Summary
Under de senaste åren har levande cellbaserade analyser använts framgångsrikt för att påvisa antikroppar mot ytan och konforma antigener. Här beskriver vi en metod som använder hög genomströmning flödescytometri möjliggör analys av stora grupper av patienter. Upptäckt av nya antikroppar kommer att förbättra diagnos och behandling av immunmedierade sjukdomar.
Abstract
Under de senaste åren har antikroppar mot ytan och konforma proteiner involverade i neurotransmission upptäckts i autoimmuna CNS-sjukdomar hos barn och vuxna. Dessa antikroppar har använts för att vägleda diagnos och behandling. Cellbaserade analyser har förbättrad detektion av antikroppar i patientserum. De är baserade på ytexpressionen av hjärn antigener på eukaryota celler, som sedan inkuberades med utspätt patientserum följt av fluorokromkonjugerade sekundära antikroppar. Efter tvättning sekundär antikropp-bindning analyserades sedan genom flödescytometri. Vår grupp har utvecklat en hög genomströmning flödescytometri levande cellbaserad analys för att tillförlitligt påvisa antikroppar mot specifika neurotransmittorreceptorer. Denna flödescytometri metod är rakt fram, kvantitativt, effektiv, och användningen av en hög genomströmning provtagaren systemet tillåter för stora patientgrupper för att lätt analyseras på en kort tid. Dessutom, denna cellbaserade somsäger kan enkelt anpassas för att påvisa antikroppar mot flera olika antigena mål, både från det centrala nervsystemet och periferin. Upptäcka ytterligare biomarkörer roman antikropps möjliggör snabb och korrekt diagnos och förbättra behandlingen av immunmedierade sjukdomar.
Introduction
Under de senaste åren har autoimmuna former av centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar identifierats. Det har visats att dessa sjukdomar är associerade och definieras av närvaron av autoantikroppar. Dessa antikroppar binder till neuronala receptorer eller synaptiska proteiner involverade i neurotransmission 1,2. Olika antigener har detekterats, såsom N-metyl-D-aspartat-receptorn (NMDAR) 3-5, γ-aminosmörsyra B-receptorn (GABA-B)-receptor 6, α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4- isoxazolpropionsyra (AMPA)-receptorn 7, spänningskänsliga kaliumkanal (VGKC) associerade proteiner: leucin-rika gliom aktiverad ett protein (LGL-1) och contactin-associerat protein 2 (capsr2) 8,9, glutamatreceptor 5,10 och dopamin-2-receptor (D2R) 11. Förr i tiden, dessa autoimmuna sjukdomar i centrala nervsystemet (främst kallade hjärninflammation) var ofta odiagnostiserade och obehandlade. Dessa nya biomarkörer antikroppar, t.ex.NMDAR antikropp eller D2R antikropp, har avsevärt förbättrats diagnos och medvetenhet, och har öppnat behandlingsalternativ för patienter. Faktum är tidig behandling med immunterapi i samband med förbättrat resultat 11,12.
Traditionella metoder för att detektera antikroppar, såsom enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) och Western blot har använts för detektion av antikroppar i sera. Men de inte med lätthet kunna erkännas av extracellulära eller yt-epitoper och snarare kan avslöja immunreaktivitet mot en intracellulär epitop. Dessutom kan antikroppar som binder till den extracellulära domänen av viktiga proteiner som är involverade i neurotransmission kommer sannolikt att vara patogent 2,3,7,13,14. Därför är utvecklingen av exakta och känsliga analyser för att upptäcka relevanta cellytan eller extracellulära antikropps mål i patienterna av största vikt. Guldet standardmetod inom området är baserad på användningen av levande celler, i så kallade "cell-based analyser ". Detta förfarande innefattar expression av ett antigen på ytan av däggdjursceller (oftast humana embryonala njur-293 (HEK293)-celler) i sin nativa form genom transfektion av vektorer innehållande den fullständiga cDNA-sekvensen för antigenet av intresse. Levande nonpermeabilized Cellerna inkuberas sedan med utspätt patientserum och följt av fluorokrom-konjugerad anti-human-immunoglobulin (Ig) sekundär antikropp. Intensiteten eller nivån av fluorescens detekteras sedan och är associerad till nivån av autoantikroppsbindning. Denna teknik är specifik, eftersom endast ett antigen överuttrycks i celler. Den mest använda "read-out" har varit konfokalmikroskopi analys efter immunocytokemi 4,5,8-10. Emellertid flödescytometri cellbaserade analyser har med framgång använts för att detektera antikroppar i patienter med demyeliniseringssjukdomar 15-17. Särskilt Waters et al. 15 jämfört påvisande av antikroppar med användning av en pannael av antikroppsdetekteringsmetoder, inklusive cell-baserade analyser, följt av mikroskopi eller flödescytometri analyser, och har visat flödescytometri cellbaserad analys för att vara den mest känsliga, exakt och tillförlitlig metod. Därför är flödescytometri cellbaserad analys fördelaktigt eftersom det är kvantitativ, inte utredare beroende, och innebär inte någon användning av radioaktiva material. Det är också praktiskt eftersom det tillåter stora patientgrupper som skall analyseras på en kort tid.
På senare tid har vi optimerat en hög genomströmning flödescytometri cellbaserad analys för att upptäcka NMDAR antikropp och D2R antikroppar hos patienter med autoimmuna CNS-sjukdomar 11. Vår grupp detekterades nyligen NMDAR antikropp i patientserum med användning av flödescytometri cellbaserad analys. Dessa NMDAR antikroppspositiva sera tidigare analyserades med användning av konfokalmikroskopi och befanns även vara positiv 11. Detta protokoll beskriver en flödescytometri cellbaserad analys för detektion av Conformation känsliga CNS-antikroppar i patientserum som använder en automatiserad hög genomströmning sampler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Subkloning strategi för att konstruera pIRES2-EGFP Vector Encoding D2R eller NMDAR
- Skaffa fullängds cDNA-klon av mänsklig D2R eller NMDAR subenhet 1 (NR1).
- Välj en expressionsvektor, såsom pIRES2-EGFP, vilken är lämplig för uttryck av transmembranproteiner med en förbättrad grönt fluorescerande protein (GFP) reporter under styrning av en intern ingångsställe ribosom (IRES) så att både antigener och GFP som skall samuttrycks i celler separat.
- Subklona mänskliga cDNA inom pIRES2-EGFP vektor.
- För att subklona cDNA, använda lämpliga restriktionsenzymer (t ex Nhel och Xhol för mänsklig D2R cDNA).
- Ligate snitt cDNA sätter inom begränsade pIRES2-EGFP vektor.
- Sekvens ligerade pIRES2-EGFP D2R eller NMDAR vektor för att kontrollera om vektorn innehåller rätt ordning.
- Rena och förstärka pIRES2-EGFP D2R eller NMDAR vektor för senare användning i transfektion.
- Kultur HEK293-celler i vävnadsodlingskolvar med färskt Dulbeccos Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) komplett med 4,5 g / L D-glukos, L-glutamin och 110 mg / L natriumpyruvat kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM GlutaMAX, och 50 | ig / ml gentamicin.
- Drag av HEK293-celler med användning av trypsin och överför till en konisk tub.
- Tvätta genom att centrifugera celler vid 250 xg under 6 min och resuspendera cellpelleten i färskt komplett DMEM.
- Räkna celler och frö från 6 brunnar vid cirka 8 x 10 5 celler / brunn och kultur över natt i 2 ml DMEM vid 37 ° C och 5% CO2 i en inkubator.
- När de har nått ca 70% konfluens, transfektera HEK293 celler med pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + celler), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + celler), och pIRES2-EGFP (HEK293 CTL-celler, vektorstyrning) enligt följande.Håll några otransfekterade HEK293 celler för ersättning senare.
- Förbered erforderlig volym transfektion blandning innefattande 2,5 | ig DNA, 200 | il 0,9% natriumklorid och 4 | ig / ml polyetylenimin / brunn (vardera innehållande 2 ml färskt komplett DMEM).
- Omedelbart virvel blanda i 10 sekunder och inkubera vid rumstemperatur (RT) i 10 minuter, innan du lägger till volym transfektion mix till lämpliga brunnar.
- Täck plattan, vira sidorna med Parafilm, och centrifugera vid 280 xg under 5 min för att underlätta cell transfektion.
- Avlägsna Parafilm och placera den sedan i inkubatorn till kulturen vid 37 ° C.
- Byt odlingsmedia 18 timmar senare med färsk komplett DMEM, och underhålla i kultur för ytterligare 72 timmar.
- Valfritt: 72 h efter transfektion, kan transfekterade celler selekteras genom odling i komplett DMEM kompletterat med 250 | ig / ml geneticin, i syfte att erhålla en polyklonal stabil transfektant.
- Drag av HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + och HEK293 CTL-celler genom inkubering med 500 | il / brunn Versene för cirka 5 minuter vid 37 ° C.
- Resuspendera i 2ml/well PBS (-Ca2 + /-Mg 2 +) kompletterat med 2% FBS (PBS / FBS) och överför till en 15 ml eller 50 ml koniska rör.
- Tvätta cellerna genom centrifugering vid 250 xg under 6 min och resuspendera cellpelleten i 15 till 50 ml PBS / FBS. Upprepa tvätta 2x.
- Räkna celler och återsuspendera i PBS / FBS vid 1 x 10 6 celler / ml.
- Utforma 96-brunnars mall för flödescytometri förvärv, med tanke på att HEK293 D2R + eller HEK293 NMDAR ^-celler, såväl som HEK293 CTL-celler kommer att inkuberas med varje patientprov eller primär antikropp.
- Seed celler i en V-botten 96-brunnars platta vid 50000 celler / vill enligt flödescytometri förvärv mall.
- Pelletera cellerna genom centrifugering av 96-brunnsplatta vid 450 xg under 5 min och försiktigt avlägsna supernatanten med hjälp av ett elektroniskt eller manuellt multikanalpipett, luta plattan på en vinkel och se till att inte aspirera cellpelleten.
- Inkubera HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR + och HEK293 CTL-celler under en timme vid rumstemperatur i mörker med:
- Serieutspädningar av primär antikropp för att kunna bedöma antigen ytexpression.
- Patientprover för att upptäcka antikroppar.
- Använd lämplig flödescytometri kontroller ersättning, till exempel. ofärgade otransfekterade HEK293-celler, GFP + HEK293-celler (AF647 -) och icke-transfekterade AF647 + HEK293-celler (GFP).
- Tvätta cellerna genom centrifugering vid 450 x g under 5 min och resuspendera cellpelleten i 170 | il PBS / FBS. Upprepa tvättningen två gånger.
- Inkubera cellerna under 1 hr vid RT i mörker med 1:100 utspädning av AF647-konjugerad sekundär antikropp (anti-humant IgG för patientserum och anti-mus IgG för anti-NR1-eller anti-D2R primära antikroppar).
- Tvätta cellerna tre gånger, såsom i steg 3.7, och återsuspendera i 35 | il PBS / FBS för flödescytometri cell förvärvet.
- Ställ in high-throughput provtagaren (HTS) på flödescytometern (BDLSRII).
- Skaffa 10.000 evenemang / väl enligt flödescytometri förvärvs mall.
- Exportera och sedan analysera data för analys med hjälp av en flödescytometri programpaket, t.ex. FlowJo v7.5:
- Först gate levande HEK293 celler baserat på framåt (storlek) och sida (kornighet) skingrar.
- Ytterligare gate levande HEK293-celler baserat på hög GFP-positivitet för att analysera endast de transfekterade cellerna.
- Bestäm den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) av AF647 kanal inom den levande GFP-positiva celler.
- Exportera data till Excel eller Prism för analys:
- Plot concentrations av primär antikropp (anti-NMDAR eller anti-D2R antikropp) versus MFI erhållits från celler som inkuberats med dessa antikroppar.
- För varje patient och kontrollprov, fastställa vilken ΔMFI genom subtraktion av MFI av de HEK293 CTL-celler från MFI av HEK293 D2R + eller HEK293 NMDAR +-celler, respektive.
- Beräkna tröskeln antikroppspositivitet genom tillsats tre standardavvikelser över medelvärdet ΔMFI hos styr kohorten.
- Rita individuella prover grupperade enligt deras serum typ på en graf och representerar tröskeln som en linje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live HEK293 D2R + och HEK293 CTL-celler förvärvades i flödescytometer använda en hög genomströmning sampler. Under analysen cellerna gated baserat på framåtspridning (storlek) och sidospridning (finjustering) parametrar (figur 1A och 1D). Transfekterade HEK293-celler som uttryckte en reportermolekyl, GFP, i cytoplasman, och otransfekterade celler uteslöts från analys (figurerna 1B och 1E). Inom GFP + grinden, var MFI samband med AF647-konjugerat anti-humant IgG sekundär antikroppsbindning mätas (figur 1C och 1F). För att eliminera den bakgrundsfluorescens vid analys av humansera var ΔMFI beräknades genom subtraktion av MFI av de HEK293 CTL-celler från MFI av de HEK293 D2R +-celler (Figur 1G). Data som visas är representativt för analys D2R antikropp, ochsamma gating strategi och dataanalys kan användas för NMDAR antikroppsdetektering (data visas ej).
Påvisande av antikroppar genom flödescytometri cellbaserad analys är baserad på cellytan uttryck av antigenet av intresse. Såsom visas i figur 2, HEK293 NMDAR +-celler i hög grad uttryckt yta NMDAR (Figur 2A) och HEK293 D2R +-celler i hög grad uttryckt yta D2R (figur 2B), medan HEK293 CTL-celler uttryckte ingen av dessa antigener (fig. 2A och 2B).
De patientgrupper som används i detta arbete bestod av en patient cohort med NMDAR encefalit (NMDAR Enc, n = 4, en encefalit definieras genom detektering av ytan NMDAR-subenhet en NR1-antikropp 3), D2R antikropp-associerad encefalit (D2R Enc, n = 6, en encefalit definieras genom detektering av ytan D2R antikropp 11), och en styr kohort with andra icke-inflammatoriska neurologiska sjukdomar (OND, n = 26), såsom epilepsi, stroke, och utvecklingsmässiga eller neurodegenerativa sjukdomar. Patientprover har tidigare validerat för NMDAR 5 och D2R 11 IgG positivitet. De fyra patienter som var positiva för NMDAR antikroppar hade en typisk kliniska syndromet NMDAR encefalit såsom beskrivits 3 och serumprover visat sig vara positiva vid användning av cell-baserade analyser för NMDAR antikroppar såsom beskrivits och finns i kommersiell användning 3,4. De sex patienter positiva för D2R antikroppar hade ett typiskt kliniskt syndrom av basala ganglierna encefalit som beskrivs 11, och serumprover visat positivt för D2R antikroppar med hjälp av D2R knock-out hjärnan sektioner, transfekterade celler och neuroner 11.
För att avgöra antikroppspositivitet patienter, var tröskeln, eller cutoff, av antikroppspositivitet beräknas i varje experiment genom att lägga till tre standardavvikelser överbetyda ΔMFI av OND kontroller. De 4/4 patienter med NMDAR Enc bekräftades positivt för humant yta NMDAR IgG-antikropp (Figur 3A), medan 6/6 patienter med D2R Enc var positiva för human yta D2R-IgG-antikropp (Figur 3B). Ingen av de positiva patienterna var dubbelt positiva för antikroppar riktade NMDAR och D2R. NMDAR och D2R antikroppar inte registreras i någon av OND kontroller analyserade (fig. 3A och 3B). Patientprover ansågs positiva om de var över tröskelvärdet i åtminstone två av tre upprepade experiment.
Figur 1. Detektering av antikropp genom hög genomströmning flödescytometri cellbaserad analys. Gating strategi och dataanalys Liv e HEK293 CTL-celler och HEK293 D2R + stabila transfektanter gated baserat på framåtspridning (FSC) och sidospridning (SSC) (74,7% och 68,5%, respektive, A, D). GFP-positiva celler i HEK293 CTL och HEK293 D2R +-celler (32,8% och 95,4%, respektive, B, E) fram ytterligare gated att utesluta icke-transfekterade GFP - celler (67,2% och 4,6%, respektive, B, E). Inom de GFP + celler, den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) som är associerad med AF647-konjugerad anti-human IgG sekundär antikropp (HEK293 CTL = 3657; HEK293 D2R + = 9128) mättes (C, F). För humana prover, var ΔMFI beräknades genom subtraktion av MFI av de HEK293 CTL-celler från de HEK293 D2R +-celler (G). Representativa data för D2R detektionsantikropp visas. ank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Expression av ytan NMDAR och D2R bestämdes genom high-throughput flödescytometri cellbaserad analys. HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B) och HEK293-CTL-celler färgades med seriespädningar av primär antikropp, följd av lämplig sekundär antikropp. Hög yta uttryck för NMDAR och D2R observerades. MFI-värden korrelerade med antikroppstiter som de ökade stadigt med ökande koncentrationer av primär antikropp. Som väntat fanns det ingen detektering av ytan NMDAR eller D2R i HEK293 CTL-celler. Representativa data visas.blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 3. Bekräftat upptäckt av ytan NMDAR och D2R antikroppar i en kohort av patienter. Sera från NMDAR encefalit (NMDAR Enc, n = 4), D2R antikropp-associerad encefalit (D2R Enc, n = 6) patienter eller kontroller med andra neurologiska sjukdomar (OND , n = 26 eller 24) inkuberades med levande HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + och HEK293 CTL-celler, följt av AF647-konjugerad anti-human IgG sekundär antikropp. Ytans NMDAR och D2R antikroppar detekterades i serum hos 4/4 NMDAR Enc patienter (A) och 6/6 D2R Enc patienter (B), respektive, medan ingen av de OND kontrollerna (0/26 eller 0/24) hade antingen antikropp (A, B). Dotted linjer på grafer representerar positivitet tröskeln beräknas genom att lägga tre standardavvikelser för medelvärdet ΔMFI av OND kontroller. Representativa punktdiagram av tre experiment visas. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument beskriver en ny tillämpning av flödescytometri levande cellbaserad analys för att påvisa antikroppar riktade mot specifika cellytan neuronala proteiner med hjälp av en hög genomströmning sampler. Med denna teknik, rapporterar vi att en undergrupp av patienter som drabbats med autoimmuna CNS-sjukdomar har serumantikroppar till ytan NMDAR eller till ytan D2R.
Viktiga steg för optimal detektionsantikropp använder denna hög genomströmning flödescytometri levande cellbaserad analys innefattar 1) att få en hög avkastning av friska transfekterade celler, 2) kontrollera hög cellytan uttryck av antigen av intresse, 3) om inrättande av en tröskel av antikropp positivitet med hjälp av en kohort av kontroller, 4) och bekräftar reproducerbarhet av data.
Odlingen av friska celler är grundläggande för framgång med denna teknik. HEK293-celler är väl kända för deras enkel kultur, hög transfektionseffektivitet och deras brist på expression av neuronalproteiner, vilket är varför de har varit vanligt förekommande i cellbaserade analyser för att påvisa antikroppar mot specifika neuronala antigen 4,5,8-10. En optimal transfektion hastigheten för att få en hög procent av levande GFP + celler är kritisk för denna analys för att noggrant beräkna MFI. Därför producerar en polyklonal stabil cellinje av GFP + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + eller HEK293 CTL-celler är fördelaktigt eftersom det ger en jämn och hög nivå av GFP + celler, med den fördelen av att inte behöva upprepade transfektera celler före varje experiment. En snabb visning av de transfekterade cellerna genom ett inverterat mikroskop rekommenderas att kontrollera för friska celler (GFP + celler kommer fluorescerar om kvicksilverlampa är tillgängligt). Om lönsamheten verkar inte så hög, kan det vara fördelaktigt att använda en livskraft färgämne, såsom 7-amino-aktinomycin D, innan cell förvärv på flödescytometern och lägga till en extra gating steg i analysär att utesluta icke-livsdugliga celler.
Vid autoimmuna sjukdomar i CNS, är antikroppar som binder till extracellulära domäner av hjärn antigener tros vara patogena 2,3,7,13,14, därför vikt läggs vid detektion av antikroppar med hjälp av levande och nonpermeabilized celler. Detta protokoll uppnår detta mål genom att använda transfekterade celler som uttrycker ytantigener. Därför måste den korrekta export av dessa antigen som den yta som skall bestämmas genom färgning av transfekterade celler med seriespädningar av en kommersiell primär antikropp mot antigenet av intresse. Vid bedömning av nivån av uttryck av ytantigen på nonpermeabilized celler är det väsentligt att använda en antikropp som riktar en extracellulär epitop av proteinet. Om en specifik antikropp inte är tillgänglig, kan det vara nödvändigt att lägga till en tagg på en extracellulär domän av antigenet, och därefter använda en kommersiell antikropp mot etiketten för att bestämma ytexpression. Vi har med framgånganvänt denna metod med hjälp av en hemagglutinin-taggad D2R och uteslutit immunreaktivitet av patientsera till taggen själv 11. Det är även kritiskt att hela cDNA-sekvensen för antigenet av intresse subklonas in i en lämplig vektor så att expression och strukturell integritet vid cellmembranet inte äventyras. I själva verket har det tidigare visat att vissa domäner av ett receptorprotein är väsentliga för korrekt veckning, export, och integration i cellmembranet 18.
I flödescytometri cellbaserade analyser, bedöma antikroppspositivitet av patientserum i varje experiment bygger på inrättande av en tröskel, eller cutoff, som härrör från en kohort av kontroller. Zhou et al. 19 beräknas ett tröskelvärde på antikroppspositivitet genom tillsats av två standardavvikelser över medelvärdet Δmedian fluorescensintensitet, och ungefär denna motsvarade de 95: e percentilen av den friska kontrollintervallet. Ivåra tidigare studier, valde vi en högre cutoff (tillägg av tre standardavvikelser till medelvärdet Δ MFI för kontroll kohorten), vilket motsvarade de 99: e percentilen av den friska kontrollområde 11,20. Dessutom al. McLaughlin et 16 valde att uttrycka mätning av specifik antikroppsreaktivitet som förhållandet MFI mellan de antigenuttryckande celler och antigennegativa celler. Ett förhållande som är större än 5 ansågs positiva och motsvarade tre standardavvikelser över medelvärdet av kvoten av manöverorgan, som liknar vårt arbete. Med hjälp av en högre tröskel ökar stringensen av protokollet och förbättrar diskriminering mellan kontroller och patienter positiva för antikroppar. Viktigt är, enligt vår erfarenhet, var antikroppen reaktiviteten hos den friska kontrollintervall inte signifikant annorlunda än den OND intervall, vilket möjliggör användning av antingen befolkningen att Calculate tröskeln till antikroppspositivitet 11,20.
Som i alla forskningsexperiment, är reproducerbarhet uppgifter av största vikt. Patientsera betraktas som positiva för antikroppar mot en specifik neuronal antigen om de är över tröskeln till positivitet i åtminstone två av tre oberoende försök. Enskilda patienter har varierande koncentrationer av IgG i deras serum. Dessa variationer kan ha en inverkan på nivån av antikroppsbindning, i förhållande till andra patienter. Alla patientsera som används i vår tidigare studie mättes genom nefelometri och befanns vara inom det normala intervallet (6,2 till 14,4 g / L) 11, och vi alltid utspätt serum med samma spädningsfaktorn. Etablera en titer kurva för individuellt serum kan vara fördelaktig för att jämföra koncentrationerna av antikroppar mellan patienter. Dessutom är initial bländning av utredaren rekommenderas under cellbaserad analys, men kontrollerna måste avblindas i syfte att beräkna den positivity tröskelvärde.
När en rimlig målantikropp hittas, lämplig validering krävs för att förhindra falsk positivitet. Antikroppspositiva eller-negativa prover som upptäcks med hjälp av flödescytometri cellbaserad analys bör analyseras med hjälp av en alternativ metod som företrädesvis skulle använda denaturerade eller linjäriserade antigener. Till exempel minskade immunreaktivitet på hjärnan sektioner från antigenspecifika knock-out djur har framgångsrikt visat i fallet med flera nyligen rapporterade CNS autoantigener 9-11,21. Immunabsorption av patientsera på antigen-uttryckande celler har också använts för att validera resultat 9,11.
Den flödescytometri cellbaserade analysprotokoll beskrivs i detta dokument kan lätt ändras för att utvärdera antikroppspecificitet till en mängd olika antigena mål, inklusive de som finns utanför CNS. Det är troligt att antikroppar av andra okända särdrag finns och är ännu inteidentifieras. Dessutom är denna teknik lämpar sig för att upptäcka olika klasser och underklasser av Ig, inklusive IgM, som visas i våra tidigare studier 11,20. Bestämningen av IgG-subklass kan också avslöja möjligheter att bidra till sjukdoms patogenes. Exempelvis IgG1 eller IgG3 kan förmedla antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet eller komplementberoende cytotoxicitet, som redovisas autoantikropps-inducerad patogenicitet mekanismerna 14,20,22. Förutom AF647 (långt röd) Fluorescerande färgämnen kan också användas så länge som de har emissionstoppar tillräckligt långt från det av reportermolekylen, GFP. Alla överlappande emissionsspektra måste ha rätt kompensationskrav. Fastställande av specificiteten hos en antikropp till ett intracellulärt protein skulle också vara möjligt med hjälp av flödescytometri, även om cellerna måste först fastställas och permeabiliseras att göra det antigen som finns tillgänglig för antikroppsbindning. Denna alternativa teknik kan resultera i hög background på grund av exponering av antikroppar mot intracellulära domäner samt ett stort antal cellulära antigener, som annars var dolda i levande nonpermeabilized celler. Dessa felkällor kan minska styrkan i flödescytometri cellbaserad analys och lämpliga kontroller måste utföras i enlighet med detta.
Användningen av hög genomströmning flödescytometri cellbaserad analys ger en pålitlig och exakt metod för detektion av antikroppar i humant serum från stora grupper av patienter. Upptäcka ytterligare nya antikroppar genom denna teknik kommer att bidra till diagnos och framtida behandlingar av patienter med autoimmuna CNS-sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Jäv: En patentansökan har lämnats in av FB och RCD (University of Sydney) hävdar D2R som mål för autoantikroppar.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den australiska nationella hälso-och medicinska forskningsrådet, Star Scientific Foundation (Australien), Tourettes syndrom Association (USA), The Trish Multipel skleros Research Foundation och multipel skleros Research Australien, Petre Foundation (Australien), den Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australien). Vi tackar alla de patienter och anhöriga som lämnat prover för vår studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
