Summary
За последние годы, живые клеточных анализов были успешно использованы для выявления антител против поверхностных и конформационных антигенов. Здесь мы опишем метод с использованием высокой пропускной проточной цитометрии позволяет анализ больших группах пациентов. Обнаружение новых антител улучшит диагностику и лечение расстройств иммуноопосредованных.
Abstract
За последние годы, антитела против поверхностных и конформационных белков, участвующих в синапсах были обнаружены в аутоиммунных заболеваний ЦНС у детей и взрослых. Эти антитела были использованы, чтобы направлять диагностику и лечение. Сотовые основе анализов улучшились обнаружение антител в сыворотке пациента. Они основаны на поверхностную экспрессию антигенов мозга на эукариотических клеток, которые затем инкубировали с разбавленной сывороткой пациента с последующим флуорохромом конъюгированные вторичные антитела. После промывки вторичное антитело связывания анализировали с помощью проточной цитометрии. Наша группа разработала поток высокой пропускной цитометрии живых клеток на основе анализа, чтобы надежно обнаружить антитела против специфических рецепторов нейромедиаторов. Этот метод проточной цитометрии является прямым, количественный, эффективной и использование системы отбора проб с высокой пропускной позволяет большие когорты пациентов, чтобы быть легко проанализированы в короткий промежуток времени. Кроме того, эта ячейка на основе каксказать можно легко адаптировать для выявления антител к различным антигенным целей, как из центральной нервной системы и периферии. Открывая дополнительные биомаркеров роман антител позволит быструю и точную диагностику и улучшить лечение нарушений иммуноопосредованных.
Introduction
За последние годы, аутоиммунные формы центральной нервной системы (ЦНС) заболеваний выявлено не было. Было показано, что эти заболевания связаны и определяется наличием аутоантител. Эти антитела связываются с нейронных рецепторов или синаптических белков, участвующих в нейротрансмиссии 1,2. Различные антигены были обнаружены, например, N-метил-D-аспартат рецепторов (NMDA-) 3-5, γ-аминомасляной кислоты рецептора ГАМК B (B) 6, рецептор α-амино-3-гидрокси-5-метил-4- изоксазолпропионовой кислоты (АМРА) рецептору 7, напряжения закрытого калиевых каналов (VGKC), связанные белки: лейцин-богатый глиома-активированный протеин 1 (LGL-1) и Contactin-ассоциированный белок 2 (capsr2) 8,9, глутамат рецептора 5,10 , и дофамин-2-рецептора (D2R) 11. В прошлом эти аутоиммунные расстройства ЦНС (в основном называемые энцефалит) часто диагностируется и не лечится. Эти новые биомаркеры антител, напримерNMDA-антитело или D2R антитела, существенно улучшились диагностика и осведомленности, и открыли возможности для лечения пациентов. Действительно, в начале лечения с иммунотерапии связано с улучшением результатов 11,12.
Традиционные методы для выявления антител, такие как иммуноферментного анализа (ELISA) и вестерн-блоттинга были использованы для выявления антител в сыворотках. Тем не менее, они не всегда позволяют признание внеклеточных или поверхностных эпитопов и, скорее, может выявить иммунореактивности к внутриклеточным эпитопа. Кроме того, антитела, которые связываются с внеклеточным доменом важных белков, участвующих в нейротрансмиссии, вероятно, будут патогенный 2,3,7,13,14. Таким образом, развитие точных и чувствительных анализов, чтобы обнаружить соответствующую поверхность клеток или внеклеточных антител цели у пациентов имеет первостепенное значение. Способ золотым стандартом в этой области основана на использовании живых клеток, в так называемом "клеток-баSED анализы ". Этот метод предполагает выражение антигена на поверхности клеток млекопитающих (чаще всего человеческие эмбриональные почечные 293 (НЕК293) клеток) в своей нативной форме по трансфекции векторов, содержащих полную последовательность кДНК представляющим интерес антигеном. Текущие nonpermeabilized Клетки затем инкубировали с Разведенные образцы сыворотки и последующей флуорохромом-конъюгированного антитела против человеческого иммуноглобулина (Ig) вторичных антител. Интенсивность или уровень флуоресценции затем обнаружены и связан с уровнем аутоантител связывания. Этот метод является специфическим, так как только один антиген избыточно экспрессируется в клетках. Наиболее широко используется "для чтения отъезде" был конфокальной микроскопии анализ после иммуноцитохимии 4,5,8-10. Тем не менее, проточной цитометрии клеточных анализов были успешно использованы для выявления антител у пациентов с демиелинизирующих заболеваний 15-17. В частности, Waters и соавт. 15 по сравнению обнаружение антител с использованием поддонэль из методов обнаружения антител в том числе клеточных анализов, после чего микроскопии или проточной цитометрии анализа и показал проточной цитометрии на основе клеток анализе наиболее чувствительными, точными, и надежный способ. Таким образом, проточной цитометрии клеток на основе анализа является предпочтительным, поскольку это количественный, не зависящих исследователь, и не включает в себя любое использование радиоактивного материала. Это также удобно, так как позволяет большие когорты пациентов для анализа в короткий промежуток времени.
Совсем недавно, мы оптимизировали поток высокой пропускной цитометрии клеток на основе анализа для обнаружения NMDAR антитела и D2R антитела у пациентов с аутоиммунными заболеваниями ЦНС 11. Наша группа недавно обнаружены NMDAR антитела в сыворотке пациента с помощью проточной цитометрии на основе клеток анализа. Эти NMDA-антитело-положительные сыворотки были предварительно проанализированы с помощью конфокальной микроскопии и также оказались положительными 11. Этот протокол описывает проточной цитометрии на основе клеток анализа для обнаружения сonformation чувствительных ЦНС антитела в сыворотке пациента с использованием автоматизированной высокой пропускной сэмплер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Субклонирование Стратегия построит pIRES2-EGFP вектор, кодирующий D2R или NMDAR
- Получить полный рост клона кДНК человеческого D2R или NMDAR субъединицы 1 (NR1).
- Выбрать вектор экспрессии, такой как pIRES2-EGFP, который подходит для экспрессии трансмембранных белков с повышенной зеленого флуоресцентного белка (GFP) репортер под контролем внутреннего сайта входа рибосомы (IRES), позволяя оба антигена и GFP быть совместной экспрессии в клетки отдельно.
- Субклон кДНК человека в pIRES2-EGFP вектора.
- Для субклонировать кДНК, использовать соответствующие ферменты рестрикции (например NheI и XhoI для человека D2R кДНК).
- Перевязывать вырезать вставки кДНК в ограниченном pIRES2-EGFP вектора.
- Последовательность лигирована pIRES2-EGFP D2R или NMDAR вектор проверить вектор содержит ли правильную последовательность.
- Очищают и усилить pIRES2-EGFP D2R или NMDAR вектор для дальнейшего использования в трансфекции.
- Культура HEK293 клетки в тканевых культуральных колбах со свежим Дульбекко в модификации Дульбекко (1x) (DMEM) в комплекте с 4,5 г / л D-глюкозы, L-глутамина и 110 мг / л пирувата натрия с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ глютамаксом и 50 мкг / мл гентамицина.
- Снять HEK293 клетки, используя трипсин и трансфер в конической трубе.
- Вымойте путем центрифугирования клетки при 250 мкг в течение 6 мин и ресуспендируют осадок клеток в свежей полной DMEM.
- Граф клеток и семян 6-луночные планшеты около 8 х 10 5 клеток / лунку и культуры в течение ночи в 2 мл DMEM при 37 ° С и 5% СО 2 в инкубаторе.
- После того, как они достигли около 70% слияния, трансфекции клеток HEK293 с pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + клеток), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + клеток), и pIRES2-EGFP (HEK293 CTL клетки; векторное управление) следующим образом.Держите некоторые нетрансфицированные HEK293 клетки для компенсации в дальнейшем.
- Подготовьте необходимый объем трансфекции смеси, включающей 2,5 мкг ДНК, 200 мкл 0,9% хлорида натрия и 4 мкг / мл полиэтиленимин / а (каждый из которых содержит 2 мл свежей полной DMEM).
- Сразу же вихрь смеси в течение 10 сек и инкубируют при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин перед добавлением объем трансфекции смеси в соответствующие лунки.
- Закройте планшет, обернуть стороны парафильмом и центрифуге при 280 мкг в течение 5 мин, чтобы помочь трансфекции клеток.
- Снимите парафильмом, а затем поместить в инкубатор для культуры при 37 ° С
- Заменить питательных сред 18 часа спустя с свежей полной DMEM, и поддерживать в культуре еще 72 часа.
- Дополнительно: 72 часа после трансфекции трансфицированные клетки могут быть выбраны по культуре в полной среде DMEM, дополненной 250 мкг / мл генетицина, с тем чтобы получить стабильный поликлонального трансфектант.
- Снять НЕК293 NMDAR +, HEK293 D2R + и HEK293 CTL клетки путем инкубации с 500 мкл / лунку версеном примерно 5 мин при 37 ° С
- Ресуспендируют в 2ml/well ФСБ (-Са 2 + /-Mg 2 +) с добавлением 2% FBS (PBS / FBS) и трансфер в 15 мл или 50 мл коническую трубку.
- Вымойте клеток путем центрифугирования при 250 мкг в течение 6 мин и ресуспендируют осадок клеток в 15-50 мл PBS / FBS. Повторите мыть 2 раза.
- Граф клеток, а затем ресуспендируют в PBS / FBS в 1 х 10 6 клеток / мл.
- Шаблон 96-луночного на приобретение проточной цитометрии, учитывая, что HEK293 D2R + или HEK293 NMDA-+-клеток, а также HEK293 клетки CTL должны быть инкубировали с каждого образца пациента или первичного антитела.
- Семенной клеток в V дном 96-луночного планшета при 50000 клеток / WELL соответствии с проточной цитометрии шаблона приобретения.
- Гранул клеток путем центрифугирования пластину 96-а при 450 мкг в течение 5 мин и осторожно удалите супернатант с помощью электронного или ручной многоканальную пипетку, наклоняя тарелку на угол, стараясь не для аспирации осадок клеток.
- Выдержите НЕК293 D2R +, HEK293 NMDAR + и HEK293 CTL клетки в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте с:
- Серийные разведения первичного антитела в целях оценки экспрессии поверхностного антигена.
- Образцы пациентов с целью выявления антител.
- Используйте соответствующий проточной цитометрии управления компенсационных, например. неокрашенные нетрансфицированные клетки HEK293, GFP + клетки HEK293 (AF647 -), и нетрансфицированные AF647 + клеток НЕК293 (GFP).
- Промыть клетки центрифугированием при 450 х г в течение 5 мин и ресуспендируют осадок клеток в 170 мкл PBS / FBS. Повторите стирки Шаг второй более раз.
- Инкубируйте клетки в течение 1 часаR при комнатной температуре в темноте с 1:100 разбавлении AF647-конъюгированным вторичным антителом (анти-человеческий IgG для сыворотки пациента и анти-мышиной IgG к анти-NR1 или анти-D2R первичными антителами).
- Промыть клетки три раза, как на стадии 3.7, и ресуспендируют в 35 мкл PBS / FBS в течение проточной цитометрии привязки к соте.
- Настройте высокой пропускной сэмплер (HTS) на проточном цитометре (BDLSRII).
- Приобретать 10000 событий / а в соответствии с проточной цитометрии шаблона приобретения.
- Экспорт, а затем анализировать данные для анализа с помощью проточной цитометрии программного пакета, например FlowJo v7.5:
- Во-первых, ворота живые клетки HEK293 на основе вперед (размер) и боковой (зернистость), тот расточает.
- Далее ворот живые клетки HEK293, основанные на высокой GFP-положительности для анализа только трансфекции клеток.
- Определяют интенсивность флуоресценции среднее (ИР), равный канала AF647 в живых GFP-положительных клеток.
- Экспорт данных в Excel или Prism для анализа:
- Участок сoncentrations первичного антитела (анти-NMDA-или анти-антителом D2R) по сравнению с MFI получены из клеток, инкубированных с этими антителами.
- Для каждого пациента и контрольного образца, определить ΔMFI путем вычитания MFI клеток HEK293 CTL от МФО в HEK293 D2R + или HEK293 NMDAR + клеток, соответственно.
- Рассчитать порог позитивности антител, добавив три стандартных отклонения выше среднего ΔMFI управляющего когорты.
- Образцы индивидуальных земля сгруппированы в соответствии с их типом сыворотки на графике и представляют порог в виде линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки живут HEK293 D2R + и HEK293 CTL были приобретены на проточном цитометре с использованием высокой пропускной сэмплер. Во время анализа, клетки закрытого на основе рассеяния вперед (размера) и боковой разброс (зернистость) параметров (рис. 1А и 1D). Трансфицированные клетки НЕК293 выразили репортерную молекулу, GFP, в цитоплазме, и нетрансфицированные клетки были исключены из анализа (фиг.1В и 1E). В GFP + ворота, МФО связаны с AF647-сопряженного против человеческого IgG вторичного связывания антител измеряли (рисунки 1С и 1F). Для устранения фоновой флуоресценции при анализе сыворотки человека, ΔMFI была рассчитана путем вычитания MFI клеток HEK293 CTL с MFI из D2R + клеток НЕК293 (рис. 1G). Приведенные данные являются представитель анализа D2R антител, ита же стратегия стробирования и анализ данных могут быть использованы для выявления антител NMDAR (данные не показаны).
Обнаружение антител к проточной цитометрии клетки на основе анализа основан на клеточной поверхности экспрессии интересующего антигена. Как показано на рисунке 2, HEK293 NMDAR + клеток экспрессируется на высоком уровне поверхности NMDAR (рис. 2а) и HEK293 D2R + клеток экспрессируется на высоком уровне поверхности D2R (рис. 2б), в то время как HEK293 CTL клетки выразил ни один из этих антигенов (рис. 2А и 2В).
Группы больных, используемые в данной работе состоит из когорты пациентов с NMDA-энцефалита (NMDA-Enc, п = 4, энцефалит определяется обнаружения поверхности NMDAR-субъединицы NR1 1-антитело 3), D2R антитело-ассоциированный энцефалит (D2R Enc, п = 6, энцефалит определяется обнаружения поверхности D2R антителом 11), а также контроль группа шй другие невоспалительные неврологические заболевания (OND, N = 26), например, эпилепсии, инсульта и развития или нейродегенеративных расстройств. Образцы пациентов были ранее утверждены для NMDAR 5 и D2R 11 IgG положительности. Четыре пациенты положительные для NMDAR антител был типичный клинический синдром NMDAR энцефалита, как описано 3 и образцы сыворотки доказанный положительный использованием клеточных анализов для NMDAR антител, как описано и доступны в коммерческом использовании 3,4. Шесть пациентов положительные для D2R антител был типичный клинический синдром базальных ганглиев энцефалита, как описано 11, и образцы сыворотки были доказаны положительным для D2R антител с использованием D2R нокаут-срезы головного мозга, трансфекции клеток и нейронов 11.
Для того чтобы определить позитивности антител у пациентов, порог, или отсечки, позитивности антител рассчитывали в каждом эксперименте путем добавления трех стандартных отклонений вышезначит ΔMFI элементов управления ОНД. 4/4 больных с NMDAR Enc были подтверждены положительным для человеческого поверхность NMDAR IgG антитела (Рисунок 3А), в то время как 6/6 пациентов с D2R Enc были положительны для человеческого поверхностное антитело D2R IgG (рис. 3В). Ни один из позитивных пациентов не было двойной положительный результат на антитела, направленных NMDAR и D2R. NMDAR и D2R антитела не были обнаружены ни в одном из контрольных ОНД анализируемых (рис. 3А и 3В). Образцы пациентов считались положительными, если они были выше порога, по крайней мере, двух из трех повторных экспериментах.
Рисунок 1. Обнаружение антител на высокой пропускной проточной цитометрии на основе клеток анализа:. Стробирования стратегии и анализа данных Лив э HEK293 CTL клетки и HEK293 D2R + стабильные трансфектанты закрытого на основе рассеяния вперед (FSC) и боковой разброс (SSC) (74,7% и 68,5%, соответственно; A, D). GFP-положительных клеток в пределах HEK293 CTL и HEK293 D2R + клеток (32,8% и 95,4% соответственно; B, E) были дополнительно закрытого исключить нетрансфицированных GFP - клеток (67,2% и 4,6%, соответственно, B, E). В GFP + клеток, интенсивность средняя флуоресценции (MFI), связанные с AF647-конъюгированного антитела против человеческого IgG вторичного антитела (HEK293 CTL = 3657; HEK293 D2R + = 9128) была измерена (C, F). Для образцов человека, ΔMFI была рассчитана путем вычитания MFI клеток HEK293 CTL из что из D2R + клеток НЕК293 (G). Репрезентативные данные обнаружения D2R антител показано. АНК "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 2. Выражение поверхности NMDA-и D2R, определенной высокой пропускной проточной цитометрии клеток на основе анализа. HEK293 NMDA-+ (A), HEK293 D2R + (В), и HEK293 CTL клетки окрашивали серийных разведений первичным антителом, а затем соответствующим вторичным антителом. Наблюдались высокая поверхностная экспрессия NMDA-и D2R. Значения MFI коррелирует с титром антител, поскольку они постоянно увеличивается с увеличением концентраций первичного антитела. Как и ожидалось, не было обнаружение поверхности NMDA-или D2R в HEK293 CTL клеток. Представитель данные показаны.пустой "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.
Рисунок 3. Подтвержденные обнаружение поверхность NMDAR и D2R антител в когорте пациентов. Сыворотки NMDAR энцефалита (NMDA-Enc, N = 4), D2R антитела связанных энцефалит (D2R Enc, п = 6) пациенты, или управления с другими неврологическими заболеваниями (ОНД , N = 26 или 24) инкубировали с живой HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + и HEK293 клетки CTL, после чего AF647-конъюгированным против человеческого IgG вторичного антитела. Поверхность NMDAR и D2R антитела были обнаружены в сыворотке 4/4 пациентов NMDAR ENC (А) и 6/6 пациентов D2R ENC (В), соответственно, в то время как ни один из элементов управления ОНД (0/26 или 0/24) не было ни антитело (А, В). Dotteд линии на графиках представляют собой позитивности порог рассчитывается путем сложения трех стандартных отклонений к средней ΔMFI из ОНД управления. Представительства точка участки из трех экспериментов. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья описывает новую применение проточной цитометрии живых клеток на основе анализа для выявления антител, направленных на конкретные белки нервных клеточной поверхности с помощью высокой пропускной сэмплер. Используя эту технику, мы сообщаем, что подгруппа пациентов, страдающих с аутоиммунными заболеваниями ЦНС имеют сывороточных антител к поверхностным NMDAR или поверхностные D2R.
Эфирные шаги для оптимального обнаружения антител с использованием этого потока с высокой пропускной цитометрии живых клеток на основе анализа включают 1) получение высокого выхода здоровых трансфицированных клеток, 2) проверка высокой клеточной поверхности выражение представляющим интерес антигеном, 3) установление порога антитела положительность используя когорту управления, 4) и подтверждения воспроизводимости данных.
Культура здоровых клеток является основой успеха этой методики. Клетки НЕК293, хорошо известны за их простоту культуры, высокой эффективности трансфекции, и их отсутствие экспрессии нейрональныхбелки, и именно поэтому они были широко используется в клеточных анализов для выявления антител к определенным антигенам нейронных 4,5,8-10. Оптимальная скорость трансфекции приобрести высокий процент живых клеток GFP + является критическим для этот анализ, чтобы точно вычислить MFI. По этой причине, производя поликлональную стабильной линии клеток GFP + НЕК293 NMDAR +, HEK293 D2R + или HEK293 CTL клеток выгодно, так как это обеспечивает последовательную высокий уровень GFP + клеток, с дополнительным удобством не необходимости неоднократно трансфекции клеток до каждый эксперимент. Быстрый просмотр трансфицированных клеток через инвертированный микроскоп рекомендуется проверить для здоровых клеток (GFP + клетки будут светиться, если ртутная лампа имеется). Если жизнеспособность, похоже, не так высоки, это может быть выгодно использовать жизнеспособность краситель, такой как 7-амино-актиномицин D, перед приобретением клеток на проточном цитометре и добавить дополнительный шаг стробирования в Analysявляется исключение нежизнеспособных клеток.
При аутоиммунных заболеваниях ЦНС, антитела, которые связываются внеклеточных доменов антигенов мозга, как считается, патогенные 2,3,7,13,14, поэтому акцент делается на выявление антител с использованием живых и nonpermeabilized клетки. Этот протокол достигает этой цели с помощью трансфекции клеток выражая поверхностные антигены. Таким образом, правильный экспорт из этих антигенов на поверхности должна быть определена путем окрашивания трансфицированных клеток с серийными разведениями коммерческой первичного антитела против антигена, представляющего интерес. При оценке уровня экспрессии поверхностного антигена на nonpermeabilized клеток, важно использовать антитела ориентации внеклеточный эпитоп белка. Если специфическое антитело не доступен, может быть необходимо добавить метку на внеклеточного домена антигена, а затем использовать коммерческие антитела против метки для определения поверхностной экспрессии. Мы успешноиспользовали этот подход с использованием гемагглютинина с метками D2R и исключать иммунореактивность сыворотки пациента в самом теге 11. Кроме того, важно, чтобы вся последовательность кДНК представляющим интерес антигеном субклонируют в подход щий вектор так, чтобы выражение и структурную целостность в клеточной мембране не будет нарушена. В самом деле, он был ранее показали, что отдельные домены белка рецептора имеют важное значение для правильного складывания, экспорта и интеграции в клеточной мембране 18.
В проточной цитометрии клеточных анализов, оценки антител положительность сывороток пациентов в каждом эксперименте полагается на установление порога, или обрезания, полученный из когорты управления. Чжоу и др.. 19 рассчитывается порог позитивности антител, добавив два стандартных отклонения выше среднего Δmedian интенсивности флуоресценции, и это примерно соответствовало 95-го процентиля здорового диапазона регулирования. Внаши предыдущие исследования, мы выбрали более высокой отсечки (добавление трех стандартных отклонений до среднего Δ МФО управляющего когорты), что соответствует 99-го процентиля в здоровом диапазоне 11,20 управления. Кроме того, McLaughlin и соавт. 16 выбрали выразить измерение специфическую реактивность антител как отношение MFI между антиген-экспрессирующими клетками и антиген-отрицательных клеток. Отношение выше 5 считали положительным и соответствует три стандартных отклонения выше среднего соотношения управления, которая похожа на нашу работу. Использование более высокий порог увеличивает жесткость протокола и улучшает дискриминации между контроля и пациентов положительных на антитела. Важно отметить, что в нашем опыте, антитело реактивность здорового диапазона регулирования существенно не отличается, чем диапазон ОНД, что позволяет использовать любой населения вычисэ порог позитивности антител 11,20.
Как и во всех научных экспериментов, воспроизводимость данных имеет первостепенное значение. Пациент сыворотки считаются положительными на наличие антител против определенного антигена нейронов, если они выше порога позитивности по крайней мере в двух из трех независимых экспериментов. Отдельные пациенты имеют различные концентрации IgG в сыворотке. Эти вариации могут оказывать влияние на уровень связывания антитела по отношению к другим пациентам. Все сыворотки пациента использовали в предыдущем исследовании, были измерены с помощью нефелометрии и установлено, что в пределах нормы (6.2-14.4 г / л) 11, и мы всегда разбавленной сыворотки с тем же коэффициент разбавления. Установление титра кривую индивидуального сыворотке может быть полезным, чтобы сравнить концентрации антител между пациентами. Кроме того, начальная ослепление следователя рекомендуется во время клеточной основе анализа, но элементы управления должны быть непредвзятыми, чтобы вычислить POSITivity порог.
Когда цель правдоподобным антитела найдено, то соответствующее подтверждение требуется для предотвращения ложноположительных результатов. Антитела-положительным или отрицательным-образцы, обнаруженные с помощью проточной цитометрии на основе клеток анализа следует анализировать с использованием альтернативного методологию, которая бы преимущественно не утилизировать денатурированные или линеаризованных антигены. Например, снижение иммунореактивности на срезах мозга от антиген-специфических нокаут животных успешно показано в случае нескольких новых сообщенных ЦНС аутоантигенов 9-11,21. Иммуноабсорбцией из сыворотки пациента на антиген-экспрессирующими клетками также были использованы для проверки результатов 9,11.
Проточной цитометрии протокола клеточном анализе, описанном в данном документе, могут быть легко изменены, чтобы оценить специфичность антител к множеству различных антигенных мишеней, в том числе те, что за пределами центральной нервной системы. Вполне вероятно, что антитела других неизвестных особенностей существуют и все же бытьопределены. Кроме того, этот метод подходит для обнаружения различных классов и подклассов Ig, в том числе IgM, как показано в наших предыдущих исследованиях 11,20. Определение IgG подкласса может также выявить существенный вклад в достижение патогенезе заболевания. Например IgG1 или IgG3 способны опосредовать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность или комплемент-зависимая цитотоксичность, которые сообщаются аутоантител, вызванной патогенности механизмы 14,20,22. Кроме AF647 (далеко красный) Флуоресцентные красители также могут быть использованы, пока они имеют пики выбросов достаточно далеко от такового в репортерной молекулой, GFP. Любой перекрытия спектров излучения должен иметь правильные требования по компенсации. Определение специфичности антитела к внутриклеточным белком также возможно с помощью проточной цитометрии, хотя, клетки сначала должны быть исправлены и проницаемыми, чтобы антиген доступен связывания антител. Этот альтернативный метод может привести к высокой backgrouй из-за воздействия антител к внутриклеточных доменов, а также многочисленные клеточные антигены, которые в противном случае были спрятаны в живых nonpermeabilized клеток. Эти смешанные факторы могут снизить прочность проточной цитометрии клеточном анализе и соответствующий контроль должен быть выполнен соответствующим образом.
Использование высокой пропускной проточной цитометрии клеток на основе анализа обеспечивает надежный и точный метод для выявления антител в сыворотке человека от крупных когортах пациентов. Обнаружение дополнительных новых антител с помощью такого метода поможет диагностики и будущие лечения пациентов с аутоиммунными заболеваниями ЦНС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов: патент была подана FB и УЗО (Университет Сиднея) утверждая, D2R, как мишень для аутоантител.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета, Star научного фонда (Австралия), синдром Туретта Ассоциации (США), Триш Рассеянный склероз исследовательский фонд и рассеянный склероз Исследование Австралия, Петре Фонд (Австралия), Ребекка Л. Купер Медицинский фонд исследований (Австралия). Мы благодарим всех пациентов и членов их семей, которые предоставили образцы для нашего исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
