.
- 단계 3.7에서와 같이 세포를 세 번 씻어 셀 획득 유동 세포 계측법에 35 ㎕의 PBS / FBS에 재현 탁.
- (BDLSRII) 흐름 cytometer에 높은 처리량 샘플러 (HTS)을 설정합니다.
- 인수 템플릿 유동 세포 계측법에 따라 10,000 / 잘 취득.
- 수출 다음과 같은 FlowJo의 V7.5와 같은 소프트웨어 패키지 유동 세포 계측법을 사용하여 분석을 위해 데이터를 분석 :
- 첫째, 앞으로 (크기) 및 측면 (단위)에 따라 게이트 라이브 HEK293 세포를 없앤다.
- 만 형질 전환 세포를 분석 할 수있는 높은 GFP - 양성에 따라 더 게이트 라이브 HEK293 세포.
- 라이브 GFP 양성 세포 내에 AF647 채널의 평균 형광 강도 (MFI)를 결정한다.
- 분석을 위해 Excel 또는 프리즘에 데이터 내보내기 :
- 플롯 CMFI 대 차 항체 (항-NMDAR 또는 항-D2R 항체)의 oncentrations는이 항체와 함께 배양 세포에서 얻은.
- 각 환자 및 컨트롤 샘플은 각각 HEK293 D2R + 또는 HEK293 NMDAR + 세포의 MFI에서 CTL HEK293 세포의 MFI를 감산함으로써 ΔMFI를 결정한다.
- 제어 일대의 평균 ΔMFI 위의 세 가지 표준 편차를 추가하여 항체 양성의 임계 값을 계산합니다.
- 플롯 개별 샘플은 그래프에서 혈청 형에 따라 그룹화하고 라인으로서 임계 값을 나타낸다.
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Representative Results
라이브 HEK293 D2R + CTL 및 HEK293 세포는 높은 처리량 샘플러를 사용하여 유동 세포 계측기로 획득 하였다. 분석하는 동안, 세포는 앞으로 분산 형 (크기)와 사이드 분산 형 (단위) 매개 변수 (그림 1A와 1D)를 기반으로 문이되었다. 형질 감염된 HEK293 세포는 세포질에서 리포터 분자, GFP를 발현하고, 형질 감염되지 않은 세포를 분석 (도 1B 및 1E)에서 제외 하였다. GFP + 게이트 내에서 AF647-복합 항 - 인간 IgG 이차 항체 결합과 관련된 MFI는 (그림 1C 및 1 층)을 측정 하였다. 인간 혈청을 분석 할 때 배경 형광을 해소하기 위해, ΔMFI는 HEK293 D2R + 세포의 MFI (도 1G)까지 HEK293 CTL 세포의 MFI를 뺌으로써 계산 하였다. 표시된 데이터는 D2R 항체 분석의 대표이며,동일한 전략 게이팅 및 데이터 분석 NMDAR 항체 검출 (데이터 미도시)를 위해 사용될 수있다.
세포 기반 분석을 유동 세포 계측법에 의한 항체의 검출은 관심있는 항원의 세포 표면 발현에 기초한다. 도 2에 도시 된 바와 같이 HEK293 CTL 세포가 이들 항원 중 어느 것도 (도 2a 및도 2b)을 표현하는 반면, HEK293 NMDAR + 세포는 높은 표면 NMDAR (도 2A)를 표현하고 HEK293 D2R + 세포는 높은 표면 D2R (도 2B)를 나타냈다.
이 작품에 사용 된 환자 그룹은 NMDAR의 뇌염 환자 코호트 구성 (NMDAR ENC, N = 4, 표면 NMDAR β-1의 검출 NR1 항체 (3)에 의해 정의 된 뇌염), D2R 항체 관련 뇌염 (D2R ENC, N = 6, 표면 D2R 항체 (11)의 검출에 의해 정의 뇌염), 및 제어 코호트 WI간질, 뇌졸중, 발달 또는 신경 퇴행성 질환과 같은 일 다른 비염증성 신경 질환 (OND, N = 26). 환자 샘플은 이전에 NMDAR 5 D2R 11의 IgG 양성을위한 검증되었다. NMDAR 항체에 양성 명의 환자는 3 기술 및 혈청 샘플을 설명하고 상업적 사용 3,4에서 사용할로 NMDAR 항체를위한 세포 기반 분석을 사용하여 긍정적 인 검증 된로 NMDAR 뇌염의 전형적인 임상 증후군을했다. D2R 항체에 양성 명의 환자 (11)를 설명에 따라 기저핵 뇌염의 전형적인 임상 증후군이 있고, 혈청 샘플은 D2R 녹아웃 뇌 섹션, 형질 세포 및 신경 (11)를 이용하여 D2R 항체에 대한 긍정적 인 입증되었다.
환자에서 항체 양성을 결정하기 위하여, 항체 양성의 임계 값, 또는 차단은 상기 세 개의 표준 편차를 추가하여 각 실험에서 산출되었다OND 컨트롤 ΔMFI을 의미한다. D2R ENC와 육분의 육 환자가 인간의 표면 D2R의 IgG 항체 (그림 3B) 양성인 반면 NMDAR ENC와 4 / 4 예는, 인간의 표면 NMDAR IgG 항체 (그림 3A)에 대한 긍정적 인 확인되었다. 양성 환자의 아무도는 NMDAR 및 D2R을 대상으로 항체를 두 번 긍정적 없었다. NMDAR 및 D2R 항체 분석 OND 컨트롤 항에 검출되지 않았다 (도 3a 및도 3b). 그들은 세 가지 반복 실험 중 적어도 두 임계 값을 초과한다면 환자 샘플은 긍정적 인 것으로 간주되었다.
그림 1. 세포 기반 분석 계측법 높은 처리 흐름에 의해 항체의 검출 :. 전략 및 데이터 분석을 게이팅 거실 전자 HEK293 CTL 세포와 HEK293 D2R + 안정적인 형질 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) (, A, D 각각 74.7 %와 68.5 %)을 기준으로 문이되었다. HEK293 CTL 및 HEK293 D2R + 세포 (각각 32.8 % 및 95.4 %, B, E) 내에서 GFP 양성 세포 - 세포 (, B, E는 각각 67.2 % 및 4.6 %) 추가로 형질 감염되지 않은 GFP를 제외 게이트되었다. GFP + 세포 내에서, AF647-공액 항 - 인간 IgG를 이차 항체와 연관된 평균 형광 강도 (MFI) (= 3657 HEK293 CTL; HEK293 D2R + = 9128)는 (C, F)을 측정 하였다. 인간 샘플은 ΔMFI는 HEK293 D2R + 세포 (G)의 그것 HEK293 CTL 세포의 MFI를 뺌으로써 계산 하였다. D2R 항체 검출의 대표 데이터가 도시된다. ANK는 "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 세포 기반 분석 계측법 높은 처리량의 흐름에 의해 결정 표면 NMDAR 및 D2R의 발현. HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B), 및 HEK293 CTL 세포는 적절한 차 항체 다음에 일차 항체의 일련 희석액으로 염색 하였다. NMDAR 및 D2R의 높은 표면 발현이 관찰되었다. 그들이 차 항체의 농도가 증가하여 꾸준히 증가로서 MFI 값은 항체 역가와 상관. 예상했던대로, HEK293 CTL 세포 표면 NMDAR 또는 D2R 전혀 검출이 없었다. 대표 데이터가 표시됩니다.빈 "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 환자. NMDAR 뇌염에서 세라 (NMDAR ENC, N = 4) 다른 신경 학적 질환, D2R 항체 관련 뇌염 (D2R ENC, N = 10) 환자, 또는 컨트롤 (OND의 일대 표면 NMDAR 및 D2R 항체의 확인 검출 , N = 26 또는 24), 라이브 HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + 및 HEK293 CTL 세포와 함께 배양 AF647-복합 항 - 인간 IgG 이차 항체에 의해 미행했다. OND 컨트롤 (0 / 26 또는 0 / 24) 중 어느 하나 없었다 반면 표면 NMDAR 및 D2R 항체, 4분의 4 NMDAR ENC 환자 (A)와 각각 육분의 육 D2R ENC 환자 (B)의 혈청에서 검출되었다 항체 (A, B). Dotte그래프에 D 라인 OND 컨트롤의 평균 ΔMFI에 세 개의 표준 편차를 추가하여 계산 양성 임계 값을 나타냅니다. 세 가지 실험 중 대표적인 도트 플롯이 표시됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
본 논문은 높은 처리량 샘플러를 사용하여 특정 세포 표면의 연결 단백질을 표적으로하는 항체를 검출하는 살아있는 세포 기반 분석 유동 세포 계측법의 새로운 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술을 사용하여, 우리는 면역 CNS 질환으로 영향을 환자의 서브 그룹 NMDAR으로 표면 또는 표면 D2R하는 혈청 항체를 가지고 있음을보고한다.
살아있는 세포 기반 분석법 계측법이 높은 처리량의 흐름을 이용하여 최적의 항체 검출을위한 필수 단계는 건강한 형질 감염된 세포의 높은 수율을 얻는) 1 마련되어, 또한 항원이) 검증 높은 세포 표면 발현, 3) 항체의 임계치를 설정하는 양성 컨트롤의 코호트를 사용하여, 4)와 데이터의 재현성을 확인하기.
건강한 세포의 배양이 기술의 성공에 필수적입니다. HEK293 세포 배양, 높은 형질 효율성 및 신경원의 표현의 부족의 용이성을 위해 잘 알려진단백질, 이는 그들이 일반적으로 특정 신경 세포의 항원 4,5,8-10에 항체를 감지하는 세포 기반 분석에 사용 된 이유입니다. 이 분석이 정확하게 MFI를 계산하는 라이브의 GFP + 세포의 높은 비율을 취득하는 최적 형질 속도는 중요하다. 그것이 이전에 반복적으로 형질 세포 필요가없는 편리함과, GFP + 세포의 일관된 높은 수준을 제공하기 때문에 이러한 이유로, GFP의 폴리 클로 날 안정한 세포주 + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + 또는 HEK293 CTL 세포를 생산하는 것은 유익 각 실험. 거꾸로 현미경을 통해 형질 전환 세포의 빠른 볼은 건강한 세포 (수은 램프를 사용할 수있는 경우 GFP + 세포가 형광 것)를 확인하는 것이 좋습니다. 생존 능력은 그렇게 높지 않을 것 같은 경우에, 흐름 cytometer에서 셀 획득하기 전에 그와 같은 7 - 아미노 액 티노 마이신의 D와 같은 생존 염료를 사용하는 것이 유익 할 수도 있고 분석가의 여분 게이팅 단계를 추가하려면생존 불가능한 세포를 제외하는 것입니다.
자가 면역 CNS 질환에서 뇌 항원의 세포 외 도메인에 결합하는 항체 따라서 중점 라이브 nonpermeabilized 세포를 사용하여 항체의 검출에 배치, 병원성 2,3,7,13,14 것으로 생각되고 있습니다. 이 프로토콜은 표면 항원을 발현하는 형질 감염된 세포를 사용하여이 목적을 달성한다. 따라서 표면에있는 항원의 정확한 수출은 그 항원에 대한 상업 차 항체의 희석으로 형질 세포의 염색에 의해 결정되어야합니다. nonpermeabilized 세포 표면 항원의 발현 수준을 평가하면, 단백질의 세포 에피토프를 표적으로하는 항체를 사용하는 것이 필수적이다. 특이 적 항체를 사용할 수없는 경우에, 항원의 세포 외 도메인에 태그를 추가 할 필요하고, 그 후 표면 발현을 결정하기 위하여 태그에 대하여 상용 항체를 사용할 수있다. 우리는 성공적으로이헤 마글 루티 닌 - 태그 D2R를 사용하여이 방법을 사용하고 태그 자체 (11) 환자의 혈청 면역 반응을 지배했다. 이는 세포막에서 발현 및 구조적 무결성이 손상되지 않도록 관심 항원의 전체 cDNA의 서열은 적당한 벡터에 서브 클로닝하는 것도 중요하다. 실제로, 이전에 수용체 단백질의 특정 도메인 세포막 (18)로 정확한 폴딩, 내보내기 및 통합에 필수적인 것으로 나타났다.
세포 기반 분석 유동 세포 계측법, 각 실험에서 환자의 혈청 항체 양성을 평가하는 컨트롤 일대에서 파생 된 임계 값, 또는 차단의 설립에 의존합니다. 서주 외. 19 Δmedian 평균 형광 강도 이상이 표준 편차를 추가하여 항체 양성의 임계 값을 산출하고, 이것은 약 건강한 제어 범위의 95 번째 백분위 수에 맞습니다. 에우리의 이전 연구는, 우리는 높은 컷오프 건강한 제어 범위 11,20의 99 번째 백분위 수에 대응, (제어 일대의 평균 Δ MFI에 세 개의 표준 편차의 추가)을 선택했다. 또, McLaughlin의 외. 16은 항원 발현 세포와 항원 - 음성 세포 사이의 MFI의 비율로서 특정 항체의 반응성 측정을 표현하기 위해 선택했다. 보다 큰 5의 비율은 긍정적 인 생각과 우리의 작업과 유사하다 컨트롤의 평균 비율, 위의 세 가지 표준 편차에 대응했다. 더 높은 임계 값을 사용하여 프로토콜의 엄격 성을 증가시키고 컨트롤 및 항체 양성 환자 사이의 차별을 향상시킵니다. 중요한 사실은, 우리의 경험에서, 건강 제어 범위의 항체 반응성 계산기 계산기하는 인구 중 하나의 사용을 가능 OND 범위보다 크게 다르지 않았다항체 양성 11,20의 전자 임계 값.
모든 연구 실험에서와 같이, 데이터의 재현성이 가장 중요하다. 그들은 세 가지 독립적 인 실험 중 적어도 2 개에 양성의 임계 값을 초과하는 경우 환자의 혈청은 특정 신경 세포의 항원에 대한 항체에 대한 긍정적 인 것으로 간주됩니다. 개별 환자 혈청에서 IgG의 농도를 변화했다. 이러한 변화는 다른 환자에 대하여 결합 항체의 수준에 영향을 미칠 수있다. 우리의 이전 연구에 사용 된 모든 환자의 혈청 네 펠로 법에 의해 측정하고, 정상 범위 (6.2-14.4 g / L) (11)의 내부로 발견, 우리는 항상 같은 희석 배수와 혈청을 희석 하였다. 각각의 혈청 역가 곡선을 설정하면 환자 사이에 항체의 농도를 비교하기 위해 도움이 될 수 있습니다. 또한, 조사의 초기 눈부신은 세포 기반 분석 중에 권장하지만 컨트롤은 멋 부리다을 계산하기 위해 맹검 할 필요가있다의 ivity 임계 값.
그럴듯한 항체 표적이 발견되면, 해당 유효성은 위양성을 방지하기 위해 필요하다. 세포 기반 분석 유동 세포 계측법을 사용하여 검출 항체 양성 또는 음성 샘플은 우선적으로 변성 또는 선형 항원을 사용하지 않을 다른 방법을 사용하여 정량한다. 예를 들어, 항원 특이 녹아웃 동물에서 뇌 부분에 면역 반응을 감소 성공적으로 9-11,21을자가 항원 몇 가지 새로보고 CNS의 경우에 표시되어 있습니다. 항원을 발현하는 세포에 환자의 혈청 Immunoabsorption는 결과 9,11의 유효성을 검사하는 데 사용되었다.
이 문서에 설명 된 세포 기반 분석 프로토콜 유동 세포 계측법 쉽게 CNS 밖에서 발견되는 등 다양한 항원 대상, 다수의 항체 특이성을 평가하기 위해 변경 될 수 있습니다. 그것은 다른 알 수없는 특이성의 항체가로 아직 존재하고 있다는 것입니다확인. 우리의 이전 연구 11,20에서와 같이 또한,이 기술은, IgM 항체를 포함 ig으로 다른 클래스와 서브 클래스를 검출하기에 적합합니다. IgG의 서브 클래스의 결정은 또한 질병의 발병에 기여하는 가능성을 보여줄 수 있습니다. 예를 들어의 IgG1 또는 동반되었고 IgG3 아형 항체 의존 세포 매개 세포 독성을 중재 또는 보완 의존자가 항체에 의한 병원성 메커니즘 14,20,22를보고 세포 독성을 할 수 있습니다. AF647 (지금까지 레드)가 아닌 형광 염료는 한 그들은 충분히 리포터 분자, GFP의에서 방출 피크가로 이용 될 수있다. 오버랩되는 발광 스펙트럼 올바른 보상 요구가 있어야합니다. 세포가 처음으로 고정 항체 결합에 항원을 사용할 수 있도록 permeabilized 될 필요가 있지만, 세포 내 단백질에 대한 항체의 특이성을 결정하는 것은 또한, 유동 세포 계측법 사용하는 것이 가능하다. 이러한 대안 기술은 높은 BACKGROU 될 수 있습니다ND 인해 그렇지 않으면 라이브 nonpermeabilized 세포에 숨겨진 세포 내 도메인뿐만 아니라 다양한 세포 항원에 대한 항체의 노출. 이러한 교란 요인은 세포 기반 분석 및 적절한 통제가 적절하게 수행해야하는 유동 세포 계측법의 강도를 줄일 수 있습니다.
세포 기반 분석 계측법 높은 처리량 흐름의 사용은 많은 환자 코호트에서 인간 혈청 항체의 검출을위한 안정적이고 정확한 방법을 제공한다. 이 기술을 통해 추가로 새로운 항체를 발견하는 것은 진단 및자가 면역 CNS 질환을 가진 환자의 향후 치료에 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
관심의 충돌 : 특허는자가 항체에 대한 대상으로 D2R을 주장 FB와 RCD (시드니 대학)에 의해 제기되었다.
Acknowledgments
이 작품은 호주 국립 보건 의학 연구위원회, 성 과학 재단 (호주), 뚜렛 증후군 협회 (USA)에 의해 지원되었다, 트리샤 다중 경화증 연구 재단 및 다발성 경화증 연구 호주, 페 트레 재단 (호주), 레베카 L. 장수 의료 연구 재단 (호주). 우리는 모든 환자와 연구에 대한 샘플을 제공하는 가족 구성원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
