Summary
近年、生細胞ベースのアッセイは、表面とコンフォメーション抗原に対する抗体を検出するために首尾よく使用されている。ここでは、患者の大規模コホートの分析を可能にするフローサイトメトリーのハイスループット流を用いた方法を記載している。新規な抗体の検出は、免疫媒介性障害の診断および治療を改善する。
Abstract
近年、表面と神経伝達に関与コンフォメーションのタンパク質に対する抗体は、小児および成人における自己免疫CNS疾患で検出されている。これらの抗体は、診断および治療を導くために使用されてきた。細胞ベースのアッセイは、患者の血清中の抗体の検出を改善している。次いで、それらを蛍光標識二次抗体、続いて、希釈した患者血清と共にインキュベートし、真核細胞上の脳の抗原の表面発現に基づいている。洗浄後、二次抗体の結合を、フローサイトメトリーによって分析する。当社グループは、確実に特定の神経伝達物質受容体に対する抗体を検出するために、生きた細胞ベースのアッセイメトリーの高スループット·フローを開発しました。このフローサイトメトリー法が効率的で、単純で定量的であり、ハイスループットサンプラシステムの使用を容易に短期間でアッセイするために大きな患者コホートを可能にする。さらに、このようなセルベース回答が容易に中枢神経系及び末梢の両方から、多くの異なる抗原性標的に対する抗体を検出するように適合させることができる。追加の新規抗体のバイオマーカーを発見することは、迅速かつ正確な診断を可能にし、免疫介在性障害の治療を改善するであろう。
Introduction
近年、中枢神経系（CNS）自己免疫疾患の形態が同定されている。なお、これらの疾患が関連しており、自己抗体の存在によって定義されることが示されている。これらの抗体は、神経伝達を1,2に関わる神経細胞の受容体やシナプスのタンパク質に結合する。異なる抗原は、例えば、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体（NMDAR）3-5、γ-アミノ酪酸B受容体（GABAのB）受容体6、α-アミノ-3 -ヒドロキシ-5 -メチル-4 -として、検出されたイソキサゾール酸（AMPA）受容体7、電位依存性カリウムチャネル（VGKC）関連タンパク質：ロイシンリッチ神経膠活性化1タンパク質（LGL-1）およびコンタクチン関連タンパク質2（capsr2）8,9、グルタミン酸受容体5,10 、およびドーパミン2受容体（D2R）11。過去には、（主に脳炎と呼ばれる）これらの自己免疫CNS障害は、多くの場合、診断未確定と未処理だった。これらの新規抗体のバイオマーカー、 例えばNMDAR抗体又はD2R抗体は実質的に診断や意識を改善しているし、患者のための治療の選択肢を開いている。実際、免疫療法による早期治療が改善された結果11,12と関連している。
例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）およびウェスタンブロットなどの抗体を検出するための従来の方法は、血清中の抗体の検出のために使用されている。しかし、それらは容易に細胞外または表面エピトープの認識を有効にしないと、そうではなく、細胞内のエピトープに向けて免疫反応性を明らかにすることができる。さらに、神経伝達に関与する重要なタンパク質の細胞外ドメインに結合する抗体は、病原2,3,7,13,14である可能性が高い。このため、患者の関連する細胞表面や細胞外抗体の標的を発見するための正確で高感度なアッセイの開発が最も重要です。フィールドのゴールドスタンダード法は、いわゆる「細胞のBAの生細胞の使用に基づいているSED検定」。この方法は、哺乳動物細胞、目的の抗原の完全なcDNA配列を含有するベクターのトランスフェクションによるその天然の形態で（最も頻繁にヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞）の表面での抗原の発現を伴う。生きた非透過次いで、細胞を、希釈した患者血清と共にインキュベートし、蛍光色素結合抗ヒト免疫グロブリン（Ig）二次抗体が続く。蛍光の強度又はレベルが検出されると自己抗体結合のレベルに関連している。唯一の抗原が細胞内で過剰発現されているように、この技術は、特異的である。最も広く使用されている「読み出し」4,5,8-10を免疫細胞化学の後、共焦点顕微鏡分析している。しかしながら、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーが正常に15-17脱髄疾患を有する患者において抗体を検出するために使用されている。特に、ウォーターズらは、15パンを用いた抗体の検出を比較し細胞ベースのアッセイを含む、抗体検出技術のエルは、顕微鏡検査またはフローサイトメトリーに続いて分析を流れ、そして最も敏感正確で、かつ信頼性の高い方法であることが、細胞ベースのアッセイフローサイトメトリーを示している。それは研究者に依存し、定量的ではなく、放射性物質のいずれかの使用を含まないように、したがって、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーが有利である。それが大きな患者コホートが短時間でアッセイすることを可能にするようにも便利です。
より最近では、我々は、CNS自己免疫疾患を有する患者において11 NMDAR抗体及びD2R抗体を検出するための細胞ベースのアッセイフローサイトメトリーのハイスループットフローを最適化した。我々のグループは最近、細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーを用いて、患者血清中のNMDAR抗体を検出した。これらのNMDAR抗体陽性血清は、以前は、共焦点顕微鏡を用いて分析し、また、11陽性であった。このプロトコルは、Cの検出のための細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーの概要を説明自動化されたハイスループットサンプラーを用いた患者血清中のonformationに敏感な中枢神経系の抗体。
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Protocol
1。たpIRES2-EGFPベクターのエンコーディングD2RまたはNMDARを構築するための戦略をサブクローニング
- 人間D2RまたはNMDARサブユニット1（NR1）の完全長cDNAクローンを得る。
- このように同時発現される抗原およびGFPの両方を可能にする高感度緑色蛍光タンパク質内部リボソーム侵入部位（IRES）の制御下で（GFP）レポーターを有する膜貫通タンパク質の発現に適しているたpIRES2-EGFPのような発現ベクターを選択する別途、細胞。
- たpIRES2-EGFPベクター内のヒトcDNAをサブクローニング。
- のcDNAをサブクローニングするために、（例えば、人間のD2RのcDNAのためのNheIおよびXhoIのために）適切な制限酵素を使用しています。
- ライゲーションカットcDNAは、制限されたたpIRES2-EGFPベクター内に挿入します。
- 配列は、ベクターが正しい順序が含まれているかどうかを確認するたpIRES2-EGFP D2RまたはNMDARベクトルを連結した。
- トランスフェクション後の使用のためにたpIRES2-EGFP D2RまたはNMDARベクトルを浄化し、増幅する。
- 4.5グラム/ LのD-グルコース、L-グルタミン及び110ミリグラムとの完全な新鮮ダルベッコ変法イーグル培地（1×）（DMEM）を用いて組織培養フラスコ中で培養HEK293細胞/ 10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したLピルビン酸ナトリウム、 2 mMのグルタ、および50μg/ mlのゲンタマイシン。
- コニカルチューブにトリプシンおよび転送を使用しているHEK293細胞を剥離。
- 6分間250×gで細胞を遠心分離して洗浄し、新鮮な完全DMEM中で細胞ペレットを再懸濁します。
- インキュベーター内で37℃で2ミリリットルDMEM中で一晩約8×10 5細胞/ウェルと文化、5％CO 2で細胞や種子6ウェルプレートをカウントします。
- それらは約70％コンフルエントに達したら、たpIRES2-EGFP NR1（HEK293 NMDAR +細胞）、たpIRES2-EGFP D2R（HEK293 D2R +細胞）を用いてHEK293細胞をトランスフェクトしたpIRES2-EGFP（HEK293 CTL細胞 、ベクター対照）を以下のように。後で補償のためのいくつかの非トランスフェクトしたHEK293細胞を保管してください。
- 2.5μgのDNAを、200μlの0.9％塩化ナトリウムおよび4μg/ mlのポリエチレン/ウェル（各2ミリリットルを含む新鮮な完全DMEM）を含むトランスフェクションミックスの必要なボリュームを準備します。
- 直ちに10秒間混合物をボルテックスし、適切なウェルにトランスフェクションミックスの体積を添加する前に、10分間室温（RT）でインキュベートする。
- 、プレートを覆いパラフィルムで両面をラップし、細胞トランスフェクションを支援するために5分間280×gで遠心する。
- パラフィルムを外し、37℃で培養するためのインキュベーター内に配置
- 新鮮な完全DMEMで18時間後に培養液を交換し、さらに72時間培養中に維持する。
- オプション：72時間トランスフェクション後、トランスフェクトされた細胞は、ポリクローナル安定なトランスフェクタントを得るためには、250μg/ mlのジェネテシンを補充した完全DMEM中で培養することにより選択することができる。
- 37℃で約5分間、500μL/ウェルベルセンとのインキュベーションにより、HEK293 NMDAR +、HEK293 D2R +、およびHEK293 CTL細胞を剥離
- PBSの2ml/wellに再懸濁（+ / - の Mg 2 +のCa 2）は 、2％のFBS（PBS / FBS）を補充し、15ミリリットルまたは50mlコニカルチューブに移す。
- 6分間250×gで遠心分離して細胞を洗浄し、15〜50ミリリットルのPBS / FBS中で細胞ペレットを再懸濁します。ウォッシュ2Xを繰り返します。
- 細胞を計数した後、1×10 6細胞/ mlでPBS / FBS中に再懸濁する。
- HEK293 D2R +又はHEK293 NMDAR +細胞、ならびにCTL HEK293 細胞は、各患者試料又は一次抗体と共にインキュベートされなければならないことを考慮して、フローサイトメトリー取得のための96ウェルテンプレートをデザインする。
- 50,000細胞/我々におけるV底96ウェルプレート中の種子細胞llの取得テンプレートフローサイトメトリーに記載の方法。
- 5分間450×gで96ウェルプレートを遠心分離し、穏やかに電子的または手動のマルチチャンネルピペットを用いて上清を除去し、角板を傾斜し、細胞ペレットを吸引しないように注意を取ることにより細胞をペレット化。
- と暗闇の中で、室温で1時間HEK293 D2R +、HEK293 NMDAR +、およびHEK293 CTL細胞をインキュベート。
- 抗原表面発現を評価するために、一次抗体の連続希釈。
- 抗体を検出するために、患者のサンプル。
- 例えば 、補償コントロールサイトメトリ適切なフローを使用してください。染色されていない非トランスフェクトHEK293細胞に、GFP + HEK293細胞（AF647 - ）、および非トランスフェクトAF647 + HEK293細胞（GFP）。
- 5分間450×gで遠心分離して細胞を洗浄し、170μlのPBS / FBS中で細胞ペレットを再懸濁します。反復洗浄工程をさらに2回。
- 1時間細胞をインキュベート（抗NR1または抗D2R一次抗体のために、患者の血清および抗マウスIgG抗ヒトIgG）AF647結合二次抗体の1:100希釈した暗闇の中でRTでR。
- ステップ3.7のように、細胞を3回洗浄し、細胞の取得、フローサイトメトリーのために35μlのPBS / FBS中で懸濁します。
- （BDLSRII）フローサイトメーター上でハイスループットサンプラー（HTS）を設定します。
- 取得テンプレートをフローサイトメトリーによると万イベント/ウェル獲得。
- エクスポートして、このようなFlowJoソフトのV7.5などのソフトウェアパッケージ、フローサイトメトリーを用いた分析のためにデータを分析します。
- まず、前方（サイズ）および側方（粒度）に基づいてゲート生HEK293細胞が散乱する。
- 唯一のトランスフェクションされた細胞を分析するために、高GFP-陽性に基づいてさらにゲート生きたHEK293細胞。
- ライブGFP陽性細胞内AF647チャネルの平均蛍光強度（MFI）を決定します。
- 分析用のExcelやプリズムへのデータのエクスポート：
- プロットCMFIに対する一次抗体（抗NMDARまたは抗D2R抗体）のoncentrationsは、これらの抗体と共にインキュベートした細胞から得られた。
- 各患者と対照サンプルについては、それぞれHEK293 D2R +またはHEK293 NMDAR +細胞のMFIからHEK293 のCTL細胞のMFIを差し引くことによりΔMFIを決定します。
- 対照コホートの平均ΔMFI上記の3つの標準偏差を追加することにより、抗体陽性のしきい値を計算します。
- グラフ上にそれらの血清型に従ってグループ化された個々のサンプルをプロットし、線としてしきい値を表しています。
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Representative Results
生きHEK293 D2R +とHEK293 CTL細胞は、高スループットサンプラーを使用して、フローサイトメーターで得た。分析の間、細胞は、前方散乱（大きさ）および側方散乱（粒度）パラメータ（ 図1Aおよび1D）に基づいてゲートした。トランスフェクトされたHEK293細胞は、細胞質において、レポーター分子、GFPを発現し、そして非トランスフェクト細胞を、分析（ 図1B及び1E）から除外した。 GFP +ゲート内に、AF647結合抗ヒトIgG二次抗体の結合に関連付けられたMFIは、（ 図1C及び1F）を測定した。ヒト血清を分析するとき、バックグラウンド蛍光を除去するために、ΔMFIはHEK293 D2R +細胞のMFI（ 図1G）からのCTL HEK293 細胞のMFIを差し引くことにより算出した。示されたデータは、D2R抗体分析の代表であり、同一のゲーティング戦略およびデータ分析は、NMDAR抗体検出（データは示していない）のために使用することができる。
細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーによる抗体検出は、目的の抗原の細胞表面発現に基づいている。 図2に示すように、HEK293 NMDAR +細胞は、高度に表面NMDAR（ 図2A）およびHEK293 D2R +細胞が高度に発現される表面D2R（ 図2B）を発現し、HEK293 CTL細胞はこれらの抗原（ 図2Aおよび2B）のいずれを発現し、一方。
本研究で使用した患者群では、NMDAR脳炎の患者コホートから構成され（NMDARなお、Enc、N = 4、表面NMDARサブユニット1の検出NR1抗体3で定義された脳炎）、D2R抗体関連脳炎（D2Rなお、Enc、はn = 6、表面D2R抗体11の検出によって規定脳炎）、および対照コホートのWiてんかん、脳卒中、および発達や神経変性疾患などの他の非炎症性神経疾患（OND、N = 26）、番目。患者サンプルは、以前NMDAR 5とD2R 11のIgG陽性のために検証されています。 NMDAR抗体について陽性の4人の患者が3を説明した血清サンプルを説明し、商業的に使用3,4で使用可能なように、NMDAR抗体について細胞ベースのアッセイを使用して正の証明されたとして、NMDAR脳炎の典型的な臨床症状を持っていた。 D2R抗体について陽性人の患者は、11に記載されているよう基底核脳炎の典型的な臨床症候群を有し、血清試料をD2Rノックアウト脳切片を、トランスフェクトされた細胞、およびニューロン11を用いD2R抗体について陽性証明された。
患者における抗体陽性を決定するために、抗体陽性の閾値又はカットオフは、上方に3標準偏差を加えることにより、各実験で算出したONDコントロールのΔMFIを意味する。 D2Rなお、Encで6月6日の患者は人間の表面D2R IgG抗体（ 図3B）が陽性であったのに対し、NMDARなお、Encと4月4日の患者は、人間の表面NMDAR IgG抗体（ 図3A）に陽性が確認された。陽性患者はいずれも、NMDARとD2Rを標的とする抗体のための二重陽性ではなかった。 NMDAR及びD2Rの抗体が分析OND対照のいずれにおいても検出されなかった（ 図3Aおよび3B）。彼らは3回の反復実験のうち、少なくとも2でしきい値を超えていた場合は、患者の試料を陽性とみなした。
図1。細胞ベースのアッセイフローサイトメトリーのハイスループットフローによる抗体の検出：戦略とデータ分析をゲーティングリビング E HEK293 CTL細胞及びHEK293 D2R +安定なトランスは、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）（;、Dはそれぞれ74.7％と68.5％、）に基づいてゲートした。 HEK293 CTLおよびHEK293 D2R内のGFP陽性細胞+細胞（それぞれ32.8％と95.4％、、B、E）をさらにトランスフェクトしていない、GFPを除外するためにゲートした-細胞（それぞれ67.2％と4.6％、、B、E）。 GFP +細胞内で、AF647結合抗ヒトIgG二次抗体に関連付けられた平均蛍光強度（MFI）（= 3,657 CTL HEK293、HEK293 D2R + = 9,128）を、（C、F）を測定した。ヒト試料については、ΔMFIはHEK293 D2R +細胞（G）とはHEK293 CTL細胞のMFIを差し引くことにより算出した。 D2R抗体検出の代表的なデータを示している。 ANK ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図2。細胞ベースのアッセイフローサイトメトリーのハイスループットフローによって決定される面NMDAR及びD2Rの発現。HEK293 NMDAR +（A）は 、HEK293 D2R +（B）、及びHEK293 CTL細胞は、適切な二次抗体、続いて一次抗体の連続希釈を用いて染色した。 NMDAR及びD2Rの高い表面発現が観察された。彼らは一次抗体の濃度を増加させながら着実に増加としてMFI値は、抗体価と相関していた。予想されるように、CTL HEK293 細胞における表面NMDAR又はD2Rは検出されなかった。代表的なデータを示している。ブランク」>拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。
図3。患者。NMDAR脳炎からの血清（NMDARなお、Enc、N = 4）他の神経疾患と、D2R抗体関連脳炎（D2Rなお、Enc、N = 6）の患者、またはコントロール（OND のコホートにおける表面NMDARとD2R抗体の確認された検出はn = 26または24）AF647結合抗ヒトIgG二次抗体、続いてライブNMDAR + HEK293、HEK293 D2R +、CTLおよびHEK293 細胞と共にインキュベートした。 OND対照（0/26 0/24）のいずれもがいずれかの与えなかったのに対し、表面NMDARとD2R抗体は、それぞれ、4/4 NMDARなお、Enc患者（A）及び5/6 D2Rなお、Enc患者（B）の血清中に検出された抗体（A、B）。 Dotteグラフ上の線は、d個のOND対照の平均ΔMFIに3標準偏差を加算した陽性閾値を表す。 3つの実験のうち代表的なドットプロットが表示されます。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
本論文では、高スループットのサンプラーを使用して、特定の細胞表面の神経タンパク質を標的とする抗体を検出するために、生きた細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーの新しいアプリケーションを記述します。この技術を用いて、自己免疫CNS疾患に罹患した患者のサブグループは、NMDARの表面又はD2Rに表面血清抗体を有することを報告している。
生細胞ベースのアッセイサイトメトリこのハイスループットフローを使用して、最適な抗体検出のための基本的な手順としては、1）健康なトランスフェクトされた細胞の高い収率を得ること、2）目的の抗原の高い細胞表面発現を確認すること、3）抗体の閾値を確立すること陽性コントロール、4のコホートを用いて）、データの再現性を確認した。
健康な細胞の文化は、この技術の成功の基本である。 HEK293細胞は、それらの培養の容易さ、高いトランスフェクション効率、およびニューロンの発現の欠如のためによく知られているタンパク質は、それらが一般的に特定のニューロン4,5,8-10の抗原に対する抗体を検出するための細胞ベースのアッセイにおいて使用されてきた理由である。このアッセイは正確MFIを計算する生GFP +細胞の高いパーセンテージを取得するための最適なトランスフェクション率は重要である。このため、それより前の繰り返しトランスフェクト細胞に持たないの利便性と、GFP +細胞の一貫した高レベルを提供するように、GFP + HEK293 NMDAR +、HEK293 D2R +、またはHEK293 CTL細胞のポリクローナル安定細胞株が有利で ある製造各実験。倒立顕微鏡でトランスフェクトされた細胞の迅速な閲覧は、健康な細胞（水銀ランプが使用可能な場合、GFP +細胞が蛍光を発する）をチェックすることをお勧めします。生存率がそれほど高くないと思われる場合には、フローサイトメーターにおけるセル獲得の前に、例えば、7 - アミノ - アクチノマイシンDとして、生存色素を使用することが有益であり得るとanalysの余分なゲーティング工程を追加する非生存細胞を排除することである。
CNS自己免疫疾患は、脳抗原の細胞外ドメインに結合する抗体は、従って重点がライブおよび非透過性細胞を使用する抗体の検出に置かれ、2,3,7,13,14病原性であると考えられている。このプロトコルは、表面抗原を発現するトランスフェクト細胞を使用することによってこの目的を達成する。したがって、表面へのこれらの抗原の正確なエクスポートは、目的の抗原に対する市販の一次抗体の連続希釈物をトランスフェクトした細胞の染色によって決定される必要がある。非透過性細胞上の表面抗原の発現レベルを評価する場合、それはタンパク質の細胞外エピトープを標的とする抗体を使用することが必須である。特異的抗体が利用できない場合、それは抗原の細胞外ドメイン上のタグを追加する必要があり、その後に表面発現を決定するために、タグに対する市販の抗体を使用することができる。我々は成功している赤血球凝集素タグ付きD2Rを使用して、このアプローチを使用し、タグ自体11に患者の血清の免疫反応性を否定した。それは、細胞膜での発現および構造的完全性が損なわれないように、目的の抗原の全cDNA配列を適当なベクターにサブクローニングされていることも重要である。実際、先に受容体タンパク質の特定のドメインが正しい折り畳み、エクスポート、および細胞膜18への統合のために不可欠であることが示されている。
細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーでは、各実験で患者血清の抗体陽性を評価することは、コントロールのコホートに由来し、しきい値の設立、またはカットオフに依存しています。 Zhou ら 19Δmedian平均蛍光強度の上方に2つの標準偏差を加えることにより、抗体陽性の閾値を算出し、これは約健康な制御範囲の95 パーセンタイルに相当する。で我々の以前の研究では、私たちは健康的な制御範囲11,20の99 パーセンタイルに相当し、高い遮断（対照コホートの平均ΔMFIへの3つの標準偏差の追加）を選択しました。また、マクローリンら 16は、抗原発現細胞および抗原陰性細胞との間のMFIの比として特異的抗体反応の測定を発現することを選択した。より大きい5の比率は正とみなされ、私たちの仕事と似て対照の平均比率は、上記の3つの標準偏差に対応してました。高いしきい値を使用すると、プロトコルの厳密性を高め、コントロールおよび抗体について陽性の患者との識別を向上させます。重要なのは、我々の経験では、健康的な制御範囲の抗体反応性がcalculatする人口のいずれかの使用を可能にする、OND範囲よりも有意差は認められなかった抗体陽性11,20のEしきい値。
すべての研究実験におけるように、データの再現性が最重要である。彼らは3つの独立した実験のうち、少なくとも2で陽性の閾値を超える場合には、患者の血清は、特定の神経細胞の抗原に対する抗体が陽性であると考えている。個々の患者は、血清中のIgGの濃度を変化させている。これらの変化は、他の患者に対して結合する抗体のレベルに影響を与えることができる。我々の以前の研究において使用した全ての患者の血清は、比濁法により測定し、正常範囲（6.2〜14.4グラム/ L）内であることが見出さ11と、我々は常に同じ希釈率で血清を希釈した。個々の血清の力価曲線を確立することは、患者間の抗体の濃度を比較するために有益である可能性があります。さらに、研究者の最初の盲検化は、細胞ベースのアッセイ中にお勧めしますが、コントロールがPOSITを計算するために、非盲検する必要がされているivityしきい値。
妥当な抗体標的が発見された場合、適切な検証が偽陽性を防止する必要がある。細胞ベースのアッセイ、フローサイトメトリーを用いて検出抗体陽性または陰性のサンプルを優先的に変性または線形化された抗原を利用していないだろう、代替の方法論を用いてアッセイされるべきである。例えば、抗原特異的ノックアウト動物からの脳切片上の免疫反応性を減少させ、正常に9-11,21の自己抗原のいくつか、新しく報告されたCNSの場合に示されている。抗原発現細胞上の患者血清の免疫吸着も9,11結果を検証するために使用されてきた。
本稿で記載される細胞ベースのアッセイプロトコルを、フローサイトメトリーを容易にCNSの外側に見出されるものを含む、異なる抗原標的、多数の抗体に特異性を評価するために変更することができる。それは、他の未知の特異性の抗体があることがまだ存在している可能性がある同定した。我々の以前の研究11,20に示すように、さらに、この技術は、IgMを含むIgの異なるクラスおよびサブクラスを検出するのに適している。 IgGサブクラスの決定はまた、疾患の病因に貢献する可能性を明らかにすることができる。例えば、IgG1またはIgG3の抗体依存性細胞傷害性を媒介したり補体依存性自己抗体により誘導される病原性のメカニズム14,20,22に報告された細胞傷害性を、することができます。 AF647（遠赤）以外の蛍光色素はまた、それらが十分レポーター分子、GFPのそれと発光ピークを有するとして利用することができる。任意の重複する発光スペクトルは、正しい補償の要件を持っている必要があります。細胞を最初に固定し、結合抗体に対する抗原を利用できるように透過処理される必要があるが、細胞内タンパク質に対する抗体の特異性を決定することはまた、フローサイトメトリーを用いて可能であろう。この代替技術は高いbackgrouになることができます原因そうでなければ生きて非透過細胞の中に隠された細胞内ドメインだけでなく、数多くの細胞抗原に対する抗体の曝露を購入する。これらの交絡因子は、細胞ベースのアッセイおよび適切なコントロールをそれに応じて実行されなければならないフローサイトメトリーの強度を減少させることができる。
細胞ベースのアッセイフローサイトメトリーのハイスループットフローの使用は、患者の大規模コホートからのヒト血清中の抗体を検出するための確実かつ正確な方法を提供する。この技術によって、追加の新規抗体を発見すると、診断や自己免疫CNS疾患を持つ患者の将来の治療に役立ちます。
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Disclosures
利益相反：特許は、自己抗体のターゲットとしてD2Rを主張FBとRCD（シドニー大学）によって提出されている。
Acknowledgments
この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会、スター科学財団（オーストラリア）、トゥレット症候群協会（米国）によってサポートされていました、トリッシュ多発性硬化症研究財団および多発性硬化症の研究オーストラリア、この説明財団（オーストラリア）、レベッカL.クーパー医学研究財団（オーストラリア）。我々は我々の研究のためのサンプルを提供し、すべての患者や家族に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
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