Summary
In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.
Abstract
In den letzten Jahren haben sich Antikörper gegen Oberflächenproteine und Konformationsänderungen in der Neurotransmission im ZNS Autoimmunerkrankungen bei Kindern und Erwachsenen nachgewiesen. Diese Antikörper wurden verwendet, um die Diagnose und Behandlung zu führen. Zellbasierte Assays zum Nachweis von Antikörpern in Patientenserum verbessert. Sie werden auf der Oberflächenexpression von Gehirn-Antigene auf eukaryotische Zellen, die dann mit verdünntem Patientenserum, gefolgt von Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörper inkubiert basiert. Nach dem Waschen wird sekundären Antikörperbindung dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Unsere Gruppe hat ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie Live zellbasierten Assay entwickelt, um Antikörper gegen bestimmte zuverlässig erkennen Neurotransmitter-Rezeptoren. Diese Durchflusszytometrie Verfahren ist unkompliziert, quantitative, effizient, und die Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer System ermöglicht vielen Patienten auf einfache Weise in kurzer Zeit untersucht werden. Außerdem ist diese Zellbasis alssagen kann leicht angepasst, um Antikörper gegen verschiedene antigene Ziele zu erfassen, die beide aus dem zentralen Nervensystem und der Peripherie werden. Entdecken zusätzliche neue Antikörper Biomarker ermöglicht die schnelle und genaue Diagnose und Behandlung zu verbessern von immunvermittelten Erkrankungen.
Introduction
In den letzten Jahren haben die Autoimmun Formen des zentralen Nervensystems (ZNS) identifiziert worden. Es hat sich gezeigt, dass diese Krankheiten assoziiert sind und durch die Anwesenheit von Autoantikörpern definiert. Diese Antikörper binden an neuronale Rezeptoren oder synaptische Proteine in 1,2 Neurotransmission beteiligt ist. Unterschiedliche Antigene erkannt wurden, wie N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDAR) 3-5, γ-Aminobuttersäure-Rezeptor (GABA)-Rezeptor 6, α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic (AMPA)-Rezeptor 7, spannungsabhängigen Kaliumkanals (VGKC) assoziierte Proteine: Leucin-reichen Gliom-aktivierte Protein-1 (LGL-1) und Contactin-assoziiertes Protein 2 (capsr2) 8,9-, Glutamat-Rezeptor 5,10 und Dopamin-2-Rezeptor (D2R) 11. In der Vergangenheit waren diese Autoimmun ZNS-Störungen (vor allem genannt Enzephalitis) oft nicht diagnostiziert und unbehandelt. Diese neuartigen Antikörper Biomarker, z. B.NMDAR Antikörper oder Antikörper D2R, haben wesentlich verbesserte Diagnose und Bewusstsein und haben die Behandlungsmöglichkeiten für Patienten eröffnet. In der Tat ist eine frühzeitige Behandlung mit Immuntherapien mit verbesserten Ergebnis 11,12 verbunden.
Traditionelle Verfahren, um Antikörper, wie Enzym-Immunoassay (ELISA) und Western-Blot erkennen sind zum Nachweis von Antikörpern in Seren eingesetzt. Sie sind jedoch nicht ohne weiteres zu ermöglichen Erkennung von extrazellulären Oberfläche oder Epitope und vielmehr kann die Immunreaktivität gegen ein intrazelluläres Epitop zeigen. Weiterhin Antikörper, die an die extrazelluläre Domäne von wichtigen Proteinen bei der Neurotransmission beteiligt sind, binden wahrscheinlich pathogenen 2,3,7,13,14 sein. Daher ist die Entwicklung von genauen und empfindlichen Assays zu relevanten Zelloberfläche oder der extrazellulären Antikörperzielen bei Patienten entdecken, von größter Bedeutung. Der Goldstandard-Methode im Bereich basiert auf der Verwendung von lebenden Zellen basieren, in so genannten "Zelle-based-Tests ". Dieses Verfahren umfasst die Expression eines Antigens auf der Oberfläche von Säugerzellen (meistens menschliche embryonale Nieren-293 (HEK293-Zellen)) in seiner nativen Form durch Transfektion von Vektoren, die die vollständige cDNA-Sequenz des Antigens von Interesse. Live nonpermeabilized Zellen werden dann mit verdünntem Patientenserum inkubiert, gefolgt von Fluorochrom-konjugierten Anti-Human-Immunglobulin (Ig)-sekundären Antikörper. Die Intensität oder Fluoreszenzgrad wird dann festgestellt und in der Ebene der Autoantikörper-Bindung verbunden sind. Dieses Verfahren ist spezifisch, da nur ein Antigen in Zellen überexprimiert. Die am weitesten verbreitete "read-out" hat nach Immunzytochemie 4,5,8-10 gewesen konfokalen Mikroskopie-Analyse. Jedoch Durchflusszytometrie zellbasierten Assays wurden erfolgreich verwendet, um Antikörper in Patienten mit demyelinisierenden Erkrankungen 15-17 erfassen. Insbesondere Waters et al. 15 Vergleich der Antikörpernachweis unter Verwendung einer Pfanneel des Antikörper-Nachweistechniken, einschließlich Tests auf Zellbasis, gefolgt von Mikroskopie oder Durchflusszytometrie analysiert, und hat gezeigt, Durchflusszytometrie Assay auf Zellbasis, um die empfindlichen, genauen und zuverlässigen Methode. Daher ist die Durchflusszytometrie zellbasierten Assay vorteilhaft, wie es ist quantitativ, nicht Prüfer abhängig, und jede Verwendung von radioaktivem Material nicht um. Es ist auch praktisch, da es ermöglicht vielen Patienten, in einer kurzen Zeit untersucht werden.
In jüngerer Zeit haben wir ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie-Assay auf Zellbasis, um NMDAR Antikörper und D2R-Antikörper in Patienten mit Autoimmunerkrankungen CNS 11 zu erfassen optimiert. Unsere Gruppe vor kurzem erkannt NMDAR Antikörper in Patientenproben mit Durchflusszytometrie zellbasierte Assays. Diese NMDAR Antikörper-positiven Seren wurden zuvor mittels konfokaler Mikroskopie analysiert und ebenfalls als positive 11 zu sein. Dieses Protokoll beschreibt einen Durchflusszytometrie Zellen basierender Test für den Nachweis von conformation empfindlichen ZNS-Antikörper in Patientenserum Verwendung eines automatisierten Hochdurchsatz-Sampler.
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Protocol
1. Subklonierung Strategie zur pIRES2-EGFP Vektor Encoding D2R oder NMDAR Construct
- Erhalten vollständigen cDNA-Klon des menschlichen D2R oder NMDAR-Untereinheit 1 (NR1).
- Wähle einen Expressionsvektor, wie pIRES2-EGFP, die für die Expression des Transmembranproteine mit Enhanced Green Fluorescent Protein (GFP)-Reporter unter der Kontrolle einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES), so dass die beiden Antigene und GFP in koexprimiert werden Zellen getrennt.
- Subklonieren menschlichen cDNA innerhalb pIRES2-EGFP-Vektor.
- Um subklonieren cDNA, entsprechende Restriktionsenzymen (zB NheI und XhoI Menschen D2R cDNA).
- Ligats Schnitt cDNA-Insert in eingeschränkten pIRES2-EGFP-Vektor.
- Sequenz ligiert pIRES2-EGFP D2R oder NMDAR Vektor zu überprüfen, ob der Vektor der richtigen Reihenfolge enthält.
- Entschlacken und verstärken pIRES2-EGFP D2R oder NMDAR Vektor für die spätere Verwendung in der Transfektion.
- Kultur HEK293-Zellen in Gewebekulturflaschen mit frischem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (1 ×) (DMEM) komplett mit 4,5 g / l D-Glucose, L-Glutamin und 110 mg / l Natriumpyruvat, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 2 mM Glutamax und 50 ug / ml Gentamicin.
- Nehmen HEK293-Zellen unter Verwendung von Trypsin und Transfer zu einem konischen Rohr.
- Waschen Zellen durch Zentrifugieren bei 250 g für 6 min und Zellpellet in frischem Komplett DMEM.
- Zählen Sie die Zellen und Saatgut 6-Well-Platten bei etwa 8 x 10 5 Zellen / Vertiefung und die Kultur über Nacht in 2 ml DMEM bei 37 ° C und 5% CO 2 im Brutschrank.
- Nachdem sie etwa 70% Konfluenz erreicht haben, zu transfizieren die HEK293-Zellen mit pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR +-Zellen), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R +-Zellen) und pIRES2-EGFP (HEK293 CTL-Zellen; Vektorregelung) wie folgt.Halten Sie einige nicht-transfizierten HEK293-Zellen für die Entschädigung später.
- Bereiten Sie das erforderliche Volumen der Transfektion Mischung, die 2,5 ug DNA wurden 200 ul 0,9% Natriumchlorid und 4 g / ml Polyethylenimin / gut (jeweils 2 ml frisches Voll DMEM).
- Unmittelbar verwirbeln die Mischung für 10 sec und bei Raumtemperatur (RT) für 10 min, bevor Volumen der Transfektion Mischung in die entsprechenden Vertiefungen.
- Die Platte, wickeln Sie die Seiten mit Parafilm und Zentrifugieren bei 280 g für 5 min zur Transfektion von Zellen unterstützen.
- Entfernen der Parafilm und dann im Inkubator setzen die Kultur bei 37 ° C.
- 18 Stunden später ersetzen Kulturmedien mit frischen kompletten DMEM und pflegen in einer anderen Kultur für 72 Stunden.
- Optional: 72 Stunden nach der Transfektion transfiziert Zellen durch Kultur in komplettem DMEM mit 250 ug / ml Geneticin ergänzt ausgewählt werden, um einen polyklonalen stabilen Transfektanten zu erhalten.
- Lösen HEK293 NMDAR + HEK293 + D2R und HEK293 CTL-Zellen durch Inkubation mit 500 &mgr; l / Vertiefung Versene für ca. 5 min bei 37 ° C.
- Resuspendieren in 2ml/well PBS (Ca-2 + / Mg 2 +) mit 2% FBS (PBS / FBS) und die Lösung in einen 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen ergänzt.
- Waschen der Zellen durch Zentrifugation bei 250 x g für 6 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 15-50 ml PBS / FBS. Wiederholen Wasch 2x.
- Zählen Sie die Zellen und dann in PBS / FBS Resuspendieren in 1 x 10 6 Zellen / ml.
- Entwerfen Sie die 96-Loch-Vorlage für die Durchflusszytometrie Erwerb, bedenkt, dass HEK293 D2R + oder HEK293 NMDAR + Zellen sowie HEK293 CTL-Zellen müssen mit jeder Patientenprobe oder primären Antikörper inkubiert werden.
- Samenzellen in einem V-Boden, Platte mit 96 Vertiefungen mit 50.000 Zellen / well nach der Durchflusszytometrie Erfassungsschablone.
- Pellet die Zellen durch Zentrifugieren der 96-Well-Platte bei 450 xg für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit Hilfe eines elektronischen oder manuellen Mehrkanalpipette, Kippen der Platte auf einem Winkel und kümmert sich nicht um das Zellpellet abzusaugen.
- Inkubieren HEK293 D2R + HEK293 + NMDAR und HEK293-Zellen, CTL für 1 h bei RT im Dunkeln mit:
- Serielle Verdünnungen des primären Antikörpers, um Antigen-Oberflächenexpression zu beurteilen.
- Patientenproben, um Antikörper zu erkennen.
- Verwenden Sie geeignete Durchflusszytometrie Kompensationskontrollen, zB. ungefärbten transfizierten HEK293-Zellen, HEK293-Zellen GFP + (AF647 -) und nicht-transfizierte HEK293-Zellen AF647 + (GFP).
- Waschen der Zellen durch Zentrifugation bei 450 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 170 &mgr; l PBS / FBS. Wiederholen Waschschritt noch zweimal.
- Zellen Inkubation für 1 hr bei RT im Dunkeln mit 1:100-Verdünnung von AF647-konjugierten sekundären Antikörper (Anti-Human-IgG für Patientenserum und Anti-Maus-IgG-anti-NR1-oder Anti-D2R primäre Antikörper).
- Dreimal Waschen Sie die Zellen, wie in Schritt 3.7, und resuspendieren in 35 ul PBS / FBS für die Durchflusszytometrie Zell Akquisition.
- Die Hochdurchsatz-Sampler (HTS) auf dem Durchflusszytometer (BDLSRII) ein.
- Erwerben 10.000 Events / Well nach der Durchflusszytometrie Erwerb Vorlage.
- Export und Analyse von Daten für die Analyse unter Verwendung einer Durchflusszytometrie-Software-Paket, wie FlowJo v7.5:
- Zunächst Tor die Live-HEK293-Zellen auf Basis von vorne (Größe) und Seite (Granularität), der zerstreut.
- Weitere Live-Gate HEK293-Zellen auf der Grundlage hoher GFP-Positivität, nur die transfizierten Zellen zu analysieren.
- Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der AF647 Kanal innerhalb der Live GFP-positiven Zellen.
- Exportieren von Daten in Excel oder Prism für die Analyse:
- Grundstück concentrations des primären Antikörpers (anti-NMDAR oder Anti D2R-Antikörper) gegen den MFI erhalten aus den Zellen mit diesen Antikörpern inkubiert.
- Für jeden Patienten und Kontrollprobe, bestimmen die ΔMFI durch Subtrahieren der MFI des CTL HEK293 Zellen aus der MFI des HEK293 D2R + + NMDAR oder HEK293 Zellen.
- Berechnen Sie die Schwelle von Antikörper-Positivität von über dem Mittelwert ΔMFI des Steuer Kohorte um drei Standardabweichungen.
- Grundstück einzelnen Proben nach ihren Serum Typ gruppiert in einem Diagramm darstellen und die Schwelle als eine Zeile.
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Representative Results
Leben HEK293 D2R + CTL und HEK293-Zellen wurden mit dem Durchflußzytometer unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer erworben. Bei der Analyse wurden die Zellen auf Basis von Vorwärtsstreuung (Größe) und Seitenstreuung (Granularität) Parameter (1A und 1D) verknüpft. HEK293-Zellen das Reportermolekül, GFP, im Zytoplasma und nicht transfizierten Zellen wurden von der Analyse (Fig. 1B und 1E) ausgeschlossen. Innerhalb der GFP +-Gate wurde die MFI mit AF647-konjugierten Anti-Human-IgG-Sekundärantikörperbindung zugeordnet (Figuren 1C und 1F) gemessen. Um die Hintergrundfluoreszenz bei der Analyse humaner Seren beseitigen, wurde die ΔMFI durch Subtrahieren der MFI des CTL HEK293-Zellen aus dem MFI der HEK293 D2R + Zellen (Fig. 1G) berechnet. Gezeigten Daten repräsentieren D2R Antikörper Analyse unddie gleiche Gate-Strategie und die Datenanalyse für NMDAR Antikörper-Nachweis (Daten nicht gezeigt) verwendet werden.
Antikörper Detektion durch Durchflusszytometrie zellbasierten Assay basiert auf der Zelloberflächenexpression des Antigens von Interesse basiert. Wie in Fig. 2 gezeigt, HEK293 NMDAR + Zellen stark exprimiert NMDAR Fläche (2A) und HEK293 D2R + Zellen stark oberflächen D2R (2B) exprimiert, während CTL HEK293 Zellen exprimiert wird keines dieser Antigene (Fig. 2A und 2B).
Die Patientengruppen, die in dieser Arbeit verwendet wurde, bestand aus einem Patientenkollektiv mit NMDAR Enzephalitis (NMDAR Enc, n = 4, eine Enzephalitis durch den Nachweis von Oberflächen NMDAR-1-Untereinheit-Antikörper-NR1 3 definiert), D2R Antikörper-assoziierte Enzephalitis (D2R Enc, n = 6, eine Enzephalitis durch den Nachweis von Oberflächenantikörpers D2R 11) und eine Steuer Kohorte with andere entzündliche neurologische Erkrankungen (OND, n = 26), wie Epilepsie, Schlaganfall und Entwicklungs-oder neurodegenerativen Erkrankungen. Patientenproben wurden zuvor für NMDAR 5 und 11 D2R IgG Positivität validiert. Die vier positiv für Antikörper NMDAR Patienten hatten eine typische klinische Syndrom der NMDAR Enzephalitis wie beschrieben 3 und Serumproben wurden unter Verwendung von bewährten positiven Tests auf Zellbasis zur NMDAR-Antikörper, wie beschrieben und im kommerziellen Gebrauch 3,4. Die sechs positiv für Antikörper D2R Patienten hatten eine typische klinische Syndrom der Basalganglien Enzephalitis, wie beschrieben, 11, und Serumproben nachgewiesen wurden positiv für D2R Antikörper mit D2R Knock-out-Gehirnschnitte, transfizierten Zellen und Neuronen 11.
Um positiver Antikörper bei Patienten zu bestimmen, wurde die Schwelle oder Cutoff, der Antikörper-Positivität in jedem Experiment von oben die Zugabe von drei Standardabweichungen berechnetbedeuten ΔMFI der OND Kontrollen. Die 4/4 Patienten mit NMDAR Enc wurden bestätigt positive Menschen Oberfläche NMDAR IgG-Antikörper (3A), während die 6/6 Patienten mit D2R Enc waren positiv für den menschlichen Oberfläche D2R IgG-Antikörper (3B). Keiner der Patienten waren positiv für Antikörper gegen NMDAR und D2R doppelt positiv. NMDAR und D2R-Antikörper wurden in einem OND Kontrollen analysiert nachgewiesen (3A und 3B). Patientenproben wurden als positiv betrachtet, wenn sie über dem Schwellenwert in mindestens zwei von drei wiederholten Experimenten.
Fig. 1 ist. Nachweis von Antikörper durch Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay:. Gating-Strategie und die Datenanalyse Liv E HEK293-Zellen und CTL HEK293 D2R + stabile Transfektanten wurden basierend auf Vorwärtsstreuung (FSC) und Seitenstreuung (SSC) (, A, D 74,7% und 68,5%, beziehungsweise) verknüpft. GFP-positive Zellen in HEK293 CTL und HEK293 D2R +-Zellen (32,8% und 95,4%, bzw., B, E) wurden weiter gated zu untransfizierten GFP auszuschließen - Zellen (67,2% und 4,6%, bzw., B, E). Innerhalb der GFP +-Zellen, die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) mit AF647-konjugierten Anti-Human-IgG-Sekundärantikörpers assoziiert (HEK293 CTL = 3.657; HEK293 D2R + = 9,128) gemessen (C, F). Humanproben wurde die ΔMFI durch Subtrahieren der MFI des CTL HEK293-Zellen von der der HEK293 D2R +-Zellen (G) berechnet. Repräsentative Daten D2R Antikörper-Nachweis gezeigt. ank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
2. Expression von Oberflächen NMDAR und D2R von Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay bestimmt. HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B) und HEK293 CTL-Zellen wurden mit seriellen Verdünnungen des primären Antikörpers, gefolgt von einem geeigneten sekundären Antikörper gefärbt. Hohe Oberflächenexpression von NMDAR und D2R beobachtet. MFI-Werte mit Antikörpertiter korreliert, da sie ständig mit steigenden Konzentrationen des primären Antikörpers erhöht. Wie erwartet, gab es keinen Nachweis von Oberflächen NMDAR oder D2R in HEK293 CTL-Zellen. Repräsentative Daten gezeigt.blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.
3. Bestätigt Nachweis von Oberflächen NMDAR und D2R-Antikörpern in einer Kohorte von Patienten. Seren von NMDAR-Enzephalitis (NMDAR Enc, n = 4), D2R Antikörper-assoziierte Enzephalitis (D2R Enc, n = 6) Patienten oder Kontrollen mit anderen neurologischen Krankheiten (OND , n = 26 oder 24) wurden mit lebenden HEK293 NMDAR + HEK293 + D2R und HEK293 CTL-Zellen inkubiert, gefolgt von AF647-konjugierten Anti-Human-IgG-Sekundärantikörpers. Oberflächen NMDAR und D2R-Antikörper wurden im Serum von 4/4 NMDAR Enc Patienten (A) und 6/6 D2R Enc Patienten (B), detektiert, während keiner der OND Kontrollen (0/26 oder 0/24) hatten entweder Antikörper (A, B). Dotted Linien auf Graphen stellen die Positivität Schwelle durch Zugabe von drei Standardabweichungen um den Mittelwert von ΔMFI OND Kontrollen berechnet. Repräsentative Dot-Plots von drei Experimenten gezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .
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Discussion
Dieser Aufsatz beschreibt eine neuartige Anwendung der Durchflusszytometrie Live-Assay auf Zellbasis, um Antikörper, die gegen spezifische Zelloberflächen neuronale Proteine unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer erfassen. Mit dieser Technik berichten wir, dass eine Untergruppe von Patienten mit Autoimmun ZNS-Erkrankungen betroffen sind, Serum-Antikörper an die Oberfläche oder in Oberflächen NMDAR D2R.
Wesentliche Schritte für eine optimale Antikörpernachweis unter Verwendung dieses Hochdurch Durchflusszytometrie Live-Assay auf Zellbasis, umfassen 1) eine hohe Ausbeute von gesunden Zellen transfiziert, 2) Verifizieren hohen Zelloberflächen-Expression des Antigens von Interesse, 3) zur Festlegung eines Schwellen von Antikörper Positivität mit einer Gruppe von Steuerelementen, 4) und zur Bestätigung der Reproduzierbarkeit der Daten.
Die Kultur von gesunden Zellen ist grundlegend für den Erfolg dieser Technik. HEK293-Zellen sind für die Leichtigkeit der Kultur hohe Transfektionseffizienz und die fehlende Expression von neuronalen bekannteProteine, weshalb sie wurden häufig in zellbasierten Assays verwendet werden, um Antikörper gegen spezifische neuronale Antigene 4,5,8-10 zu erkennen. Eine optimale Transfektionsrate, einen hohen Prozentsatz von lebenden GFP +-Zellen erhalten ist entscheidend für diesen Test zur genauen Berechnung MFI. Aus diesem Grund ist von Vorteil, die Herstellung eines polyklonalen stabile Zelllinie von GFP + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + oder HEK293 CTL-Zellen, da sie eine gleichbleibend hohe Niveau der GFP +-Zellen, mit dem zusätzlichen Komfort nicht wiederholt Transfektion von Zellen vor, die jedes Experiment. Eine kurze Betrachtung der transfizierten Zellen durch eine inverse Mikroskop wird empfohlen, für gesunde Zellen (GFP +-Zellen fluoreszieren, wenn Quecksilberlampe ist vorhanden) zu überprüfen. Wenn Fähigkeit scheint nicht so hoch ist, kann es vorteilhaft sein, einen Sanierungs Farbstoff wie 7-Amino-Actinomycin D, vor der Zellerfassung am Durchflusszytometer zu verwenden und eine zusätzliche Gating-Schritt in den analys hinzufügenist es, nicht lebensfähigen Zellen auszuschließen.
Autoimmuner Erkrankungen des ZNS, sind Antikörper, die an extrazellulären Domänen von Gehirnantigene binden vermutlich pathogen 2,3,7,13,14 sein, damit Betonung auf dem Nachweis von Antikörpern unter Verwendung von lebenden Zellen und nonpermeabilized platziert. Dieses Protokoll erreicht dieses Ziel durch Verwendung von transfizierten Zellen, die Oberflächenantigene. Daher ist die korrekte Export dieser Antigene an der Oberfläche muss durch die Färbung von transfizierten Zellen mit seriellen Verdünnungen von einer kommerziellen primären Antikörper gegen das Antigen von Interesse bestimmt werden. Bei der Beurteilung der Höhe der Expression des Oberflächenantigens auf nonpermeabilized Zellen ist es wichtig, einen Antikörper, der ein extrazelluläres Epitop des Proteins verwenden. Wenn ein spezifischer Antikörper nicht verfügbar ist, kann es notwendig sein, um einen Tag auf einer extrazellulären Domäne des Antigens hinzuzufügen, und danach mit einem kommerziellen Antikörper gegen das Tag, um die Oberflächenexpression zu bestimmen. Wir haben erfolgreichverwendet diesen Ansatz mit einem Hämagglutinin-markierten D2R und ausgeschlossen Immunreaktivität von Patientenproben mit dem Tag selbst 11. Es ist auch wichtig, daß die gesamte cDNA-Sequenz des Antigens von Interesse in einen geeigneten Vektor subkloniert, so dass die Expression und die strukturelle Integrität an der Zellmembran nicht beeinträchtigt wird. Tatsächlich wurde bereits gezeigt, dass bestimmte Domänen eines Rezeptor-Protein sind für die korrekte Faltung, Export, und Integration in die Zellmembran 18.
In der Durchflusszytometrie zellbasierte Assays, die Beurteilung Antikörper-Positivität der Patientenproben in jedem Experiment stützt sich auf die Errichtung einer Schwelle oder Cutoff, aus einer Kohorte von Kontrollen ab. Zhou et al. Berechnet 19 einen Schwellenwert von Antikörper-Positivität durch Hinzufügen von zwei Standardabweichungen über dem Mittelwert Δmedian Fluoreszenz-Intensität, und das entsprach in etwa der 95. Perzentile der gesunden Kontrollbereich. Inunseren früheren Studien haben wir uns für eine höhere Grenz (Zugabe von drei Standardabweichungen um den Mittelwert Δ MFI des Steuer Kohorte), die der 99-Perzentil der gesunden Kontrollbereich 11,20 entsprach. Zusätzlich McLaughlin et al. 16 gewählt, um die Messung der spezifischen Antikörperreaktivität als Verhältnis MFI zwischen den Antigen-exprimierenden Zellen und Antigen-negative Zellen zu exprimieren. Ein Verhältnis von größer als 5 wurde als positiv und entsprachen drei Standardabweichungen über dem mittleren Verhältnis von Kontrollen, die ähnlich unserer Arbeit ist. Verwendung einer höheren Schwelle erhöht die Stringenz des Protokolls und verbessert die Unterscheidung zwischen Kontrollen und Patienten positiv für Antikörper. Wichtig ist, nach unserer Erfahrung der Antikörper Reaktivität der gesunden Kontrollbereich war nicht signifikant anders als die OND Bereich, so dass die Verwendung von entweder Bevölkerung kalkulierte die Schwelle von Antikörper-Positivität 11,20.
Wie in allen Forschungsexperimente ist die Daten Reproduzierbarkeit von größter Bedeutung. Patienten-Seren werden als positiv für Antikörper gegen ein Antigen spezifischen neuronalen wenn sie die Schwelle von Positivität in mindestens zwei von drei unabhängigen Experimenten. Einzelne Patienten wurden variierende Konzentrationen von IgG im Serum. Diese Variationen können einen Einfluss auf das Niveau der Antikörperbindung im Vergleich zu anderen Patienten. Alle Patientenproben in unserer vorherigen Studie verwendet wurden durch Nephelometrie gemessen und im normalen Bereich (6,2 bis 14,4 g / L) 11, und wir immer Seren mit dem gleichen Verdünnungsfaktor verdünnt. Die Schaffung eines Titerkurve einzelner Serum könnte nützlich, um Konzentrationen von Antikörpern zwischen Patienten zu vergleichen. Zusätzlich wird die anfängliche Blendung des Prüfers während der zellbasierten Assay empfohlen, aber Kontrollen müssen, um die Setzung berechnen unblinded werdenduktivität Schwelle.
Wenn eine plausible Ziel Antikörper gefunden, wird entsprechende Validierung erforderlich, um falsche Positivität zu verhindern. Verwendung der erfassten Durchflusszytometrie zellbasierten Assay-Antikörper-positiven oder-negativen Proben unter Verwendung eines alternativen Methode, die vorzugsweise nicht denaturiert oder linearisierte Antigene verwenden würde getestet werden. Zum Beispiel verringerte Immunreaktivität auf Hirnschnitte von Antigen-spezifischen Knock-Out Tieren wurde erfolgreich bei der mehrere neu gemeldeten ZNS gezeigt Autoantigene 9-11,21. Immunabsorption von Patientenseren auf Antigen-exprimierenden Zellen wurden auch verwendet, um Ergebnisse zu bestätigen 9,11.
Die Durchflusszytometrie auf Zellbasis in diesem Papier beschriebenen Testprotokoll können leicht geändert werden, um die Antikörperspezifität zu einer Vielzahl von unterschiedlichen antigenen Ziele, auch außerhalb des ZNS zu beurteilen. Es ist wahrscheinlich, daß Antikörper anderer unbekannter Spezifität vorhanden sind und noch zu seinidentifiziert. Darüber hinaus ist diese Technik zum Nachweis verschiedener Klassen und Unterklassen von Ig, einschließlich IgM, wie in unseren früheren Studien gezeigt, 11,20. Die Bestimmung von IgG-Subklassen kann auch zeigen, Potenzial für einen Beitrag zur Pathogenese der Erkrankung. Zum Beispiel IgG1 oder IgG3 der Lage sind, Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytotoxizität vermitteln oder Komplement-abhängige Zytotoxizität, die Autoantikörper-induzierte Mechanismen der Pathogenität 14,20,22 wiesen werden. Ausgenommen AF647 (ganz rot) Fluoreszenzfarbstoffen kann auch so lange sie Emissionspeaks weit genug von der des Reportermoleküls, GFP verwendet werden. Jede überlappenden Emissionsspektren muss die richtigen Ausgleich Anforderungen. Bestimmung der Spezifität eines Antikörpers an ein intrazelluläres Protein wäre auch möglich, mittels Durchflusszytometrie, obwohl die Zellen müssen zuerst fixiert und permeabilisiert die Antigen-Antikörper-Bindung verfügbar zu machen. Diese alternative Technik in hoher TERGRU führennd durch die Exposition von Antikörpern gegen intrazellulären Domänen sowie zahlreiche zelluläre Antigene, die sonst in lebenden Zellen nonpermeabilized verborgen waren. Diese Störfaktoren können die Stärke der Durchflusszytometrie zellbasierten Assay und entsprechende Kontrollen durchgeführt werden, sind entsprechend zu reduzieren.
Die Verwendung von Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay stellt ein zuverlässiges und genaues Verfahren zum Nachweis von Antikörpern im menschlichen Serum von großen Patientenkollektiven. Entdecken Sie weitere innovative Antikörper durch diese Technik wird die Diagnose und zukünftige Behandlungen von Patienten mit Autoimmun ZNS-Erkrankungen zu helfen.
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Disclosures
Interessenkonflikt: Ein Patent wurde von FB und RCD (University of Sydney) behauptet D2R als Ziel für die Autoantikörper eingereicht.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Australian National Health and Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australien), Tourette-Syndrom Association (USA) unterstützt wird, Trish Die Multiple Sklerose Forschungsgemeinschaft und Multiple-Sklerose-Forschung Australien, Petre Foundation (Australien), die Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australien). Wir danken allen Patienten und Familienmitglieder, die Proben für unsere Studie zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
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