Summary
Au cours des dernières années, des essais à base de cellules vivantes ont été utilisées avec succès pour détecter des anticorps contre les antigènes de surface et de conformation. Ici, nous décrivons une méthode utilisant un écoulement à haut débit cytométrie permettant l'analyse de grandes cohortes de patients. Détection de nouveaux anticorps permettra d'améliorer le diagnostic et le traitement des troubles du système immunitaire à médiation.
Abstract
Au cours des dernières années, des anticorps contre les protéines de surface et conformationnels impliqués dans la neurotransmission ont été détectés dans les maladies auto-immunes du système nerveux central chez les enfants et les adultes. Ces anticorps ont été utilisés pour orienter le diagnostic et le traitement. Essais cellulaires ont amélioré la détection des anticorps dans le sérum du patient. Ils sont basés sur l'expression des antigènes de surface du cerveau sur les cellules eucaryotes, qui sont ensuite incubées avec des sérums dilués de patients suivis par des anticorps secondaires conjugués à un fluorochrome. Après lavage, un anticorps secondaire de liaison est ensuite analysée par cytométrie en flux. Notre groupe a développé un flux à haut débit cytométrie dosage à base de cellules-live pour détecter de manière fiable les anticorps contre les récepteurs de neurotransmetteurs spécifiques. Cette méthode de cytométrie en flux est simple, quantitative, efficace, et l'utilisation d'un système d'échantillonnage à haut débit permet de grandes cohortes de patients pour être facilement analysés dans un court espace de temps. En outre, ce repose-cellule commedire peut être facilement adapté pour détecter les anticorps à de nombreuses cibles antigéniques différents, à la fois du système nerveux central et de la périphérie. Découvrir d'autres biomarqueurs d'anticorps roman permettra un diagnostic rapide et précis et améliorer le traitement de troubles à médiation immunitaire.
Introduction
Au cours des dernières années, des formes auto-immunes du système nerveux central (SNC) des maladies ont été identifiés. Il a été montré que ces maladies sont associées et définies par la présence d'auto-anticorps. Ces anticorps se lient à des récepteurs ou des protéines synaptiques des neurones impliqués dans la neurotransmission 1,2. Différents antigènes ont été détectés, tels que des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDAR) 3-5, récepteur de la γ-aminobutyrique B (GABA B) récepteur 6, α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4- acide isoxazolepropionique (AMPA) 7, le canal potassique voltage-dépendants (VGKC) protéines associées: riche en leucine gliome activé une protéine (LGL-1) et contactine-associated protein 2 (capsr2) récepteur 8,9, 5,10 glutamate , et de la dopamine-2 récepteur (D2R) 11. Dans le passé, ces troubles du SNC auto-immunes (principalement appelé encéphalite) étaient souvent non diagnostiquée et non traitée. Ces nouveaux biomarqueurs d'anticorps, par exemple,anticorps NMDAR ou anticorps D2R, ont considérablement amélioré le diagnostic et la sensibilisation, et ont ouvert des options de traitement pour les patients. En effet, un traitement précoce avec des immunothérapies est associée à une amélioration des résultats 11,12.
Les méthodes traditionnelles de détection des anticorps, tels que des immuno-essai enzymatique (ELISA) et Western blot ont été utilisées pour la détection des anticorps dans le sérum. Toutefois, ils ne permettent pas facilement la reconnaissance d'épitopes extracellulaires ou de surface et, plutôt, peuvent révéler immunoréactivité contre un épitope intracellulaire. En outre, des anticorps qui se lient au domaine extracellulaire des protéines importantes impliquées dans la neurotransmission sont susceptibles d'être 2,3,7,13,14 pathogène. Par conséquent, le développement de dosages précis et sensibles à découvrir la surface de la cellule pertinente ou des cibles d'anticorps chez les patients extracellulaire est primordiale. La méthode de l'étalon d'or dans le domaine est basée sur l'utilisation de cellules vivantes, dans ce qu'on appelle "cellule-baessais sed ". Ce procédé implique l'expression d'un antigène à la surface des cellules de mammifères (le plus souvent du rein 293 (HEK 293) de cellules embryonnaires humaines) dans sa forme native, par transfection de vecteurs contenant la séquence complète de l'ADNc de l'antigène d'intérêt. Les cellules non perméabilisés vivants sont ensuite incubées avec du sérum de patient dilué et suivies par un fluorochrome conjugué anti-immunoglobuline humaine (Ig), un anticorps secondaire. L'intensité ou le niveau de fluorescence est alors détectée et est associée au niveau de la liaison auto-anticorps. Cette technique est spécifique, comme un seul antigène est surexprimé dans les cellules. Le plus utilisé "lecture" a été analyse par microscopie confocale après immunocytochimie 4,5,8-10. Cependant, la cytométrie en flux tests cellulaires ont été utilisés avec succès pour détecter les anticorps chez les patients atteints de maladies démyélinisantes 15-17. En particulier, Waters et al. 15 ont comparé la détection des anticorps en utilisant une casseroleel des techniques de détection des anticorps, y compris des analyses cellulaires suivies par microscopie ou des analyses de flux cytométrie, et a montré la cytométrie en flux essai à base de cellules pour être la méthode la plus sensible, précis et fiable. Par conséquent, la cytométrie en flux essai à base de cellules est avantageuse car elle est quantitative, pas enquêteur dépendant, et n'implique pas l'utilisation de matières radioactives. Il est également commode, car il permet de grandes cohortes de patients à tester dans un court laps de temps.
Plus récemment, nous avons optimisé un flux à haut débit cytométrie test cellulaire pour détecter les anticorps dirigés NMDAR et anticorps D2R chez les patients atteints de maladies auto-immunes du système nerveux central 11. Notre groupe a récemment détecté des anticorps NMDAR dans les sérums des patients en utilisant la cytométrie en flux essai à base de cellules. Ces sérums d'anticorps positif NMDAR ont été préalablement analysés par microscopie confocale et ont également révélé positif 11. Ce protocole décrit un dosage de cytométrie de flux à base de cellules pour la détection de canticorps CNS onformation sensible dans le sérum du patient en utilisant un échantillonneur à haut débit automatisé.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Sous-clonage Stratégie de construire pIRES2-EGFP vecteur codant D2R ou NMDAR
- Obtenir ADNc complet clone de D2R humaine ou NMDAR sous-unité 1 (RN1).
- Choisir un vecteur d'expression, tel que pIRES2-EGFP, ce qui est approprié pour l'expression de protéines transmembranaires avec une protéine améliorée verte fluorescente (GFP) rapporteur sous le contrôle d'un site interne d'entrée du ribosome (IRES), permettant à la fois des antigènes et des GFP d'être co-exprimées dans cellules séparément.
- Sous-cloner l'ADNc humain dans pIRES2-EGFP vecteur.
- Pour sous-cloner l'ADNc, en utilisant les enzymes de restriction appropriées (par exemple Nhel et Xhol pour D2R ADNc humain).
- ADNc Ligate coupe insérer dans restreint vecteur pIRES2-EGFP.
- Séquence ligaturé pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vecteur de vérifier si le vecteur contient la séquence correcte.
- Purifier et amplifier pIRES2-EGFP D2R ou NMDAR vecteur pour une utilisation ultérieure dans la transfection.
- Les cellules de la culture HEK293 en flacons de culture tissulaire avec un milieu de Eagle modifié frais Dulbecco (1x) (DMEM) avec 4,5 g / L de D-glucose, L-glutamine et de 110 mg / L de pyruvate de sodium supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 2 mM GlutaMAX, et 50 ug / ml de gentamicine.
- Détacher les cellules HEK293 en utilisant la trypsine et la transférer dans un tube conique.
- Laver les cellules par centrifugation à 250 g pendant 6 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans du DMEM complet frais.
- Compter les cellules et les semences plaques de 6 puits à environ 8 x 10 5 cellules / puits et de la culture pendant une nuit dans du DMEM 2 ml à 37 ° C et 5% de CO 2 dans un incubateur.
- Une fois qu'ils ont atteint environ 70% de confluence, transfecter les cellules HEK293 avec pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR Les cellules +), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + cellules), et (cellules HEK293 CTL; contrôle vectoriel) pIRES2-EGFP comme suit.Gardez quelques cellules HEK293 non transfectées d'indemnisation plus tard.
- Préparer un volume déterminé de mélange de transfection comprenant 2,5 ug d'ADN, de 200 ul de chlorure de sodium à 0,9% et de 4 ug / ml de polyéthylèneimine / puits (contenant chacune 2 ml de DMEM complet frais).
- Vortex immédiatement le mélange pendant 10 secondes et incuber à température ambiante (RT) pendant 10 min, avant d'ajouter le volume de mélange de transfection dans les puits appropriés.
- Recouvrir la plaque, envelopper les côtés avec du Parafilm et centrifuger à 280 g pendant 5 min à l'aide transfection cellulaire.
- Retirez le Parafilm et les placer dans l'incubateur de culture à 37 ° C.
- Remplacez le support de culture 18 heures plus tard avec du DMEM complet frais, et maintenir dans la culture pour un autre 72 heures.
- Facultatif: 72 heures après la transfection, les cellules transfectées peuvent être sélectionnées par culture dans du DMEM complet additionné de 250 ug / ml de généticine, de manière à obtenir un transfectant stable polyclonal.
- Détacher HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, et les cellules HEK293 CTL par incubation avec 500 ul / puits Versene pendant environ 5 min à 37 ° C.
- Remettre en suspension dans du PBS 2ml/well (-Ca 2 + / Mg 2 +-) supplémenté avec 2% de FBS (PBS / FBS) et transférer dans un 15 ml ou 50 ml de tube conique.
- Laver les cellules par centrifugation à 250 g pendant 6 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans 15 à 50 ml de PBS / FBS. Répétez lavage 2x.
- Compter les cellules et remettre en suspension dans du PBS / FBS à 1 x 10 6 cellules / ml.
- Concevoir le modèle à 96 puits pour l'acquisition de la cytométrie en flux, en considérant que HEK293 D2R + + ou des cellules HEK293 NMDAR, ainsi que des cellules HEK293 CTL devront être incubé avec chaque échantillon de patient ou de l'anticorps primaire.
- cellules de semences dans une plaque de 96 puits à fond en V à 50 000 cellules / nousll en fonction de la cytométrie de flux modèle d'acquisition.
- Pellet les cellules par centrifugation de la plaque de 96 puits à 450 g pendant 5 min et retirez délicatement le surnageant à l'aide d'une pipette multicanaux électronique ou manuel, en inclinant la plaque sur un angle et en prenant soin de ne pas aspirer le culot cellulaire.
- Incuber HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR + et les cellules HEK293 CTL pour 1 heure à température ambiante dans l'obscurité avec:
- Des dilutions en série d'anticorps primaire afin d'évaluer l'expression des antigènes de surface.
- Les échantillons de patients afin de détecter des anticorps.
- Utilisez flux approprié cytométrie contrôles de compensation, par exemple. les cellules HEK293 non transfectées non colorées, GFP + des cellules HEK293 (AF647 -), et non transfectées AF647 + cellules HEK293 (GFP).
- Laver les cellules par centrifugation à 450 xg pendant 5 min et remettre en suspension le culot cellulaire dans 170 pi de PBS / FBS. Répétez l'étape de lavage deux fois de plus.
- Incuber les cellules pendant 1 hr à température ambiante dans l'obscurité avec une dilution 1:100 d'anticorps secondaire conjugué à AF647 (anti-IgG humaine dans le sérum du patient et de l'anti-IgG de souris pour des anticorps primaires anti-NR1 ou anti-D2R).
- Laver les cellules trois fois, comme dans l'étape 3.7, et remettre en suspension dans 35 ul de PBS / FBS à cytométrie de flux des cellules acquisition.
- Mettre en place le haut débit échantillonneur (HTS) sur le cytomètre de flux (BDLSRII).
- Acquérir 10 000 événements / puits selon la cytométrie de flux modèle d'acquisition.
- Exporter, puis analyser les données pour l'analyse en utilisant une cytométrie de flux logiciel, comme FlowJo v7.5:
- Premièrement, porte les cellules vivantes HEK293 basé sur l'avant (taille) et le côté (granularité) disperse.
- En outre grille des cellules HEK293 en direct sur la base de haute GFP-positivité pour analyser seulement les cellules transfectées.
- Déterminer l'intensité moyenne de fluorescence (MFI) du canal AF647 dans les cellules GFP-positives vivants.
- Exporter des données dans Excel ou prisme d'analyse:
- Terrain concentrations d'anticorps primaire (anti-NMDAR ou un anticorps anti-D2R) par rapport à la MFI obtenues à partir des cellules incubées avec ces anticorps.
- Pour chaque échantillon de patient et contrôle, déterminer la ΔMFI en soustrayant le MFI des cellules HEK293 CTL de l'IMF de la HEK293 D2R + ou HEK293 NMDAR cellules +, respectivement.
- Calcul du seuil de positivité des anticorps par ajout de trois écarts-types au-dessus de la ΔMFI moyen de la cohorte témoin.
- échantillons individuels de parcelles regroupées en fonction de leur type de sérum sur un graphique et représentent le seuil en ligne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellules HEK293 vivre D2R + et HEK293 CTL ont été acquises à la cytométrie en flux en utilisant un échantillonneur à grand débit. Lors de l'analyse, les cellules ont été déclenchés en fonction de diffusion vers l'avant (de taille) et diffusion latérale (granularité) paramètres (Figures 1A et 1D). Des cellules HEK293 transfectées ont exprimé la molécule rapporteur, la GFP, dans le cytoplasme, et les cellules non transfectées ont été exclus de l'analyse (Figures 1B et 1E). De la GFP + grille, l'IMF associé avec un anticorps secondaire conjugué AF647-IgG anti-humaine de liaison a été mesurée (figures 1C et 1F). Afin d'éliminer la fluorescence de fond dans l'analyse de sérums humains, la ΔMFI a été calculé en soustrayant le MFI des cellules HEK293 de CTL à partir de la MFI des cellules HEK293 D2R + (figure 1G). Les données présentées sont représentatives de l'analyse des anticorps D2R, etla même stratégie de blocage et d'analyse de données peut être utilisé pour la détection d'anticorps NMDAR (données non présentées).
Détection de l'anticorps par cytométrie de flux essai cellulaire est basé sur l'expression de surface cellulaire de l'antigène d'intérêt. Comme le montre la figure 2, HEK293 NMDAR cellules + fortement exprimés NMDAR de surface (Figure 2A) et HEK293 D2R cellules + fortement exprimés D2R de surface (Figure 2B), tandis que les cellules HEK293 CTL exprimés aucun de ces antigènes (figures 2A et 2B).
Les groupes de patients utilisés dans ce travail étaient composés d'une cohorte de patients avec NMDAR encéphalite (NMDAR Enc, n = 4, une encéphalite défini par la détection de surface NMDAR sous-unité 1 NR1-anticorps 3), D2R anticorps associé à une encéphalite (D2R Enc, n = 6, une encéphalite définie par la détection de l'anticorps de surface de D2R 11), et une cohorte contrôle wid'autres maladies non inflammatoires e neurologiques (OND, n = 26), tels que l'épilepsie, accident vasculaire cérébral, et des troubles du développement ou neurodégénératives. Les échantillons de patients ont déjà été validée pour NMDAR 5 et 11 D2R IgG positivité. Les quatre patients positifs pour les anticorps NMDAR avaient un syndrome clinique typique de NMDAR encéphalite comme décrit 3 et les échantillons de sérum ont été prouvé positif en utilisant des tests à base de cellules pour les anticorps NMDAR comme décrit et disponible en usage commercial 3,4. Les six patients positifs pour les anticorps de D2R avaient un syndrome clinique typique de ganglions de la base encéphalite comme décrit 11, et des échantillons de sérum ont été prouvés positifs pour les anticorps de D2R utilisant D2R sections knock-out cerveau, les cellules transfectées, et les neurones 11.
Afin de déterminer la positivité des anticorps chez les patients, le seuil, ou seuil, des anticorps positivité a été calculée dans chaque expérience en ajoutant trois écarts-types au-dessus de l'ΔMFI des contrôles OND signifie. Les 4/4 patients avec NMDAR Enc ont été confirmés positifs pour l'anticorps humain surface NMDAR IgG (figure 3A), tandis que les 6/6 patients atteints de D2R Enc étaient positifs pour surface anticorps humain D2R IgG (figure 3B). Aucun des patients positifs étaient à double positif pour les anticorps ciblant NMDAR et D2R. Anticorps NMDAR et D2R ont été détectés dans aucun des contrôles de l'OND analysés (figures 3A et 3B). Les échantillons de patients ont été considérés comme positifs si elles étaient au-dessus du seuil dans au moins deux des trois expériences répétées.
Figure 1. Détection des anticorps par le flux à haut débit cytométrie test cellulaire:. Gating stratégie et l'analyse de données Liv cellules HEK293 e CTL et HEK293 D2R + transfectées stables ont été déclenchés en fonction de diffusion vers l'avant (FSC) et diffusion latérale (SSC) (74,7% et 68,5%, respectivement; A, D). Cellules GFP positives dans HEK293 CTL et HEK293 D2R + cellules (32,8% et 95,4%, respectivement, B, E) ont en outre été fermée à exclure non transfectées GFP - cellules (67,2% et 4,6%, respectivement, B, E). Dans les cellules GFP +, l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) associé à un anticorps secondaire conjugué AF647-anti-IgG humaine (HEK293 CTL = 3,657; HEK293 D2R + = 9128) a été mesurée (C, F). Pour des échantillons humains, l'ΔMFI a été calculé en soustrayant le MFI des cellules HEK293 de CTL à partir de celui des cellules HEK293 D2R + (G). Des données représentatives de la détection d'anticorps D2R est montré. ank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 2. Expression des récepteurs NMDA de surface et D2R déterminé par l'écoulement à débit élevé cytométrie dosage à base de cellules. HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B), et les cellules CTL HEK293 ont été colorées avec des dilutions en série d'anticorps primaire, suivie par un anticorps secondaire approprié. Expression de surface élevée de récepteurs NMDA et D2R ont été observées. MFI en corrélation avec le titre d'anticorps comme ils ont augmenté régulièrement avec des concentrations croissantes d'anticorps primaire. Comme prévu, il n'y avait pas de détection de NMDAR de surface ou dans des cellules HEK293 D2R CTL. Données représentatif est montré.blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
Figure 3. Détection confirmée d'anticorps NMDAR de surface et D2R dans une cohorte de patients. Sera de NMDAR encéphalite (NMDAR Enc, n = 4), D2R anticorps associés encéphalite (D2R Enc, n = 6) des patients, ou les contrôles avec d'autres maladies neurologiques (OND , n = 26 ou 24) ont été incubés avec des cellules HEK293 en direct NMDAR +, HEK293 D2R +, et les cellules HEK293 CTL, suivi par un anticorps secondaire anti-IgG humaines conjugué à AF647. anticorps NMDAR de surface et D2R ont été détectés dans le sérum de 4/4 patients NMDAR Enc (A) et 6/6 patients D2R Enc (B), respectivement, alors qu'aucun des contrôles de l'OND (0/26 ou 0/24) avaient soit anticorps (A, B). Dotted lignes graphiques représentent le seuil de positivité calculé par l'ajout de trois écarts-types de la moyenne des contrôles ΔMFI OND. Tracés de points représentatifs sur trois expériences sont présentés. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cet article décrit une nouvelle application de la cytométrie de flux essai à base de cellules en direct pour détecter les anticorps ciblant les protéines spécifiques de neurones de la surface de la cellule à l'aide d'un échantillonneur à haut débit. Grâce à cette technique, nous signaler qu'un sous-groupe de patients atteints de maladies auto-immunes du système nerveux central ont des anticorps sériques à la surface ou à la surface NMDAR D2R.
Les étapes essentielles pour une détection optimale d'anticorps à l'aide de ce flux à haut débit cytométrie de dosage à base de cellules en temps réel comprennent: 1) l'obtention d'un rendement élevé de cellules transfectées en bonne santé, 2) la vérification de l'expression de surface cellulaire élevée de l'antigène d'intérêt, 3) l'établissement d'un seuil d'anticorps positivité à l'aide d'une cohorte de contrôles, 4) et la confirmation de la reproductibilité des données.
La culture de cellules saines est essentielle à la réussite de cette technique. Cellules HEK293 sont bien connus pour leur facilité de culture, une grande efficacité de la transfection, et leur manque d'expression de neuronesprotéines, ce qui explique pourquoi ils ont été couramment utilisés dans des essais cellulaires pour détecter les anticorps dirigés contre des antigènes neuronaux spécifiques 4,5,8-10. Un taux de transfection optimale pour acquérir un pourcentage élevé de cellules vivantes de la GFP + est critique pour ce dosage pour calculer avec précision MFI. Pour cette raison, la production d'une lignée cellulaire stable polyclonaux de la GFP + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R +, ou HEK293 CTL cellules est avantageuse car elle offre un niveau uniforme et élevé de cellules GFP +, avec la commodité de ne pas avoir à plusieurs reprises cellules transfecter avant chaque expérience. Une visualisation rapide des cellules transfectées par un microscope inversé est recommandé de vérifier les cellules saines (cellules GFP + seront fluorescence si lampe à mercure est disponible). Si la viabilité semble pas si élevé, il peut être avantageux d'utiliser un colorant de viabilité, comme 7-amino-actinomycine D, avant l'acquisition de la cellule au cytomètre de flux et d'ajouter une étape de déclenchement supplémentaire dans les analysest à exclure les cellules non viables.
Dans les maladies auto-immunes du système nerveux central, des anticorps qui se lient aux domaines extracellulaires des antigènes de cerveau sont considérées comme 2,3,7,13,14 pathogène, par conséquent, l'accent est mis sur la détection d'anticorps en utilisant des cellules vivantes et non perméabilisés. Ce protocole atteint cet objectif en utilisant des cellules transfectées exprimant des antigènes de surface. Par conséquent, l'exportation correcte de ces antigènes à la surface doit être déterminée par la coloration des cellules transfectées avec des dilutions en série d'un anticorps primaire commercial contre l'antigène d'intérêt. Lors de l'évaluation du niveau d'expression de l'antigène de surface sur des cellules non perméabilisés, il est essentiel d'utiliser un anticorps ciblant un épitope extracellulaire de la protéine. Si un anticorps spécifique n'est pas disponible, il peut être nécessaire d'ajouter une étiquette sur un domaine extracellulaire de l'antigène, et d'utiliser par la suite, un anticorps contre l'étiquette du commerce pour déterminer l'expression de surface. Nous avons avec succèsutilisé cette approche en utilisant une D2R hémagglutinine-étiqueté et exclu immunoréactivité des sérums de patients à la balise elle-même 11. Il est également essentiel que la séquence d'ADNc complète de l'antigène d'intérêt est sous-cloné dans un vecteur approprié de sorte que l'expression et l'intégrité structurelle de la membrane cellulaire n'est pas compromise. En effet, il a été montré précédemment que des domaines particuliers de la protéine de récepteur sont essentielles pour le repliement, l'exportation, et l'intégration correcte dans la membrane de la cellule 18.
En cytométrie en flux dosages cellulaires, évaluer anticorps positivité des sérums de patients dans chaque expérience repose sur la mise en place d'un seuil, ou seuil, dérivé d'une cohorte de contrôles. Zhou et al. 19 calculé un seuil de positivité des anticorps par l'ajout de deux écarts-types au-dessus de l'intensité moyenne de fluorescence Δmedian, et ce environ correspondait aux 95 e percentile de la gamme de contrôle sain. Dansnos études précédentes, nous avons opté pour un seuil supérieur (plus de trois écarts-types à la moyenne Δ IMF de la cohorte témoin), ce qui correspond aux 99 e percentile de la gamme de contrôle sain 11,20. En outre, McLaughlin et al. 16 a choisi d'exprimer la mesure de la réactivité d'anticorps spécifique comme le rapport de MFI entre les cellules exprimant l'antigène et des cellules présentatrices d'antigène-négatives. Un rapport supérieur à 5 a été considérée comme positive et correspond à trois écarts-types au-dessus rapport moyen des commandes, qui est similaire à notre travail. L'utilisation d'un seuil plus élevé augmente la rigueur du protocole et améliore la discrimination entre les contrôles et les patients positifs pour les anticorps. Il est important, dans notre expérience, la réactivité des anticorps de la gamme de contrôle sain n'était pas significativement différente de la plage de l'OND, permettant l'utilisation de deux populations de Calculate le seuil de positivité des anticorps 11,20.
Comme dans toutes les expériences de recherche, la reproductibilité des données est primordiale. Les sérums des patients sont considérés comme positifs pour les anticorps contre un antigène spécifique des neurones, si elles sont au-dessus du seuil de positivité d'au moins deux des trois expériences indépendantes. Patients ont des concentrations d'IgG variant dans leur sérum. Ces variations peuvent avoir une influence sur le niveau de liaison de l'anticorps, par rapport à d'autres patients. Tous les sérums des patients utilisés dans notre étude précédente a été mesurée par néphélométrie et s'est révélée être dans la plage normale (6,2 à 14,4 g / L) 11 et on dilue les sérums toujours avec le même facteur de dilution. L'établissement d'une courbe de titrage du sérum individu pourrait être bénéfique afin de comparer les concentrations d'anticorps entre les patients. En outre, l'aveuglement de l'enquêteur est recommandée lors de dosage à base de cellules, mais les contrôles doivent être ouverte dans le but de calculer la positseuil de ivité.
Lorsqu'une cible d'anticorps plausible est trouvée, la validation approprié est nécessaire pour éviter de faux positifs. échantillons d'anticorps positif ou négatif-détectées en utilisant la cytométrie en flux essai à base de cellules doivent être analysés en utilisant une autre méthode qui de préférence ne pas utiliser des antigènes dénaturés ou linéarisés. Par exemple, une diminution de l'immunoréactivité sur des coupes de cerveau des animaux knock-out spécifique de l'antigène a été démontré avec succès dans le cas de plusieurs CNS nouvellement signalé auto-antigènes 9-11,21. Immunoabsorption de sérums de patients sur les cellules exprimant l'antigène ont également été utilisés pour valider les résultats 9,11.
La cytométrie de flux de protocole de dosage à base de cellules décrits dans le présent document peut être facilement modifié afin d'évaluer la spécificité des anticorps à une multitude de cibles antigéniques, y compris celles à l'extérieur du système nerveux central. Il est probable que des anticorps d'autres spécificités inconnus existent et sont encore à êtreidentifié. De plus, cette technique est adaptée pour détecter les différentes classes et sous-classes d'Ig, y compris les IgM, comme montré dans nos études antérieures 11,20. La détermination de la sous-classe IgG peut également révéler le potentiel de contribuer à la pathogenèse de la maladie. Par exemple IgG1 ou IgG3 sont capables de médier la cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps ou cytotoxicité dépendante du complément, qui sont déclarés mécanismes de pathogénicité induite auto-anticorps 14,20,22. Les colorants fluorescents autres que AF647 (rouge lointain) peuvent également être utilisés tant qu'ils ont assez éloignée de celle de la molécule de rapporteur, la GFP pics d'émission. Toute spectres d'émission se chevauchent doit avoir des exigences de rémunération correctes. Détermination de la spécificité d'un anticorps à une protéine intracellulaire serait également possible en utilisant la cytométrie en flux, bien que, les cellules doivent d'abord être fixées et perméabilisées pour rendre l'antigène disponible pour la liaison d'anticorps. Cette technique alternative peut entraîner une forte backgroue en raison de l'exposition des anticorps à domaines intracellulaires ainsi que de nombreux antigènes cellulaires, qui ont été masqués par ailleurs dans des cellules vivantes non perméabilisés. Ces facteurs de confusion peuvent réduire la résistance de la cytométrie de flux dosage à base de cellules et des contrôles appropriés doivent être effectuées en conséquence.
L'utilisation d'un courant à haut débit cytométrie dosage à base de cellules fournit un procédé fiable et précis pour la détection d'anticorps dans le sérum humain à partir de grandes cohortes de patients. Découvrir de nouveaux anticorps supplémentaires par le biais de cette technique permettra le diagnostic et les traitements futurs des patients atteints de maladies auto-immunes du système nerveux central.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Conflit d'intérêts: Un brevet a été déposé par FB et le RCD (Université de Sydney) affirmant D2R comme cible pour les auto-anticorps.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Santé et paramédical Conseil national australien de recherche, Fondation scientifique Star (Australie), Association syndrome de la Tourette (USA), La sclérose en plaques Fondation pour la recherche et Trish sclérose en plaques Research Australia, Fondation Petre (Australie), Rebecca L. Fondation Cooper Medical Research (Australie). Nous remercions tous les patients et les membres de la famille qui ont fourni des échantillons pour notre étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
