Bone Marrow-avledet Macrophage Produksjon
Summary
Makrofager har lenge vært anerkjent som en kritisk komponent i den medfødte og ervervede immunresponser. Den siste eksplosjonen av kunnskap knyttet til evolusjonære, genetiske og biokjemiske aspekter av samspillet mellom makrofager og mikrober har fornyet vitenskapelig oppmerksomhet til makrofager. Denne artikkelen beskriver en metode for å skille makrofager fra mus benmarg.
Abstract
Makrofager er kritiske komponenter i den medfødte og ervervede immunresponser, og de er de første forsvarslinje mot fremmede inntrengere på grunn av sine kraftige mikrobicide aktiviteter. Makrofager er vidt fordelt gjennom hele legemet, og er til stede i de lymfoide organer, lever, lunger, mage-og tarmkanalen, sentralnervesystemet, ben og hud. På grunn av deres partisjonere, deltar de i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser. Makrofager er svært allsidige celler som er i stand til å gjenkjenne microenviron endringer og å opprettholde vev homeostase. Mange patogener har utviklet mekanismer for å bruke makrofager som trojanske hester for å overleve, gjenskape i, og infisere både mennesker og dyr, og for å forplante seg i hele kroppen. Den nylige eksplosjon av interesse i evolusjonære, genetiske og biokjemiske aspekter av host-patogen interaksjoner har fornyet vitenskapelig oppmerksomhet om makrofager. Her beskriver vi enFremgangsmåten for å isolere og dyrke makrofager fra murin benmarg som vil gi et stort antall makrofager for å studere host-patogen interaksjoner, så vel som andre prosesser.
Introduction
En betydelig del av makrofagfunksjonen er deres rolle i medfødt og adaptiv immunitet. På grunn av deres evne til å phagocytose inerte partikler, bakterier eller parasitter, makrofager er en første forsvarslinje mot fremmede inntrengere. Når internalisert, er mikrober degradert innen phagolysosomes. Makrofager også sende rekrutterings signaler for og presentere antigener til andre immunceller som T-lymfocytter. Makrofager er avledet fra monocytter. Oppstår monocytter i benmargen fra myeloid stamceller og migrere til perifert blod og ulike vev der de differensieres til makrofager. Det er anslått at en frisk voksen mus inneholder ca 10 8 makrofager som er fordelt over hele kroppen på forskjellige organer og vev (tabell 1) 1,2. Makrofager vise stor fenotypiske og funksjonelle mangfold på grunn av deres evne til å tilpasse seg deres mikromiljøet 3,4. Det viktigste macropHage egenskapen er deres cidiske aktivitet, som er definert ved deres evne til å phagocytose mikrober og ødelegge dem. Den fagocytisk respons er definert ved aktivering av komplekse signalnett som stimuleres av mikrobiell kontakt, derfor, makrofager modulere genekspresjon passende som respons på forskjellige stimuli. Etter fagocytose, er mikrober eliminert i en struktur kalt phagolysosome, men har mange sykdomsfremkallende mikrober utviklet strategier for å styrte den mikrobedrepende funksjon av makrofager fem. Mangfoldet av Subversion mekanismer som benyttes av ulike mikrobielle arter er et testament til kompleksiteten i phagocytic prosessen seks og phagolysosome biogenesis. Smittsomme sykdommer er store menneskelige helseproblemer, og mange mekanismer og molekyler delta i makrofager antimikrobielle aktiviteter. Videre er målene for de mikrobicide egenskaper som er kapret av mikroorganismer er imidlertid ukjent, og derfor er det en eXplosion av interesse i de evolusjonære, genetiske og biokjemiske aspekter av vert-patogen interaksjoner som har fornyet vitenskapelig oppmerksomhet om makrofager. For tiden blir størstedelen av den forskning på feltet gjøres på makrofager cellelinjer, som skiller seg fra primær-makrofager i den fagocytisk aktivitet av cytokiner produksjon og reguleringen av oksidativ brist. I tillegg er de mindre egnet for mikroskopi. For å undersøke samspillet makrofager-patogener, anbefales det å bruke primære makrofager, som for eksempel benmargen makrofager som stammer (BMDMs), som viser mer fysiologiske funksjoner. Videre er det mulig å arbeide på genetisk modifiserte BMDMs, fordi disse makrofagene kan bli isolert direkte fra transgene mus og med tilgjengeligheten av nye teknologier som lentiviral transfeksjon, deres genekspresjon profilen kan endres av genet overekspresjon eller RNA-interferens. Her beskriver vi en prosedyre for å skille murine bein marrow inn makrofager som vil gi et stort antall makrofager i 7 dager for ulike funksjonelle analyser som proteomikk 7, transcriptomics 8, studerer intracellulær trafficking 9, dynamiske studier 10, genetiske skjermer (RNAi) og narkotika screening 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet heri detaljer en metode for å produsere et stort antall BMDMs. BMDM er primære celler og har den biologiske funksjon og egenskaper av makrofager skiller seg fra monocytter, fordi det er modent, i motsetning til makrofag-cellelinjer, som er umoden. BMDMs kan anvendes for genetisk screening (RNAi), medikamentscreening, funksjonelle studier, vert-patogen interaksjonsstudier og mange andre deler av undersøkelsen.
Fremgangsmåten presentert heri er meget enkel og krever i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av CNRS (PICS 2012-2014 til EG) og ved en bevilgning fra Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 til Giovanna Mottola). Filippo Conti er en kar av Scientific Cooperation Foundation'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit er en kar av det franske departementet for forskning og teknologi. Finansieringskildene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling, dataanalyse, beslutningen om å publisere, eller manuskript forberedelse.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. . Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. . Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
