Summary
במהלך השנים האחרונות, מבחני מבוססי תאים חיים כבר השתמשו בהצלחה כדי לזהות נוגדנים כנגד פני השטח ואנטיגנים קונפורמציה. כאן, אנו מתארים שיטה באמצעות זרימת cytometry תפוקה גבוהה המאפשר הניתוח של קבוצות גדולות של חולים. זיהוי של נוגדני רומן ישפר את האבחון וטיפול בהפרעות חיסונית בתיווך.
Abstract
במהלך השנים האחרונות, נוגדנים כנגד פני השטח וחלבונים המעורבים בקונפורמציה העצבית זוהו במחלות של מערכת העצבים המרכזית אוטואימונית בילדים ומבוגרים. נוגדנים אלה היו בשימוש כדי להדריך את האבחון וטיפול. מבחני מבוססי תאים שיפרו את זיהוי של נוגדנים בסרום חולה. הם מבוססים על הביטוי על פני השטח של מוח אנטיגנים על תאי אוקריוטים, אשר לאחר מכן מודגרת עם סרה מטופל מדוללת ואחריו נוגדנים משני fluorochrome-מצומדות. לאחר כביסה, נוגדנים משני מחייבים מנותחים לאחר מכן על ידי cytometry זרימה. הקבוצה שלנו פיתחה זרימת תפוקה גבוהה cytometry assay מבוסס תאים חיים כדי לזהות באופן מהימן נוגדנים כנגד קולטני הנוירוטרנסמיטר ספציפי. שיטת cytometry זרימה זו היא ישר קדימה, כמוני, יעיל, והשימוש במערכת סמפלר תפוקה גבוהה מאפשר למחזורי מטופל גדולים להיות assayed בקלות בפרק זמן קצר של זמן. בנוסף, זו המבוססת על תא כלומר ניתן להתאים בקלות לאיתור נוגדנים למטרות רבות ושונות אנטיגני, שניהם ממערכת העצבים המרכזית והפריפריה. גילוי סמנים ביולוגיים נוגדן רומן נוספים יאפשר אבחון מהיר ומדויק ולשפר את הטיפול בהפרעות חיסונית בתיווך.
Introduction
בשנים האחרונות, טפסים אוטואימונית של מערכת עצבים המרכזית מחלות (CNS) זוהו. הוכח כי מחלות אלה קשורים ומוגדרים על ידי הנוכחות של נוגדנים עצמיים. נוגדנים אלה נקשרים לקולטנים עצביים או חלבונים סינפטיים המעורבים ב1,2 העצבית. אנטיגנים שונים שכבר זוהו, כגון קולטן N-methyl-D-aspartate (NMDAR) 3-5, חומצת B קולטן γ-aminobutyric (GABA-B) קולטן 6, α-אמינו-3-hydroxy-5-methyl-4- קולטן חומצת isoxazolepropionic (AMPA) 7, ערוץ אשלגן תלוי מתח (VGKC) חלבונים הקשורים: חלבון לאוצין עשיר מופעלת גליומה 1 (LGL-1) וקשורים contactin החלבון 2 (capsr2) קולטן 8,9, גלוטמט 5,10 , ודופאמין-2 קולטן (D2R) 11. בעבר, הפרעות אלה אוטואימונית של מערכת העצבים המרכזית (בעיקר בשם דלקת קרום המוח) היו לעתים קרובות לא מאובחנים ואינם מטופלים. סמנים ביולוגיים נוגדנים אלה רומן, למשלנוגדן NMDAR או נוגדן D2R, השתפר באופן משמעותי אבחנה ומודעות, ופתח אפשרויות טיפול בחולים. ואכן, טיפול מוקדם עם immunotherapies קשור בתוצאות משופרות 11,12.
שיטות מסורתיות לאיתור נוגדנים, כגון assay enzyme-linked immunosorbent (ELISA) וכתם מערבי שימשו לזיהוי של נוגדנים בסרום. עם זאת, הם לא בקלות יאפשר זיהוי של אפיטופים תאיים או משטח ו, ולא, עשוי לחשוף immunoreactivity כלפי epitope תאיים. יתר על כן, נוגדנים שנקשרים לתחום תאי של חלבונים חשובים המעורבים בהעברה עצבית עשויים להיות 2,3,7,13,14 פתוגניים. לכן, הפיתוח של מבחני מדויקים ורגישים כדי לגלות תא שטח רלוונטי או מטרות נוגדנים תאיים בחולים הוא בעל חשיבות עליונה. שיטת תקן זהב בתחום מתבססת על השימוש בתאים חיים, במה שמכונה "תא-baמבחני SED ". שיטה זו כרוכה בביטוי של אנטיגן על פני השטח של תאי יונקים (לרוב 293 תאים עובריים אנושיים בכליות (HEK293)) בצורה המקורית שלו על ידי transfection של וקטורים המכילים את רצף cDNA המלא של אנטיגן של עניין. לאחר מכן תאי nonpermeabilized בשידור חי מודגרת עם סרום מטופל מדולל ואחריו אימונוגלובולינים אנטי אנושיים fluorochrome מצומדות (איג) נוגדנים משני. העצמה או רמת הקרינה לאחר מכן זוהתה והיא קשורה לרמה של נוגדן מחייב. טכניקה זו היא ספציפית, אלא כאחד אנטיגן הוא ביטוי יתר בתאים. שימוש נרחב ביותר "לקריאה מתוך" כבר ניתוח מיקרוסקופיה confocal לאחר immunocytochemistry 4,5,8-10. עם זאת, cytometry זרימת מבחני מבוססי תאים שימשה בהצלחה לאיתור נוגדנים בחולים עם מחלות demyelinating 15-17. בפרט, ווטרס ואח'. 15 לעומת זיהוי של נוגדנים באמצעות מחבתאל של שיטות לזיהוי נוגדנים כוללים מבחני מבוססי תאים ואחריו במיקרוסקופ או cytometry זרימת מנתח, והוכיח cytometry זרימת assay מבוסס תאים להיות השיטה רגישה ביותר, מדויקת ואמינה. לכן, cytometry זרימת assay מבוסס תאים היא יתרון כפי שהיא כמוני, לא חוקר תלוי, ואינו כרוכים בשימוש בחומר רדיואקטיבי. זה גם נוח שכן היא מאפשרת מחזורי מטופל גדולים להיות מאושרים בפרק זמן קצר.
לאחרונה, יש לנו מותאם זרימת תפוקה גבוהה cytometry assay מבוסס תאים כדי לזהות נוגדני NMDAR ונוגדני D2R בחולים עם מחלות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית 11. הקבוצה שלנו לאחרונה זוהתה נוגדני NMDAR בסרה מטופל באמצעות cytometry זרימת assay מבוסס תאים. סרום הנוגדנים חיוביים NMDAR אלה נותחו בעבר באמצעות מיקרוסקופיה confocal ונמצא גם להיות חיובי 11. פרוטוקול זה מתאר cytometry זרימה assay מבוסס תאים לצורך זיהוי של גנוגדן onformation רגיש במערכת העצבים המרכזית בסרום חולה ניצול סמפלר תפוקה גבוהה אוטומטי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Subcloning אסטרטגיה לבניית pIRES2-EGFP וקטור הקידוד D2R או NMDAR
- השג שיבוט cDNA באורך מלא של D2R אדם או למקטע NMDAR 1 (NR1).
- בחר וקטור ביטוי, כגון pIRES2-EGFP, אשר מתאים לביטוי של חלבונים הטרנסממברני עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר כתב (GFP) תחת שליטה של אתר פנימי הריבוזום כניסה (IRES), מה שמאפשר שני אנטיגנים וGFP להיות coexpressed ב תאים בנפרד.
- Subclone cDNA האנושי בתוך וקטור pIRES2-EGFP.
- לsubclone cDNA, השתמש אנזימי הגבלה מתאימים (לדוגמא NheI וXhoI לאדם D2R cDNA).
- cDNA לחתוך ולקשור להכניס בתוך וקטור pIRES2-EGFP מוגבל.
- רצף ligated pIRES2-EGFP D2R או וקטור NMDAR כדי לבדוק אם הווקטור מכיל את הרצף הנכון.
- לטהר ולהגביר D2R pIRES2-EGFP או וקטור NMDAR לשימוש מאוחר יותר בtransfection.
- תרבות תאי HEK293 בצלוחיות תרבית רקמה עם הנשר בינוני של Dulbecco הטרי השונה (1x) (DMEM) להשלים עם L / 4.5 גרם D-גלוקוז, L-גלוטמין ו110 מ"ג / פירובט נתרן L בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS), 2 מ"מ Glutamax, ו50 מיקרוגרם / מיליליטר גנטמיצין.
- ניתוק תאי HEK293 באמצעות טריפסין והעברת צינור חרוטי.
- שטוף ידי צנטריפוגה תאים ב 250 XG במשך 6 דקות ו resuspend התא גלולה ב DMEM המלא הטרי.
- ספירת התאים זרע 6 צלחות גם בסביבות 8 x 10 5 תאים היטב / ותרבות הלילה בDMEM 2ml על 37 ° C ו 5% CO 2 באינקובטור.
- ברגע שהם הגיעו confluency סביב 70%, transfect HEK293 התאים עם pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + תאים), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + תאים), ו( HEK293 תאי CTL; בקרת וקטור) pIRES2-EGFP כדלקמן. לשמור על כמה תאי HEK293 untransfected לפיצוי בשלב מאוחר יותר.
- הכן את הנפח הנדרש של תערובת transfection הכולל 2.5 מיקרוגרם DNA, 200 μl 0.9% נתרן כלורי ו4 מיקרוגרם / מיליליטר polyethylenimine / טוב (כל אחד המכיל 2 מיליליטר DMEM להשלים טרי).
- מייד מערבולת התערובת ל10 שניות ו דגירה בטמפרטורת חדר (RT) עבור 10 דקות, לפני שמוסיף נפח של תערובת transfection לבארות המתאימות.
- מכסה את הצלחת, לעטוף את הצדדים עם Parafilm, ו צנטריפוגות ב XG 280 למשך 5 דקות כדי לסייע transfection תא.
- הסר את Parafilm ולאחר מכן למקם בחממה לתרבות ב 37 ° C.
- החלף תקשורת תרבות 18 שעה מאוחר יותר עם DMEM המלא טרי, ולשמור בתרבות לעוד 72 שעה.
- אופציונאלי: לאחר transfection 72 שעה, ניתן לבחור תאי transfected על ידי התרבות בDMEM המלא בתוספת 250 מיקרוגרם / מיליליטר Geneticin, על מנת לקבל transfectant יציב polyclonal.
class = "jove_title"> 3. לזרום assay המבוסס תא Cytometry לאיתור של נוגדנים לאנטיגנים במשטח עצביים
- ניתוק HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, וHEK293 תאי CTL על ידי דגירה עם 500 μl / טוב Versene למשך כ 5 דקות על 37 ° C.
- Resuspend ב 2ml/well של PBS (-Ca 2 + /-Mg 2 +) בתוספת 2% FBS (PBS / FBS) והעברה ל15 מיליליטר או 50 מיליליטר צינור חרוטי.
- שטפו תאים על ידי צנטריפוגה ב250 XG במשך 6 דקות ו resuspend התא גלולה ב 15-50 מיליליטר PBS / FBS. חזור על לשטוף 2x.
- ספירת התאים ולאחר מכן resuspend ב PBS / FBS ב1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- עיצוב תבנית 96, גם לרכישת cytometry הזרימה, בהתחשב בכך שHEK293 D2R + או HEK293 NMDAR + תאים, כמו גם תאי HEK293 CTL יהיו חייבים להיות הודגרו עם כל דגימת חולה או נוגדן ראשוני.
- תאי זרע בצלחת 96 היטב V-תחתון ב50,000 תאים /ll פי cytometry זרימת תבנית רכישה.
- גלולה התאים על ידי צנטריפוגה צלחת 96 היטב ב450 XG במשך 5 דקות ולהסיר בעדינות את supernatant באמצעות פיפטה רבה אלקטרונית או ידנית, מטה את הצלחת על זווית ונזהר שלא לשאוב את התא גלולה.
- דגירה HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR +, וHEK293 תאי CTL עבור שעה 1 ב RT בחושך עם:
- דילולים סדרתי של נוגדן ראשוני על מנת להעריך את הביטוי על פני השטח אנטיגן.
- דגימות חולה כדי לזהות נוגדנים.
- השתמש בזרימה מתאימה cytometry בקרות פיצוי, למשל. תאי HEK293 untransfected בלא כתם, ה-GFP + HEK293 תאים (AF647 -), וAF647 + HEK293 תאי untransfected (GFP).
- שטפו תאים על ידי צנטריפוגה ב450 XG במשך 5 דקות ו resuspend התא גלולה ב μl 170 PBS / FBS. חזור על שלב לשטוף פעמים נוספות.
- דגירה תאים עבור h 1r ב RT בחושך עם 1:100 דילול של נוגדנים משני AF647 מצומדות (IgG אנטי אנושי לסרום מטופל ואנטי העכבר IgG לנוגדנים עיקריים נגד NR1 או אנטי D2R).
- לשטוף את התאים שלוש פעמים, כמו בשלב 3.7, ו resuspend ב35 μl PBS / FBS עבור cytometry זרימת רכישת תא.
- הגדרת סמפלר התפוקה גבוהה (HTS) על cytometer הזרימה (BDLSRII).
- לרכוש 10,000 אירועים / טוב פי cytometry זרימת תבנית רכישה.
- יצוא ולאחר מכן לנתח את הנתונים לניתוח באמצעות cytometry זרימת חבילת תוכנה, כגון v7.5 FlowJo:
- ראשית, שער HEK293 התאים חיים המבוסס על קדימה (גודל) וצד (גרעיניות) מפזר.
- תאי שער נוסף חיים HEK293 מבוססים על ה-GFP-חיוביות גבוהה לנתח רק את תאי transfected.
- לקבוע את עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) של ערוץ AF647 בתוך התאים GFP חיובי בשידור חי.
- נתוני יצוא לאקסל או פריזמה לניתוח:
- מגרש גoncentrations של נוגדן ראשוני (אנטי NMDAR או נוגדן אנטי D2R) לעומת MFI המתקבל מהתאים הודגרו עם נוגדנים אלה.
- עבור כל דגימת חולה ובקרה, לקבוע את ΔMFI ידי הפחתת MFI של HEK293 תאי CTL מMFI של HEK293 D2R + או HEK293 NMDAR + תאים, בהתאמה.
- לחשב את הסף של חיוביות נוגדנים על ידי הוספת שלוש סטיות תקן מעל ΔMFI הממוצע של קבוצת הביקורת.
- דגימות בודדות עלילה קובצו לפי סוג הדם שלהם על גרף ומייצגות את הסף כקו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תאי חי HEK293 D2R + וHEK293 CTL נרכשו בcytometer הזרימה באמצעות סמפלר תפוקה גבוהה. במהלך ניתוח, תאים היו מגודרות המבוססים על פיזור קדימה (גודל) ופיזור בצד פרמטרים (גרעיניות) (איורים 1 א ו1D). HEK293 תאי transfected הביעו מולקולת הכתב, ה-GFP, בציטופלסמה, ותאי untransfected הוצאו מניתוח (איורים 1B ו 1E). בתוך ה-GFP + השער, MFI הקשורים לנוגדן AF647 מצומדות אנטי אנושי IgG המשני מחייב נמדד (1C דמויות ו1F). כדי לחסל את הקרינה הרקע בעת ניתוח סרה אנושי, ΔMFI חושב על ידי הפחתת MFI של HEK293 תאי CTL מMFI של D2R + HEK293 התאים (איור 1G). הנתונים שמוצגים הוא נציג של ניתוח נוגדן D2R, ובאותו ניתוח אסטרטגית gating ונתונים יכול לשמש לגילוי NMDAR נוגדנים (מידע לא מוצג).
איתור נוגדנים על ידי cytometry זרימת assay מבוסס תאים מבוסס על הביטוי פני התא של אנטיגן של עניין. כפי שניתן לראות בתרשים 2, HEK293 NMDAR + תאים מאוד הביעו NMDAR פני השטח (איור 2 א) וHEK293 D2R + תאים מאוד הביעו D2R פני השטח (איור 2), ואילו תאי HEK293 CTL הביעו אף אחד מאנטיגנים אלה (2A דמויות ו2B).
הקבוצות החולה המשמשות בעבודה זו כללו מדגם חולה עם דלקת קרום המוח NMDAR (NMDAR ENC, n = 4, דלקת קרום המוח שהוגדר על ידי זיהוי של משטח NMDAR-מקטע 1 3 NR1 נוגדנים), דלקת המוח הקשורים לנוגדן D2R (D2R ENC, n = 6, דלקת קרום המוח שהוגדר על ידי זיהוי של נוגדני D2R משטח 11), וwi קבוצת ביקורתמחלות אחרות ה noninflammatory נוירולוגיות (OND, n = 26), כגון אפילפסיה, שבץ מוחי, ופרעות התפתחותיות או ניווניות. דגימות מטופל אומתו בעבר עבור NMDAR 5 וD2R 11 חיובי IgG. ארבעה חולים חיוביים לנוגדני NMDAR היו תסמונת קלינית אופיינית לדלקת קרום מוח NMDAR כמתואר 3 ודגימות סרום הוכחו חיוביות באמצעות מבחני מבוססי תאים לנוגדני NMDAR כפי שתוארו וזמין בשימוש מסחרי 3,4. שישה החולים חיוביים לנוגדני D2R היו תסמונת קלינית אופיינית לדלקת קרום מוח גרעיני בסיס כפי שתואר 11, ודגימות סרום הוכחו חיוביות לנוגדני D2R באמצעות עקום החוצה סעיפי D2R מוח, תאי transfected, ונוירונים 11.
על מנת לקבוע חיוביות נוגדנים בחולים, הסף, או הפסקת, של חיוביות נוגדן חושבה בכל ניסוי על ידי הוספת שלוש סטיות תקן מעלמתכוון ΔMFI של בקרות OND. 4/4 החולים עם NMDAR ENC אושרו חיוביים לנוגדני משטח אנושי NMDAR IgG (איור 3 א), ואילו החולים 6/6 עם D2R ENC היו חיוביים לנוגדני IgG D2R פני השטח אנושיים (איור 3 ב). אף אחד מהחולים החיוביים היו חיובי כפולות לנוגדני מיקוד NMDAR וD2R. (3A דמויות ו3B) נוגדני NMDAR וD2R לא אותרו באף אחד מפקדי OND מנותחים. דגימות מטופל נחשבו חיוביות אם הם היו מעל הסף בלפחות שתיים מתוך שלושה ניסויים חוזרים ונשנים.
איור 1. זיהוי של נוגדנים על ידי זרימת cytometry תפוקה גבוהה assay מבוסס תאים:. Gating אסטרטגיה וניתוח נתונים ליב תאי הדואר HEK293 CTL וtransfectants היציב HEK293 D2R + היו מגודרות המבוססים על פיזור קדימה (FSC) ופיזור צד (SSC) (74.7% ו68.5%, בהתאמה;, ד '). תאי GFP חיוביים בתוך HEK293 CTL וD2R + HEK293 תאים (32.8% ו95.4%, בהתאמה; B, E) היו מגודרות נוספים להוציא GFP untransfected - תאים (67.2% ו4.6%, בהתאמה; B, E). בתוך ה-GFP + התאים, עוצמת הקרינה הממוצעת (MFI) קשורה עם נוגדן AF647 מצומדות אנטי אנושי IgG המשני (HEK293 CTL = 3,657; HEK293 D2R + = 9,128) נמדדה (C, F). עבור דגימות אנושיות, ΔMFI חושב על ידי הפחתת MFI של HEK293 תאי CTL מזה של D2R + HEK293 התאים (G). נציגי נתונים של זיהוי נוגדני D2R מוצג. ank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. ביטוי של NMDAR פני השטח וD2R נקבע על ידי זרימת תפוקה גבוהה cytometry assay מבוסס תאים. HEK293 NMDAR + (), HEK293 D2R + (ב), ותאי CTL HEK293 הוכתמו דילולים סדרתי של נוגדן ראשוני, ואחריו משני נוגדנים מתאימים. ביטוי על פני השטח גבוהים של NMDAR וD2R נצפה. ערכי MFI מתואמים עם titre נוגדנים כפי שהם גדלו בהתמדה עם ריכוזים הולך וגדל של נוגדן ראשוני. כצפוי, לא היה זיהוי של NMDAR משטח או D2R בHEK293 תאי CTL. נציגי נתונים מוצג.ריק "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. גילוי אושר נוגדני NMDAR פני השטח וD2R בקבוצה של חולים. סרה מדלקת קרום מוח NMDAR (NMDAR ENC, n = 4), דלקת קרום המוח D2R הקשורים נוגדנים (D2R ENC, n = 6) חולים, או פקדים עם מחלות נוירולוגיות אחרות (OND , N = 26 או 24) הודגרו עם HEK293 החי NMDAR +, HEK293 D2R +, וHEK293 תאי CTL, ואחריו נוגדן IgG אנטי אנושי AF647 מצומדות המשני. נוגדני NMDAR פני השטח וD2R התגלו בסרום של 4/4 חולי NMDAR ENC (א) ו 6/6 חולי D2R ENC (ב '), בהתאמה, ואילו אף אחד מפקדי OND (0/26 או 0/24) היה גם נוגדנים (A, B). Dotteקווי ד בגרפים מייצגים את סף החיוב מחושב על ידי הוספת שלוש סטיות תקן לΔMFI הממוצעת של בקרות OND. חלקות נקודת נציג מתוך שלושה ניסויים מוצגות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מאמר זה מתאר יישום רומן של cytometry זרימת assay מבוסס תאים חיים כדי לזהות נוגדני מיקוד חלבונים עצביים תא שטח ספציפיים באמצעות סמפלר תפוקה גבוהה. באמצעות טכניקה זו, אנו מדווחים כי תת קבוצה של חולים שנפגעו במחלות במערכת העצבים המרכזית אוטואימוניות יש נוגדנים בסרום על פני השטח NMDAR או על פני השטח D2R.
צעדים חיוניים לגילוי נוגדנים אופטימלי באמצעות זרימת תפוקה גבוהה זה cytometry assay המבוסס על תא החי כוללים 1) קבלת תשואה גבוהה של תאי transfected בריאים, 2) ביטוי בתא שטח גבוה אימות של אנטיגן של עניין, 3) הקמת סף של נוגדן חיוביות באמצעות קבוצה של פקדים, 4) ומאשרת את שחזור של נתונים.
התרבות של תאים בריאים היא יסוד להצלחה של טכניקה זו. HEK293 תאים ידועים כדי להקל שלהם של תרבות, יעילות transfection גבוה, וחוסר הביטוי של עצבי שלהםחלבונים, וזו הסיבה שהם כבר בשימוש נפוץ במבחנים מבוססי תאים כדי לזהות נוגדנים לאנטיגנים עצביים ספציפיים 4,5,8-10. שיעור transfection אופטימלי לרכישת אחוז גבוה של תאים + GFP חיים הוא קריטי עבור assay זה כדי לחשב במדויק MFI. מסיבה זו, ייצור קו polyclonal יציב תא של ה-GFP + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, או HEK293 CTL תאים הוא יתרון כפי שהיא מספקת רמה גבוהה של ה-GFP + תאים עולה בקנה אחד, עם הנוחות הנוספת של שלא יצטרך שוב ושוב תאי transfect לפני כל ניסוי. הצגה מהירה של תאי transfected באמצעות מיקרוסקופ הפוכה מומלצת לבדוק לתאים בריאים (ה-GFP + תאים לזרוח אם מנורת כספית היא זמינה). אם הכדאיות נראית לא כל כך גבוהה, זה עשוי להיות מועיל כדי להשתמש בצבע כדאיות, כגון 7-אמינו-אקטינומיצין D, לפני רכישת התא בcytometer הזרימה ולהוסיף צעד gating נוסף בanalysהוא להוציא תאי nonviable.
במחלות של מערכת העצבים המרכזית אוטואימוניות, נוגדנים שנקשרים לתחומים תאיים של אנטיגנים מוח נחשבים 2,3,7,13,14 פתוגניים, ולכן דגש הוא על זיהוי של נוגדנים תוך שימוש בתאים חיים וnonpermeabilized. פרוטוקול זה משיג מטרה זו על ידי שימוש בתאי transfected מבטא אנטיגנים על פני שטח. לכן, היצוא הנכון של האנטיגנים הללו אל פני השטח צריך להיקבע על ידי הצביעה של תאי transfected עם דילולים סדרתי של נוגדן ראשוני מסחרי כנגד אנטיגן של עניין. כאשר מעריכים את רמת ביטוי של אנטיגן פני השטח על תאי nonpermeabilized, זה הכרחי להשתמש בנוגדן מיקוד epitope תאי של החלבון. אם נוגדן ספציפי אינו זמין, ייתכן שיהיה צורך להוסיף לו תווית בתחום תאי של אנטיגן, ולאחר מכן להשתמש בנוגדן מסחרי נגד התג לקבוע ביטוי על פני השטח. יש לנו בהצלחההשתמשתי בגישה זו באמצעות D2R מתויג hemagglutinin ולשלול immunoreactivity של סרה מטופל לתג עצמו 11. זה גם קריטי, כי כל רצף cDNA של אנטיגן של ריבית subcloned לתוך וקטור מתאים, כך שהביטוי ושלמות מבנית בקרום התא לא נפגעים. ואכן, זה כבר הראה בעבר כי תחומים מסוימים של חלבון קולטן חיוניים לקיפול, יצוא, ושילוב הנכונים לתוך קרום התא 18.
בcytometry זרימת מבחני מבוססי תאים, הערכה חיובי נוגדן של סרה מטופל בכל ניסוי מסתמכת על קביעת סף, או הפסקת, שנגזרה מקבוצה של פקדים. Zhou et al. 19 מחושבים סף של חיוביות נוגדנים על ידי הוספת שתי סטיות תקן מעל לעוצמת הקרינה Δmedian הממוצעת, וזה כ תואם את 95 אחוזון ה של טווח השליטה בריא. בתוךהמחקרים הקודמים שלנו, בחרו בחיתוך גבוה יותר (תוספת של שלוש סטיות תקן לMFI הממוצע Δ של קבוצת הביקורת), אשר תואם את 99 אחוזון ה של טווח שליטה בריא 11,20. בנוסף, מקלפלין ואח'. 16 בחר לבטא את מדידת תגובתיות נוגדן ספציפית כיחס MFI בין תאי מבטאי אנטיגן ותאי אנטיגן שלילי. יחס של יותר מ 5 נחשב חיובי ותואם את שלוש סטיות תקן מעל ממוצע יחס של בקרות, שהוא דומה לעבודה שלנו. שימוש בסף גבוה יותר מגביר את החומרה של הפרוטוקול ומשפר את האפליה בין בקרות וחולים חיוביים לנוגדנים. חשוב מכך, בניסיון שלנו, תגובתיות הנוגדנים של טווח השליטה בריא לא היו שונות באופן משמעותי ממגוון OND, המאפשרות השימוש בשני האוכלוסייה לcalculatדואר הסף של חיוביות נוגדן 11,20.
כמו בכל ניסויי המחקר, שחזור נתונים הוא בעל חשיבות עליונה. סרה חולה נחשבת חיובית לנוגדנים כנגד אנטיגן העצבי ספציפי אם הם מעל הסף של חיוביות בלפחות שתיים מתוך שלושה ניסויים בלתי תלויים. חולים בודדים יש ריכוזים שונים של IgG בסרום שלהם. יכולה להיות וריאציות אלה השפעה על רמת נוגדנים מחייבים, ביחס לחולים אחרים. כל Sera המטופל השתמש במחקר הקודם שלנו נמדד על ידי nephelometry ונמצא בטווח התקין (6.2-14.4 גר '/ ל') 11, ואנחנו תמיד בדילול סרה עם אותו הגורם לדילול. הקמת עקומת כייל של סרום בודד עשויה להיות מועילה כדי להשוות ריכוזים של נוגדנים בין חולים. בנוסף, מסנוור ראשוני של החוקר מומלץ במהלך assay מבוסס תאים, אבל פקדים צריכים להיות עיוורים ועל מנת לחשב להניחסף ivity.
כאשר יעד נוגדן מתקבל על הדעת נמצא, נדרש אימות מתאימה כדי למנוע חיובי כוזב. דגימות נוגדנים חיוביים או שליליים שאותרו באמצעות cytometry הזרימה מבוסס assay תא צריכים להיות assayed באמצעות מתודולוגיה חלופית שהייתי מעדיף לא לנצל אנטיגנים מפוגלים או לינארית. לדוגמא, ירידה בimmunoreactivity על חלקים במוח מבעלי החיים עקום החוצה אנטיגן הספציפי הוכח בהצלחה במקרה של כמה CNS-דיווח חדש autoantigens 9-11,21. Immunoabsorption של סרה מטופל בתאים המבטא אנטיגן יש גם שימש כדי לאמת את תוצאות 9,11.
Cytometry זרימת פרוטוקול assay מבוסס תאים המתוארים במאמר זה ניתן לשנות בקלות להעריך סגוליות נוגדן למספר רב של מטרות אנטיגני שונות, כוללים אלה שנמצאו מחוץ למערכת העצבים המרכזית. סביר להניח כי נוגדנים של ספציפיות ידועות אחרות קיימים והם עדיין לאזוהה. יתר על כן, טכניקה זו מתאימה לאיתור סוגים שונים ותת מחלקות של איג, כוללים IgM, כפי שמוצג במחקרים הקודמים שלנו 11,20. הקביעה תת IgG יכולה גם לחשוף את הפוטנציאל לתרום להיווצרות מחלה. לדוגמא IgG1 או IgG3 מסוגל לתווך cytotoxicity תא בתיווך נוגדנים תלויים או משלים תלוי cytotoxicity, אשר דיווחו מנגנוני פתוגניות-Induced autoantibody 14,20,22. צבעי ניאון אחרים מאשר AF647 (אדום רחוק) עשויים גם להיות מנוצלים, כל עוד יש להם פסגות פליטה רחוקה מספיק מזה של מולקולת הכתב, ה-GFP. כל ספקטרום פליטה חייב להיות חופף לדרישות הפיצוי הנכונות. קביעת הספציפיות של נוגדן לחלבון תאיים תהיה אפשרית גם באמצעות cytometry זרימה, אם כי, תאים ראשון צריכה להיות קבועים וpermeabilized לעשות אנטיגן זמין לנוגדן מחייב. טכניקה חלופית זה יכול לגרום גבוה background עקב החשיפה של נוגדנים לתחומים תאיים כמו גם אנטיגנים סלולריים רבים, שהוסתרו בדרך אחרת בתאי nonpermeabilized חיים. גורמים מבלבלים אלו עלולים לצמצם את כוחו של cytometry הזרימה assay מבוסס תאים ובקרות מתאימות יש לבצע בהתאם.
השימוש בזרימת תפוקה גבוהה cytometry assay מבוסס תאים מספקת שיטה אמינה ומדויקת לגילוי הנוגדנים בנסיוב אדם מקבוצות גדולות של חולים. גילוי נוגדני רומן נוספים באמצעות טכניקה זו יעזור לי אבחון וטיפולים עתידיים של חולים במחלות של מערכת העצבים המרכזית אוטואימוניות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניגוד עניינים: פטנט הוגש על ידי FB וRCD (אוניברסיטת סידני) בטענה D2R כמטרה לנוגדנים עצמיים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה האוסטרלית הלאומית לבריאות והמחקר רפואי, קרן סטאר סיינטיפיק (אוסטרליה), תסמונת טורט האגודה (ארה"ב), הטרשת הנפוצה טריש קרן מחקר והטרשת הנפוצה אוסטרליה מחקר, קרן Petre (אוסטרליה), ל 'רבקה קרן קופר למחקר רפואית (אוסטרליה). אנו מודים לכל חולים ובני משפחה שסיפקו דגימות למחקר שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
