Summary
在最近几年，活细胞检测已被成功地用于检测抗体的表面和构象的抗原。在这里，我们利用高通量流式细胞仪使的患者大样本的分析描述的方法。检测新抗体将提高诊断的免疫介导的病症和治疗。
Abstract
在最近几年，抗表面和参与神经传递构象的蛋白已在儿童和成人自体免疫CNS疾病检测。这些抗体已被用于指导诊断和治疗。基于细胞的测定具有改善的抗体在患者血清中的检测。它们是基于大脑的抗原上的真核细胞中，然后将其用稀病人血清随后荧光标记的二抗温育的表面表达。洗涤后，将二级抗体结合通过流式细胞术，然后进行分析。我们的小组已经开发出一种高通量流式细胞仪活细胞为基础的检测可靠地检测抗体的特异性神经递质受体。这种流式细胞仪的方法是直接的，定量的，高效的，并且使用高通量采样系统允许大量患者组可以很容易地测定在很短的时间空间。此外，这种细胞系作为说可以容易地适用于检测抗体，以许多不同的抗原靶，无论是从中枢神经系统和外周。发现更多的新型抗体的生物标志物，使迅速和准确的诊断和提高治疗免疫介导的疾病。
Introduction
近年来，中枢神经系统（CNS）疾病的自身免疫性形式也已确定。它已经表明，这些疾病相关联，并且由自身抗体的存在来定义。这些抗体结合到神经元的受体或参与神经传递1,2突触蛋白。不同的抗原已被检测到，如N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）3-5，γ-氨基丁酸B受体（GABA B）受体6，α-氨基-3 -羟基-5 -甲基-4 -异唑丙酸（AMPA）受体7，电压-门控钾通道（VGKC）相关的蛋白质：富含亮氨酸胶质瘤活化蛋白1（LGL-1）和contactin相关蛋白2（capsr2）8,9，谷氨酸受体5,10和多巴胺-2受体（D2R）11。在过去，这些自身免疫CNS障碍（主要是所谓的脑炎）往往确诊和治疗。这些新型抗体的生物标志物， 如：NMDA受体抗体或抗体D2R，大幅提高了诊断和认识，并已打开患者的治疗方案。事实上，随着免疫治疗早期治疗与改善预后11,12关联。
传统的方法来检测抗体，如酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫印迹实验已用于检测血清中的抗体。然而，他们不容易使识别的细胞外或表面抗原决定簇和，相反，可能揭示免疫反应对细胞内抗原决定簇。此外，结合到所涉及的神经传递相关的重要蛋白质的胞外域的抗体很可能是致病2,3,7,13,14。因此，准确和灵敏的分析方法的发展，以发现相关的细胞表面或细胞外的患者抗体的目标是至关重要的。在该领域的金标准方法是基于使用活细胞，在所谓的“细胞巴sed的分析“。此方法涉及一种抗原的表达在哺乳动物细胞（最经常的人胚肾293（HEK293）细胞）中的天然形式由含有感兴趣抗原的完整cDNA序列的载体转染的表面上。然后活nonpermeabilized细胞与稀释的患者血清和随后的荧光染料标记的抗人免疫球蛋白（Ig）的第二抗体。荧光的强度或电平然后检测并关联到自身抗体结合的程度。这种技术是特定的，因为只有一种抗原的过度表达在细胞中。最广泛使用的“读出”已经经过免疫4,5,8-10共聚焦显微镜分析。然而，流式细胞术基于细胞的测定法已成功地用于检测抗体的患者的脱髓鞘疾病15-17。特别是，水等 15相比抗体的检测用锅的抗体的检测技术，包括基于细胞的测定接着显微镜或流式细胞仪EL分析，并且已经示出流式细胞仪的基于细胞的测定法是最灵敏，准确，可靠的方法。因此，流式细胞术基于细胞的测定是有利的，因为它是定量的，不研究者依赖性的，并且不涉及任何利用放射性物质。这也是方便，因为它允许较大的患者群在很短的时间量来测定。
最近，我们已进行了优化的高通量流式细胞术基于细胞的测定，以检测NMDA受体抗体和D2R抗体在自身免疫性疾病，中枢神经系统11。我们小组最近利用流式细胞仪细胞分析检测NMDA受体抗体在病人血清。这些NMDA受体抗体阳性血清，使用共聚焦显微镜分析的先前和也被发现是阳性11。这个协议概括了流式细胞术基于细胞的测定为C的检测onformation敏感的CNS抗体在患者血清中，利用一个自动化的高通量采样器。
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Protocol
1。亚克隆策略构建的pIRES2-EGFP载体编码D2R或NMDA受体
- 获得人类D2R或NMDA受体亚单位1（NR1）的全长cDNA克隆。
- 选择的表达载体，如质粒pIRES2-EGFP，这是适合于跨膜蛋白，具有增强的绿色荧光蛋白在内部核糖体进入位点（IRES）的控制（GFP）的报告，使两种抗原和GFP中被共表达的表达细胞分开。
- 内的pIRES2-EGFP载体亚克隆人cDNA。
- 亚克隆的cDNA，用适当的限制性内切酶（例如的NheI和XhoI人类D2R的cDNA）。
- 受限制的pIRES2-EGFP载体内结扎切断的cDNA插入。
- 序列连接的pIRES2-EGFP D2R或NMDA受体载体来检查向量是否包含正确的顺序。
- 净化和放大的pIRES2-EGFP D2R或NMDA受体载体转染后用。
- 培养HEK293细胞在组织培养瓶中用新鲜的Dulbecco改良的Eagle培养基（1X）（DMEM）中完全用4.5 g / L的D-葡萄糖，L-谷氨酰胺和110mg / L丙酮酸钠补加有10％胎牛血清（FBS）， 2毫米的GlutaMAX，和50微克/毫升庆大霉素。
- 用胰蛋白酶和转移到锥形管分离HEK293细胞。
- 通过在250×g离心6分钟离心细胞洗涤并重新悬浮在新鲜的完全DMEM培养液将细胞沉淀。
- 计数细胞和种子6孔板中在大约8×10 5个细胞/孔，并培养过夜2毫升的DMEM，在37℃和5％CO 2的培养箱中。
- 一旦它们达到约70％汇合时，转染的HEK293细胞与质粒pIRES2-EGFP NR1（HEK293 NMDAR +细胞），质粒pIRES2-EGFP D2R（HEK293 D2R +细胞）和质粒pIRES2-EGFP（HEK293 CTL细胞;矢量控制），如下所示。稍后继续对一些未转染的HEK293细胞进行赔偿。
- 制备转染混合物，其包含2.5微克的DNA中加入200μl0.9％的氯化钠和4微克/毫升的聚乙烯亚胺/孔（每含2ml新鲜的完全DMEM）中的所需的体积。
- 立即旋涡振荡混合10秒和孵化在室温（RT）10分钟，加入转染混合物的体积，以适当的井前。
- 覆盖板，敷用封口膜的两侧，并离心分离，在280×g离心5分钟，以帮助细胞转染。
- 除去封口膜，然后在孵化器的地方文化在37°C
- 18小时后用新鲜完全DMEM更换培养基，并在文化保持另外72小时。
- 可选：72小时转染后，转染的细胞可以通过培养在完全DMEM补充有250微克/毫升遗传霉素选择的，以便获得多克隆稳定转染。
- 分离HEK293 NMDAR +，HEK293 D2R +，和HEK293细胞的CTL孵育，用500μL/孔的Versene约5分钟，在37℃下
- 重悬在2ml/well的PBS（ -的Ca 2 + /-Mg 2 +的）补充有2％FBS（PBS / FBS）中，并转移到15毫升或50毫升的锥形试管中。
- 通过离心分离，在250×g离心6分钟洗涤细胞，重悬细胞沉淀在15-50毫升PBS / FBS中。重复洗2倍。
- 计数细胞，然后悬浮在PBS / FBS的以1×10 6细胞/ ml。
- 设计的96孔模板进行流式细胞术获取，考虑到HEK293 D2R +或HEK293 NMDAR +细胞，以及HEK293细胞的CTL将必须与每个患者样本或初级抗体一起温育。
- 种子细胞在V形底96孔板中以50,000细胞/我们LL根据流式细胞仪采集模板的流动。
- 通过离心96孔板中，在450×g离心5分钟，并轻轻地用电子或手动多道移液器除去上清液，于一角度倾斜板，并小心不要吸出细胞沉淀沉淀细胞。
- 培养HEK293 D2R +，HEK293 NMDAR +，和HEK293细胞的CTL 1小时在室温下与黑暗：
- 第一抗体，以评估抗原的表面表达的系列稀释。
- 为了检测抗体的患者样品。
- 使用适当的流式细胞仪检测补偿控制， 例如 。未染色的未转染的HEK293细胞中，GFP + HEK293细胞（AF647 - ）和未转染的AF647 + HEK293细胞（GFP）。
- 通过离心分离，在450×g离心5分钟，洗涤细胞，重悬细胞沉淀在170微升PBS / FBS中。重复洗涤步骤两次以上。
- 孵育细胞1小时R最快室温在黑暗中以1:100稀释AF647-标记的二抗（抗人IgG对患者血清和抗小鼠IgG抗-NR1或抗D2R初级抗体）。
- 洗涤细胞三次，如在步骤3.7，并重新悬浮于35微升PBS / FBS的流式细胞术细胞采集。
- 设置在流式细胞仪（BDLSRII）流动的高通量采样器（HTS）。
- 获得10,000个事件/孔根据流式细胞仪采集模板的流程。
- 导出，然后分析数据，使用流式细胞仪软件包，如FlowJo V7.5分析：
- 首先，基于前向（大小）和侧面（粒度）门活HEK293细胞分散。
- 基于高GFP-阳性分析仅转染的细胞进一步栅极活的HEK293细胞。
- 确定活GFP阳性细胞内的AF647信道的平均荧光强度（MFI）。
- 数据导出到Excel或棱镜进行分析：
- C区初级抗体（抗NMDA受体或抗D2R抗体）相对于MFI的oncentrations从孵育这些抗体的细胞获得。
- 对于每一个病人和对照样品，减去从HEK293 D2R +或NMDA受体的HEK293 +细胞，小额信贷机构分别HEK293 CTL细胞的MFI确定ΔMFI。
- 通过将上述控制队列的平均ΔMFI三个标准差计算抗体阳性的门槛。
- 情节个别样品根据其血清类型分组上的曲线图，并表示所述阈值作为线。
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Representative Results
购入住HEK293 D2R +和HEK293细胞的CTL在流式细胞仪中使用的高通量采样器。在分析过程中，细胞是基于前向散射（大小）和侧向散射光（粒度）参数（ 图1A和1D）门控。转染的HEK293细胞中表达的报道分子，绿色荧光蛋白，在细胞质中，与未转染的细胞被排除在分析（ 图1B和1E）。内的GFP +栅极，与AF647-标记的抗人IgG第二抗体结合相关的MFI进行测定（ 图1C和1F）。为了当分析人血清，以消除背景荧光，该ΔMFI计算减去从HEK293 D2R +细胞的MFI值（ 图1G）的HEK293细胞的CTL的MFI。所示数据代表的D2R抗体分析，并相同的门控策略和数据分析可用于NMDA受体抗体检测（数据未显示）。
抗体检测通过流式细胞术基于细胞的测定是基于所感兴趣的抗原的细胞表面表达。 如图2，HEK293 NMDAR +细胞高度表达的表面NMDAR（ 图2A）和HEK293 D2R +细胞高度表达的表面D2R（ 图2B），而CTL的HEK293细胞中表达没有这些抗原的（ 图2A和2B）。
在这项工作中所用的病人群体包括与NMDAR脑炎的患者队列（NMDAR恩奇，n = 4时，由表面NMDA受体亚单位1的检测NR1-3抗体所定义的脑炎），D2R抗体相关性脑炎（D2R恩奇， N = 6，通过表面D2R抗体11的检测限定的脑炎），和一个控制队列的Wi个其他非炎性神经疾病（OND中，n = 26），如癫痫，中风，和发育或神经变性疾病。患者样本之前已经验证了NMDA受体5和D2R 11 IgG抗体阳性。四个患者的正面为NMDA受体抗体具有NMDA受体脑炎的描述3和血清样品用基于细胞的测定对NMDA受体的抗体所描述和在商业用途3,4可以证实阳性的典型临床综合征。这六个病人阳性D2R抗体有基底节脑炎描述11典型的临床症状和血清样本被证明积极利用D2R敲除脑切片，转染细胞和神经元11 D2R抗体。
为了确定患者抗体阳性，该阈值，或截止，抗体阳性，加入上面的三个标准偏差，计算在每个实验意味着OND控制ΔMFI。 4/4例NMDA受体恩奇被证实感染人类表面NMDA受体IgG抗体（ 图3A），而6/6患者D2R恩奇呈阳性的人面D2R IgG抗体（ 图3B）。无阳性患者进行了靶向NMDA受体和D2R抗体双阳性。在任何分析OND对照中未检出的NMDA受体和D2R抗体（ 图3A和3B）。患者样品被认为是阳性，如果他们是高于阈值的至少三分之二的重复实验。
图1。检测抗体通过高通量流式细胞术基于细胞的测定：门控策略和数据分析起居 ËHEK293 CTL细胞和HEK293 D2R +稳定转染基于前向散射（FSC）和侧向散射光（SSC）（，A，D分别为74.7％和68.5％）的门。 HEK293 CTL和HEK293 D2R +细胞（分别为32.8％和95.4％; B，E）内GFP阳性细胞进一步门控，以排除未转染绿色荧光蛋白-细胞（分别为67.2％和4.6％; B，E）。内的GFP +细胞，与AF647-标记的抗人IgG第二抗体相关联的平均荧光强度（MFI）（HEK293 CTL = 3657; HEK293 D2R + = 9128）的测定（C，F）。对于人类样本，ΔMFI计算由该HEK293 D2R +细胞（G）中减去HEK293 CTL细胞的小额信贷机构。显示D2R抗体检测的有代表性的数据。 ANK“>点击这里查看大图。
图2。表面NMDA受体和D2R通过高通量流式细胞术基于细胞的测定法测定的表达。HEK293 NMDAR +（A），HEK293 D2R +（B），和HEK293 CTL细胞用一抗的连续稀释，接着进行适当的二级抗体。观察NMDA受体和D2R的高表面表达。 MFI值与相关抗体滴度，因为他们稳步增加与初级抗体的浓度的增加。正如预期的那样，没有检测在HEK293 CTL细胞表面NMDA受体或D2R的。如图代表性的数据。空白“>点击这里查看大图。
图3。患者，血清从NMDA受体脑炎（NMDA受体恩奇中，n = 4），D2R抗体相关性脑炎（D2R恩奇中，n = 6）的患者，或控制其他神经系统疾病（OND 队列确认检测表面NMDA受体和D2R抗体中，n = 26或24）培养与活的HEK293 NMDAR +，HEK293 D2R +，和HEK293细胞的CTL，接着AF647-标记的抗人IgG第二抗体。第4/4 NMDA受体恩奇例（A）和6/6 D2R恩奇患者分别为（B），血清中检测出表面NMDA受体和D2R抗体，而没有任何OND对照组（0/26或0/24）的有两种抗体（A，B）。 Dotte上图的d线的代表加入三个标准差来控制OND的平均ΔMFI计算的积极性阈值。代表点图出来的三个实验都显示， 请点击这里查看大图 。
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Discussion
本文介绍了一种新的应用流式细胞仪活细胞为基础的检测，以检测针对特定的细胞表面蛋白神经元使用高通量采样抗体。使用这种技术，我们报告说，受影响的自身免疫性中枢神经系统疾病的患者亚组有血清抗体表面NMDA受体或地表D2R。
使用这种高通量流式细胞仪活细胞为基础的检测为最佳的抗体检测的基本步骤包括：1）获得高产量的健康转染的细胞，2）验证高细胞表面所感兴趣的抗原的表达，3）建立抗体的阈值使用阳性对照队列，4），并确认该数据的再现性。
健康细胞的培养是十分重要的这种技术的成功。 HEK293细胞是公知的，由于它们易于培养，转染效率高，并且其缺乏神经元的表达的蛋白质，这就是为什么它们已被普遍使用在基于细胞的测定来检测抗体来特异性神经元抗原4,5,8-10。最佳的转染率， 收购活GFP +细胞的比例很高是至关重要的这个实验，以准确地计算出小额信贷机构。由于这个原因，产生的GFP的多克隆稳定细胞系+ HEK293 NMDAR +，HEK293 D2R +或HEK293 CTL的细胞是有利的，因为它提供了GFP +细胞的一贯高的水平，与不具有重复转染细胞之前的额外的便利每个实验。快速查看，通过倒置显微镜转染细胞，建议检查健康细胞（GFP +细胞会发出荧光，如果汞灯是可用的）。如果可行性似乎没有那么高，它可能是有利的流式细胞仪用活力染料，如7 - 氨基放线菌素D，细胞采集前的流量，并增加在在分析了一个额外的门控步骤为排除没有自生能力的细胞。
在自身免疫CNS疾病，结合到大脑的抗原的细胞外结构域的抗体被认为是致病2,3,7,13,14，因此强调的是使用活和nonpermeabilized细胞放置在抗体的检测。该协议通过转染细胞表达的表面抗原达到这个目标。因此，需要这些抗原的正确出口到表面，可以通过转染细胞的染色与针对感兴趣的抗原的商业初级抗体的系列稀释液来确定。当评估对nonpermeabilized细胞表面抗原的表达水平，它必须使用针对该蛋白的胞外抗原表位的抗体。如果一个特定的抗体是不可用时，可能有必要增加一个标签上的抗原的细胞外结构域，并且此后使用商业抗体针对该标签以确定表面的表达。我们已经成功地用血凝素标记的D2R采用这种方法，并排除病人血清中免疫反应的标签本身11。同样重要的是所感兴趣的抗原的完整的cDNA序列克隆到合适的载体中，以便在细胞膜上表达的和结构的完整性不会受到损害。事实上，先前已表明，受体蛋白的特定结构域的正确折叠，出口，并融入细胞膜18是必不可少的。
在流式细胞仪细胞分析，评估每个实验病人血清抗体阳性依托建立的阈值，或截止，从控制队列派生的。 Zhou 等 19计算抗体阳性的阈值加上平均Δmedian荧光强度以上两个标准差，这大约相当于健康控制范围的第 95百分位。在我们以前的研究中，我们选择了一个较高的截止（另外的三个标准偏差的控制队列的平均值ΔMFI），其对应于健康对照的范围11,20的第 99个百分位数。此外，McLaughlin 等人 16选择了表达的特异性抗体的反应性的测定与MFI的抗原表达细胞和抗原阴性细胞之间的比例。大于5的比例被认为是积极的，相当于平均比率的控制，这是类似我们的工作上面三个标准差。使用更高的门槛提高了协议的严格和提高控制和患者阳性抗体之间的歧视。重要的是，在我们的经验，健康控制范围的抗体反应性并不比OND范围显著的不同，使得无论是使用人口的度的计算抗体阳性11,20电子商务的门槛。
正如在所有研究实验，数据重现性是至关重要的。患者的血清被认为是阳性对一个特定的神经元抗原抗体，如果他们是以上阳性的阈值中的至少两个出三个独立实验。个别患者有不同的IgG浓度在他们的血清。这些变化可能对抗体结合，相对于其他患者的水平具有影响。在我们以前的研究中使用的所有病人血清用比浊法测定，发现在正常范围（6.2-14.4克/升）11内，而我们总是血清稀释用相同的稀释倍数。建立个体血清的滴度曲线可能是有益的，以比较例之间的抗体浓度。另外，研究者的初始致盲期间基于细胞的测定是推荐的，但需要控制，以计算在断定要揭盲ivity门槛。
当一个似是而非的抗体靶标被发现，适当的验证是为了防止假阳性。使用流式细胞术基于细胞的测定的流量检测抗体阳性或阴性的样品应采用将不优先利用变性的或线性化的抗原的替代方法来测定。例如，降低免疫反应从抗原特异性基因敲除动物的脑切片在几个新报告的中枢神经系统的情况下，已成功地显示自身抗原9-11,21。在抗原表达细胞病人血清的免疫吸附也已被用于验证的结果9,11。
流式细胞术在本文中描述的基于细胞的测定协议的流程可以很容易地改变，以评估抗体的特异性，以多种不同的抗原靶，包括中枢神经系统以外的发现。这很可能是其他未知的特异性抗体存在，尚未被识别。此外，该技术是适合于检测不同的类别和亚类免疫球蛋白，包括IgM抗体，如在我们以前的研究11,20。 IgG亚型的确定也可能揭示的潜力，有助于疾病的发病机制。例如的IgG1或IgG3能够介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性，它被报告的自身抗体引起的致病机制14,20,22。荧光染料比AF647（远红外）等也可以，只要它们具有发射峰足够远的距离，该报告分子，GFP的利用。任何重叠的发射光谱必须有正确的赔偿要求。确定抗体的特异性的细胞内蛋白也将是可能的使用流式细胞术，虽然，细胞首先必须被固定和透化，以使该抗原可用于抗体结合。这种替代方法可能会导致高的backgrou第二，由于抗体的接触到细胞内结构域以及众多的细胞抗原，这是其他隐藏在现场nonpermeabilized细胞。这些干扰因素可能会降低流式细胞基于细胞的测定和适当的控制必须相应地进行流的强度。
流式细胞术基于细胞的测定中使用的高通量流提供了抗体的人血清中从患者大样本检测的可靠和准确的方法。通过这种技术发现更多的新抗体将有助于诊断和治疗自身免疫性中枢神经系统疾病的未来治疗。
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Disclosures
利益冲突：一个专利已提交FB和RCD（悉尼大学）声称D2R为目标的自身抗体。
Acknowledgments
这项工作是由澳大利亚国家卫生和医学研究理事会，星科基金会（澳大利亚），抽动秽语综合征协会（美国）的支持，该崔西多发性硬化症研究基金会和多发性硬化症研究澳大利亚，Petre的基金会（澳大利亚），丽贝卡L。库珀医学研究基金会（澳大利亚）。我们感谢所有的病人，谁提供的样品为我们研究家族成员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
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