Summary
Son yıllarda, canlı hücre bazlı deneyler, yüzey ve şekilsel antijenlere karşı antikorlar tespit etmek için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Burada, hastaların büyük kuşaklarının analiz sağlayarak sitometri yüksek verimli akışını kullanarak bir yöntem açıklanmaktadır. Yeni antikorların tespiti immün aracılı bozuklukların tanı ve tedavi artıracaktır.
Abstract
Son yıllarda, yüzey ve sinir iletimi ile ilgili yapısal proteinlerine karşı olan antikorlar, çocuklar ve yetişkinler için CNS otoimmün hastalıklarda tespit edilmiştir. Bu antikorlar tanı ve tedaviye yol kullanılmıştır. Hücre bazlı deneyler hasta serum içinde antikorların saptanmasını iyileştirilmiştir. Daha sonra florokrom-konjuge sekonder antikor ile, ardından seyreltilmiş hasta serası ile inkübe edilir, ökaryotik hücreler üzerinde beyin antijenlerin, yüzey ekspresyonu dayanmaktadır. Yıkama işleminden sonra, bağlayıcı ikinci antikor daha sonra akış sitometrisi ile analiz edilir. Bizim grup güvenilir bir şekilde belirli bir nörotransmiter reseptörlerine karşı antikorlar tespit etmek için, canlı hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akış geliştirmiştir. Bu akış sitometri yöntemi yalındır, kantitatif, verimli ve geniş hasta kohortlarının kolayca zaman kısa bir alanda test edilmesi için yüksek verimli bir örnekleyici sistemi kullanma imkanı sağlar. Ayrıca, bu gibi hücre bazlıki kolayca merkezi sinir sistemi ve çevre hem de birçok farklı antijenik hedeflere antikorları tespit etmek için adapte edilebilir. Ilave yeni antikor biomarkerlerin Keşfi hızlı ve doğru tanı sağlamak ve bağışıklık aracılı bozuklukların tedavisini artıracaktır.
Introduction
Son yıllarda, merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları ve oto-bağışıklık biçimleri tanımlanmıştır. Bu hastalıklar ve ilişkili otoantikorlann mevcudiyeti ile tanımlanır olduğu gösterilmiştir. Bu antikorlar ya da reseptörleri nöronal sinir iletimini 1,2 dahil sinaptik proteinlere bağlanır. Farklı antijenler, örneğin N-metil-D-aspartat reseptör (NMDAR) 3-5, γ-aminobütirik asit reseptör B (GABA B) 6 reseptörü, α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-olarak tespit edilmiştir izoksazolepropiyonik asit (AMPA) reseptörü 7, voltaj kapılı potasyum kanal (VGKC) bağlı proteinler: lösin açısından zengin glioma-aktive protein 1 (LGL-1) ve kontaktin-ilişkili protein 2 (capsr2) 8,9, glutamat reseptörü 5,10 ve dopamin-2 reseptörü (D2R) 11. Geçmişte, (çoğunlukla ensefalit olarak da bilinir), bu otoimmün CNS bozuklukları sıklıkla teşhis ve tedavi edilmemiştir. Bu yeni biyolojik antikor, örnNMDAR antikor veya D2R antikor, esasen tanı ve farkındalık düzeldi, ve hastalar için tedavi seçenekleri açtı. Gerçekten de, bağışıklık ile erken tedavi geliştirilmiş sonuç 11,12 ile ilişkilidir.
, Örneğin enzim bağlantılı immünosorbent deneyi (ELISA) ve western blot gibi antikorları tespit etmek için geleneksel yöntemler serumunda antikorların saptanması için kullanılmıştır. Ancak, hali hazırda hücre-dışı ya da yüzey epitoplarının tanınması olanak değildir ve, bunun yerine, bir hücre içi epitopuna karşı immunoreaktivitesini ortaya çıkarabilir. Ayrıca, sinir katılan önemli proteinlerin hücre dışı alanına bağlanan antikorlar, patojenik 2,3,7,13,14 olması muhtemeldir. Bu nedenle, ilgili hücre yüzey ya da hücre-dışı hastalarda antikor hedefleri keşfetmek için doğru ve hassas analizlerin geliştirilmesi önemlidir. Alanındaki altın standart yöntem olarak adlandırılan, "hücre-ba olarak, canlı hücrelerin kullanımına dayanmaktadırsed deneyleri ". Bu yöntem, memeli hücrelerinin ilgilenilen antijenin tam cDNA dizisini ihtiva eden vektörler transfeksiyonu ile kendi doğal biçiminde (en çok insan embriyonik böbrek 293 (HEK293) hücre) yüzeyinde bir antijenin ekspresyonunu içerir. Geçirgen hale getirilmemiş canlı hücreler daha sonra, seyreltilmiş hasta serumu ile inkübe edildi ve florokrom-eşlenik anti-insan immünoglobülin (Ig) sekonder antikoru ile takip edilmektedir. Floresans yoğunluğu veya seviyesi, daha sonra tespit edilir ve bağlayıcı otoantikor seviyesine ilişkilidir. Tek bir antijen hücrelerinde aşırı eksprese olduğu gibi bu teknik, özgüdür. En çok "Okuması" kullanılmış immünsitokimya 4,5,8-10 sonra konfokal mikroskopi analizi olmuştur. Bununla birlikte, hücre bazlı deneylerde akış sitometrisi başarılı demiyelinizan hastalıklar 15-17 olan hastalarda antikorları tespit etmek için kullanılmıştır. Özellikle, Waters vd. 15, bir tava ile bir antikorun saptanmasını karşılaştırıldığındaHücre bazlı mikroskobu ile takip deneylerinde ya da dahil olmak üzere, akış antikor algılama teknikleri el sitometri analizleri ve en hassas, doğru ve güvenilir bir yöntem olarak hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi göstermiştir. Bu araştırmacı bağımlı, kantitatif değildir ve radyoaktif malzemenin herhangi bir şekilde kullanılması anlamına gelmez Bu nedenle, hücre bazlı bir deneyde sitometri akışı avantajlıdır. Bu büyük hasta tabur kısa bir miktarda tahlil edilecek verir gibi de uygundur.
Daha yakın zamanlarda, otoimmun CNS hastalıkları olan hastalarda 11 NMDAR antikor ve D2R antikoru belirlemek için hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akış optimize ettik. Bizim grubu son hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi kullanılarak hasta serumunda NMDAR antikor tespit edildi. Bu NMDAR antikoru pozitif serumlar daha önce konfokal mikroskopi kullanılarak analiz edildi ve 11 pozitif olduğu bulunmuştur. Bu protokol, c tespiti için hücre bazlı bir deneyde bir akış sitometri özetlenmektedirotomatik yüksek verimli örneği kullanan hasta serumunda onformation duyarlı CNS antikor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Strateji pIRES2-EGFP Vektör Kodlama D2R veya NMDAR Construct altklonlamıştır
- İnsan D2R veya NMDAR alt biriminin 1 (NR1) tam uzunluktaki cDNA klonunu elde edilir.
- Böyle bir durumda birlikte tanımlanması antijenleri ve GFP hem de mümkün kılan bir gelişmiş yeşil floresan protein, bir iç ribozom giriş sahası (IRES) kontrolü altında (GFP) raportör ile transmembran proteinlerin ekspresyonu için uygun olan pIRES2-EGFP gibi bir ifade vektörü, seç ayrı ayrı hücreler.
- PIRES2-EGFP vektörü içinde insan cDNA alt-klonlanmıştır.
- , CDNA alt klonlamak, uygun kısıtlama enzimleri kullanmak için (insan D2R cDNA örneğin Nhel ve Xhol için).
- Ligatı kesilmiş cDNA kısıtlı pIRES2-EGFP vektörü içinde yerleştirin.
- Dizisi vektör doğru sırasını içerip içermediğini kontrol etmek pIRES2-EGFP D2R veya NMDAR vektörü bağlandı.
- Arındırmak ve transfeksiyon daha sonra kullanmak için pIRES2-EGFP D2R veya NMDAR vektörün yükseltilmesi.
- Taze Dulbecco Modified Eagle Medium (1x) (DMEM) 4.5 g / L D-glikoz, L-glutamin ve 110 mg,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş / L sodyum piruvat ile birlikte ile doku kültürü şişelerinde Kültür HEK293 hücreleri, 2 mM GlutaMAX ve 50 ug / ml Gentamisin.
- Tripsin ve transferi bir konik tüp kullanılarak HEK293 hücreleri ayırın.
- 6 dakika boyunca 250 xg'de hücreler santrifüj ile yıkayın ve taze bitmiş DMEM içinde bir hücre pelletini.
- Yaklaşık 8 x 10 5 hücre / göz ve kültür, gece boyunca 2 ml DMEM içinde 37 ° C de ve% 5, bir kuluçka makinesi içinde CO2 de hücreleri ve tohum 6 kuyucuğu sayılır.
- Bu yaklaşık% 70 ortak akışkanlığa eriştiklerinde sonra, pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR + hücreleri), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R + hücreleri) ile HEK293 hücreleri transfekte etmek, ve pIRES2-EGFP (HEK293 CTL hücreleri vektör kontrolü) aşağıdaki gibi.Sonra tazminat için bazı untransfected HEK293 hücreleri tutun.
- 2.5 ug DNA, 200 ul% 0.9 sodyum klorür ve 4 ug / ml polietilenimin / oyuk (her biri 2 ml taze tam DMEM içeren) içeren bir transfeksiyon karışımı gerekli hacmi hazırlayın.
- Hemen 10 saniye boyunca girdap karışımı ve uygun oyuklara transfeksiyon karışımı hacmi ilave edilmeden önce, 10 dakika süre ile oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir.
- , Kapak plakası Parafilm ile yanlarını doğal olarak kaplayan ve hücre transfeksiyonu yardımcı olmak için 5 dakika boyunca 280 x g 'de santrifüj.
- Parafilm çıkarın ve sonra 37 ° C de kültüre inkübatöre koyun
- Taze tam DMEM ile 18 saat sonra kültür ortamı değiştirin ve başka bir 72 saat boyunca kültür korumak.
- İsteğe bağlı: 72 saat post-transfeksiyon, transfekte edilmiş hücreler, poliklonal stabil transfektan elde etmek amacıyla, 250 ug / ml Genetisin ile desteklenmiş tam DMEM içinde kültür tarafından seçilebilir.
- 37 ° C'de yaklaşık 5 dakika boyunca 500 ul / well Versene ile kuluçkaya yatırılması ile HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + ve HEK293 hücreleri CTL ayırın
- PBS içinde süspanse 2ml/well (= Ca 2 + / Mg2 +)% 2 FBS (PBS / FBS) ve 15 ml veya 50 ml konik bir tüp transfer ile takviye edilmiştir.
- 6 dakika boyunca 250 xg'de santrifüj ile hücreler yıkanır ve 15-50 ml PBS / FBS hücre pelletini. Yıkama 2x tekrarlayın.
- Hücre sayımı ve daha sonra 1 x 10 6 hücre / ml 'de PBS / FBS içerisinde yeniden süspanse edin.
- HEK293 D2R + veya HEK293 NMDAR + hücreleri, hem de CTL HEK293 hücreleri, her bir hasta numune ya da birincil antikor ile inkübe edilmesi olacağı dikkate alınarak, akış sitometri elde edilmesi için 96-çukurlu bir şablon tasarımı.
- 50,000 hücre / biz bir V-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde tohum hücrelerill alıcı şablon sitometri akışına göre.
- 5 dakika boyunca 450 x g 'de 96-yuvalı plaka santrifüj ve nazikçe bir elektronik çok kanallı pipet ya da elle kullanarak süpernatan, bir açı ile plaka eğme ve hücre pelletini aspire dikkat alarak Pelet hücreleri.
- HEK293 D2R +, HEK293 NMDAR + ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilmiş HEK293 hücreleri CTL:
- Yüzey antijen ekspresyonunu değerlendirmek için birincil antikorunun seri dilüsyonları.
- Antikoru belirlemek amacıyla hasta örnekleri.
- Örneğin, tazminat kontrolleri sitometri uygun akışı kullanın. boyanmamış transfekte edilmemiş HEK293 hücreleri, GFP + HEK293 hücreleri (AF647 -) ve transfekte edilmemiş AF647 + HEK293 hücreleri (GFP).
- 5 dakika boyunca 450 x g santrifüj ile hücreler yıkanır ve 170 ul PBS / FBS hücre pelletini. Yıkama adımı iki kez daha tekrarlayın.
- 1 saat boyunca inkübe hücreleri(anti-NR1 ya da anti-D2R primer antikorlar hasta serum ve anti-fare IgG anti-insan IgG) AF647-konjuge sekonder antikor 1:100 seyreltme ile karanlıkta, oda sıcaklığında r.
- Adım 3.7 'de olduğu gibi, hücreler üç kez yıkayın ve hücre devir akış sitometrisi için 35 ul PBS / FBS içerisinde yeniden süspanse edin.
- (BDLSRII) sitometresi akış yüksek verim sampler (HTS) ayarlayın.
- Edinimi şablonun sitometri akışına göre 10.000 olaylar / kuyu edinin.
- İhracat ve sonra bu FlowJo v7.5 gibi yazılım paketinin sitometri akışını kullanarak analiz için verileri analiz:
- İlk olarak, ileri (boyut) ve yan (granüllü yapı) göre kapı canlı HEK293 hücreleri dağıtır.
- Yalnızca transfekte hücreleri analiz etmek için yüksek GFP-pozitif göre daha fazla kapı canlı HEK293 hücreleri.
- Canlı GFP-pozitif hücreler içinde AF647 kanalın ortalama floresan yoğunluğu (MFI) belirler.
- Analiz için Excel veya prizma içine İhracat verileri:
- Plot cMFI karşı birincil antikor (anti-NMDAR veya anti-D2R antikor) oncentrations, bu antikorlar ile inkübe hücrelerden elde.
- Her bir hasta ve kontrol örneği için, sırası ile, HEK 293 D2R + ya da HEK293 NMDAR + hücrelerinin MFI gelen CTL HEK293 hücrelerinin MFI çıkarılarak ΔMFI belirler.
- Kontrol kohort ortalama ΔMFI yukarıdaki üç standart sapma ekleyerek antikor pozitifliğinin eşiğini hesaplayın.
- Arsa bireysel örnekler bir grafik üzerindeki serum türüne göre gruplandırılmış ve bir çizgi halinde eşiği temsil etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Canlı HEK293 D2R + ve HEK293 hücreleri, CTL yüksek verimli bir örneği kullanarak akış sitometresi ile elde edildi. Analiz sırasında, hücreler ileri dağılım (boyut) ve yan dağılım (granülaritesi) parametreleri (Şekil 1A ve 1B) dayalı kapılı edilmiştir. Transfekte edilmiş HEK293 hücreleri sitoplazmasında raportör molekülü, GFP ifade ve transfekte edilmemiş hücrelerin analizi (Şekil 1 B ve 1 E) alınmadı. GFP + kapısı içinde, AF647 konjuge edilmiş anti-insan IgG ikincil antikoru bağlama ile ilişkili MFI (Şekil 1C ve 1F) ölçülmüştür. Insan serasını analiz ederken, arka plan floresan ortadan kaldırmak için, ΔMFI HEK293 D2R + hücrelerinin MFI (Şekil 1G) için HEK293 CTL hücrelerinin MFI çıkarılarak hesaplandı. Gösterilen veriler D2R antikor analizi için temsili veAynı yolluk stratejisi ve veri analizi NMDAR antikor tespiti (veriler gösterilmemiştir) için kullanılabilir.
Hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi ile antikor tespiti, ilgi alanındaki antijene hücre yüzeyi ekspresyonu dayanmaktadır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, HEK293 hücreleri, CTL bu antijenlerin de (Şekil 2A ve 2B) olarak ifade edilmiştir, oysa, HEK293 NMDAR + hücreleri, yüksek yüzey NMDAR (Şekil 2A) olarak ifade edilmiştir ve HEK293 D2R + hücreleri, yüksek yüzey D2R (Şekil 2B) olarak ifade edilmiştir.
Bu çalışmada kullanılan hasta grupları NMDAR ensefalit olan bir hasta grubu oluşuyordu (NMDAR Enc, n = 4, yüzey NMDAR-1 alt biriminin saptanması NR1-3 antikor ile tanımlanan bir ensefalit), D2R antikor ile ilişkili ensefalit (D2R Enc, n = 6, yüzey D2R 11 antikorunun tespiti ile tanımlanan bir ensefalit) ve bir kontrol kohort wiepilepsi, inme ve gelişimsel ya da nörodejeneratif bozukluklar gibi th diğer enflamatuar olmayan nörolojik hastalıklar (OND, n = 26). Hasta numuneleri önceden NMDAR 5 ve D2R 11 IgG pozitifliği için valide edilmiştir. NMDAR antikorları için pozitif hasta 3, tarif edilen ve serum örnekleri tarif edilen ve ticari olarak temin edilebilen 3,4-NMDAR antikorlar için hücreye dayalı tahliller kullanılarak pozitif kanıtlanmış olduğu gibi NMDAR ensefalit tipik bir klinik sendrom vardı. D2R antikorları için pozitif hasta 11 anlatıldığı gibi bazal ganglion ensefalit tipik bir klinik sendrom vardı, ve serum numuneleri D2R knock-out beyin bölümleri, transfekte hücreleri ve nöronlar 11 kullanılarak D2R antikorların pozitif kanıtlandı.
Hastalarda antikor pozitif belirlemek amacıyla, antikor pozitif eşik ya da kesme, yukarıdaki üç standart sapma eklenerek her deneyde hesaplandıOND kontrollerin ΔMFI demek. D2R Enc ile: 6/6 hasta insan yüzey D2R IgG antikoru (Şekil 3B) için pozitif oysa NMDAR Enç ile 4/4 hasta, insan yüzey NMDAR IgG antikoru (Şekil 3A) için pozitif teyit edilmiştir. Pozitif hastaların hiçbirinde NMDAR ve D2R hedefleyen antikorlar için çift pozitif idi. NMDAR ve D2R antikorların analiz OND kontrol hiçbirinde tespit edilmedi (Şekil 3A ve 3B). Üç tekrarlanan deneyler üzerinden en az iki eşik değerin üzerinde olsaydı hasta numune pozitif kabul edildi.
Şekil 1. Hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akışı ile antikor tespiti:. Strateji ve veri analizi yolluk Liv E HEK293 CTL hücreleri ve HEK 293 D2R + kararlı transfektanları ileri dağılım (FSC) ve yan dağılım (SSC) (, A, D, sırasıyla% 74.7 ve% 68.5) dayalı kapılı edilmiştir. HEK293 KVK ve HEK293 D2R + hücreler (sırasıyla% 32.8 ve% 95.4; B, E) içinde GFP pozitif hücreler - hücreler (, B, E sırasıyla% 67.2 ve% 4.6) daha untransfected GFP dışlamak için Geçitli edildi. GFP + hücreleri içinde AF647 konjuge edilmiş anti-insan IgG ikincil antikoru ile ilişkili ortalama floresan yoğunluğu (MFI) (= 3.657 HEK293 CTL; HEK293 D2R + = 9128) (C, F) ölçülmüştür. İnsan numuneler için, ΔMFI HEK293 D2R + hücreleri (G) 'den HEK293 CTL hücrelerinin MFI çıkarılarak hesaplandı. D2R antikor tespiti temsili veriler gösterilir. ank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 2. Hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akış ile belirlenen yüzey NMDAR ve D2R sentezlenmesi. HEK293 NMDAR + (A), HEK293 D2R + (B) ve HEK293 CTL hücreleri uygun bir ikincil antikor, ardından birincil antikor seri seyreltileri ile boyandı. NMDAR ve D2R yüksek yüzey ifadesi gözlendi. Bu birincil antikor artan konsantrasyonları ile artmıştır olarak MFI değerleri antikor titresi ile korelasyon göstermiştir. Beklendiği gibi, HEK293 CTL hücrelerinde yüzey NMDAR veya D2R hiçbir tespiti vardı. Örnek verileri gösterilir.boş "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.
Şekil 3,. Hastaların. NMDAR ensefalit Sera (NMDAR Enç, n = 4), diğer nörolojik hastalıklar, D2R antikor ilişkili ensefalit (D2R Enç, n = 6) hasta, ya da kontroller (OND bir kohort yüzey NMDAR ve D2R antikorların tespiti Onaylandı , n = 26 ya da 24), canlı HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + ve CTL HEK293 hücreleri ile kuluçkalanmıştır AF647-konjüge edilmiş anti-insan IgG ikincil antikoru ile takip edildi. OND kontrol (0/26 ve 0/24) ya da yok oldu ise yüzey NMDAR ve D2R antikorlar, 4/4 NMDAR Enc hastaya (A) ve sırasıyla 6/6 D2R Enc hastada (B), serumunda tespit edilmiştir antikoru (A, B). Dottegrafikler d çizgi OND kontrollerin ortalama ΔMFI üç standart sapma eklenerek hesaplanan pozitiflik eşiği temsil eder. Üç deneyler üzerinden temsili nokta araziler gösterilmiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, bir yüksek verimli bir örneği kullanarak, belirli hücre yüzeyi proteinlerini nöronal hedef antikorları tespit etmek için bir canlı hücre bazlı bir deneyde akış sitometrisi yeni bir uygulamasını tarif etmektedir. Bu tekniği kullanarak, otoimmün sinir sistemi hastalığı olan etkilenen hastaların bir alt grubu NMDAR yüzey veya D2R yüzey serum antikorları sahip olduğunu bildirmektedir.
Canlı hücre bazlı bir deneyde sitometri bu yüksek verimli bir akış kullanılarak uygun antikor tespiti için gerekli adımlar sağlıklı transfekte edilmiş hücrelerin yüksek bir verim elde etme) 1 arasında, ilgi alanındaki antijene 2) doğrulanması, yüksek hücre yüzey ifadesi, 3) bir antikorun bir eşik kurulması pozitif kontrollerin bir grubu kullanılarak, 4) ve verilerin teyit tekrarlanabilirlik.
Sağlıklı hücre kültürü bu tekniğin başarısı için esastır. HEK293 hücreleri, kültür, yüksek transfeksiyon verimi ve nöronal ifade onların eksikliği kolaylığı için iyi bilinenproteinler, ki bunlar genellikle spesifik nöronal 4,5,8-10 antijenlere karşı antikor tespit etmek için hücre bazlı deneylerde kullanılmıştır nedeni budur. Bu deney doğru MFI hesaplamak için canlı GFP + hücrelerinin büyük bir bölümünü elde etmek için bir optimum transfeksiyon oranı önemlidir. O önce defalarca transfect hücrelere zorunda değil kolaylık ile, GFP + hücrelerin tutarlı bir yüksek düzeyde sağlar Bu nedenle, bir GFP poliklonal stabil hücre hattı + HEK293 NMDAR +, HEK293 D2R + veya HEK293 CTL'yi üreten hücreleri avantajlıdır Her deney. Ters bir mikroskop aracılığıyla transfekte hücrelerin hızlı bir görüntüleme sağlıklı hücreleri (cıva lambası varsa GFP + hücreler floresan olacak) kontrol etmek için tavsiye edilir. Canlılığı çok yüksek değil gibi görünüyor, bu sitometresinin akış hücre satın önce böyle 7-amino-aktinomisin D gibi bir canlılığı boya, kullanmak yararlı olabilir ve analizana ekstra yolluk adım eklemek içincansız hücreleri hariç etmektir.
Otoimmün hastalıklarda merkezi sinir sistemi, beyin antijenlerinin hücre-dışı etki bağlanan antikorlar bu nedenle önem Geçirgen ve canlı hücreler kullanılarak antikorların tespiti üzerine yerleştirilir, patojenik 2,3,7,13,14 olduğu düşünülmektedir. Bu protokol, yüzey antijenlerini eksprese eden transfekte edilmiş hücreler kullanılarak bu amaca ulaşır. Bu nedenle, yüzeye bu antijenlerin doğru ihraç ilgilenilen antijene karşı ticari bir birincil antikor bir seri seyreltmeleri ile transfekte edilmiş hücrelerin boyanması ile tespit edilmesi gerekmektedir. Geçirgen hale getirilmemiş hücreleri üzerinde yüzey antijeninin ekspresyon düzeyini değerlendirmek, bu proteinin bir hücre dışı epitop hedefleyen bir antikor kullanmak için gereklidir. Spesifik bir antikor mevcut değilse, bu antijenin hücre dışı bir alanındaki bir etiket eklemek için gerekli ve daha sonra yüzey ekspresyonunu belirlemek için etiket karşı ticari bir antikor kullanabilir. Biz başarıyla varBir hemaglitüninde-etiketli D2R kullanarak bu yaklaşımı kullanılmış ve etiketi kendisi 11 hasta serumunun immunoreaktivitesini dışladı. Bu, hücre membranında sentezleme ve yapısal bütünlüğünü tehlikeye değildir, böylece ilgilenilen antijen tüm cDNA sekansı, uygun bir vektör içine alt klonlanır olması da önemlidir. Gerçekten de, daha önce, bir reseptör proteini, özellikle hücre zarı alanları 18 içine doğru katlanır, ihracat ve entegrasyon için gerekli olduğu gösterilmiştir.
Hücre tabanlı deneyleri akış sitometri, her deneyde hasta serumunun antikor pozitifliğinin değerlendirilmesi kontrollerin bir kohort türetilmiş bir eşik veya sınır değerinin kurulmasına bağlıdır. Zhou et al. 19 ortalama floresan yoğunluğu Δmedian iki standart sapma eklenerek antikor pozitif bir eşik hesaplanır ve bu, yaklaşık olarak, sağlıklı kontrol aralığının 95 inci yüzdelik karşılık geldi. Içindeönceki çalışmalar, daha yüksek bir kesim sağlıklı kontrol aralığı 11,20 ve 99 inci persentil karşılık, (kontrol kohortunun ortalama Δ MFI üç standart sapmanın eklenmesi) seçti. Buna ek olarak, McLaughlin ve ark. 16 antijeni sentezleyen hücrelerin ve antijen-negatif hücreleri arasında MFI oranı olarak özel antikor tepkimesi ölçümünü ifade etti. 5 'den daha büyük olan bir oranı pozitif olarak kabul edilir ve çalışmalarımız benzer kontrollerin ortalama oranı, yukarıdaki üç standart sapma karşılık edildi. Daha yüksek bir eşik kullanarak protokol sıkılığı artar ve kontroller ve antikorların pozitif hastalar arasında ayrımcılık geliştirir. Önemlisi, bizim deneyim, sağlıklı kontrol aralığının antikor reaktivitesi calculat için nüfusun ya kullanılmasını sağlayan, OND aralıktan daha farklı değildiantikor pozitifliğinin 11,20 e eşik.
Tüm araştırma deneylerde olduğu gibi, veri tekrarlanabilirlik şeyden önemlidir. Bu üç bağımsız deneyin üzerinden en az iki pozitif eşiğinin üzerinde ise, belirli bir hasta sera nöronal antijene karşı antikor için pozitif kabul edilir. Bireysel hastalar serum IgG konsantrasyonları değişen var. Bu varyasyonlar diğer hastalara göre antikor bağlanması, düzeyine üzerinde bir etkiye sahip olabilir. Daha önceki çalışmada kullanılan tüm hasta sera nefelometrisi ile ölçülür ve normal (6,2-14,4 g / L) 11 içinde olduğu bulundu ve her zaman aynı seyreltme faktörü ile serum seyreltilmiştir. Bireysel serumun titre eğrisi oluşturulması hastalar arasında antikor konsantrasyonları karşılaştırmak için faydalı olabilir. Buna ek olarak, araştırmacı ilk tarafın habersiz hücre bazlı bir deneyde boyunca tavsiye edilen, ancak kontrol varsaymak hesaplamak için kör gereken birivity eşik.
Makul bir antikor hedef bulunduğunda, uygun doğrulama yanlış pozitifliği önlemek için gereklidir. Hücre bazlı bir deneyde sitometri akışı kullanılarak tespit antikor-pozitif ya da negatif numuneler tercihen denatüre veya doğrusallaştırılmış antijenleri kullanan olmaz bir başka metot kullanılarak test edilmesi gerekir. Örneğin, antijen spesifik knock-out hayvanlardan beyin kesitleri üzerinde imüno tepkiyi azalma başarılı bir şekilde çok sayıda oto-9-11,21 yeni bilgi CNS durumunda gösterilmiştir. Antijen salgılayan hücreler üzerinde hasta serumlarının immunoabsorpsiyon sonuçları 9,11 doğrulamak için kullanılmıştır.
Bu yazıda tarif edilen hücre bazlı deney protokolü sitometri akışı kolayca merkezi sinir sistemi dışında bulunan da dahil olmak üzere, farklı antijenik hedefler, bir çok antikor özgüllüğü değerlendirmek için değiştirilebilir. Bu, diğer bilinmeyen özgüllükler antikorlar olduğu ve henüz mevcut olması muhtemeldirtespit edilmiştir. Daha önceki çalışmalarda 11,20 'de gösterildiği gibi Ayrıca, bu teknik, IgM dahil olmak üzere Ig'nin farklı sınıflar ve alt sınıflar, tespit edilmesi için uygundur. IgG alt sınıf belirlenmesi de hastalık patogenezinde katkı potansiyelini ortaya çıkarabilir. Örneğin, IgG1 ya da IgG3 antikor-bağımlı hücre-aracılı sitotoksisite aracılık eden ya da komplemana bağımlı antikor kaynaklı mekanizmaları patojenik 14,20,22 bildirilmiştir sitotoksisite, edebiliyoruz. AF647 (uzak kırmızı) dışında Floresan boyalar da sürece şimdiye kadar raportör molekülün, GFP bu emisyon tepe noktaları gibi kullanılabilir. Herhangi bir örtüşen emisyon spektrumları doğru kompanzasyon şartlara sahip olmalıdır. Hücreler ilk olarak sabit ve antikor bağlayıcı antijen kullanılabilir hale getirmek için geçirgen olması gerekir, ancak, hücre içi bir proteine bir antikorun özgünlüğünü belirlemek de, akış sitometrisi kullanılarak mümkün olur. Bu alternatif teknik, yüksek backgrou sonuçlanabilirnd nedeni, aksi takdirde, canlı hücrelerde Geçirgen gizlenmiş hücre için alanlarının yanı sıra çok sayıda hücresel antijenlere karşı antikorların maruz kalma. Bu faktörler hücre bazlı bir deneyde ve uygun kontroller göre gerçekleştirilmelidir sitometri akışının gücünü azaltabilir.
Hücre bazlı bir deneyde sitometri yüksek verimli bir akışın kullanımı hastaların büyük bir kohort insan serum içinde antikorların tespiti için güvenilir ve doğru bir metot sağlar. Bu teknik sayesinde, ek yeni antikorlar Keşfi tanı ve otoimmün merkezi sinir sistemi hastalıkları olan hastaların tedavi gelecek yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması: Bir patent otoantikorlar için hedef olarak D2R iddia FB ve RCD (Sydney Üniversitesi) tarafından dava açılmıştır.
Acknowledgments
Bu çalışma, Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Star Bilimsel Vakfı (Avustralya), Tourette sendromu Derneği (ABD) tarafından desteklenen, Trish Multipl skleroz Araştırma Vakfı ve Multipl Skleroz Araştırma Avustralya, Petre Vakfı (Avustralya), Rebecca L. Cooper Tıbbi Araştırma Vakfı (Avustralya). Hepimiz hasta ve bizim çalışma için örnekleri verilen aile üyelerine teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 | |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
