Summary
Makrofager har lenge vært anerkjent som en kritisk komponent i den medfødte og ervervede immunresponser. Den siste eksplosjonen av kunnskap knyttet til evolusjonære, genetiske og biokjemiske aspekter av samspillet mellom makrofager og mikrober har fornyet vitenskapelig oppmerksomhet til makrofager. Denne artikkelen beskriver en metode for å skille makrofager fra mus benmarg.
Abstract
Makrofager er kritiske komponenter i den medfødte og ervervede immunresponser, og de er de første forsvarslinje mot fremmede inntrengere på grunn av sine kraftige mikrobicide aktiviteter. Makrofager er vidt fordelt gjennom hele legemet, og er til stede i de lymfoide organer, lever, lunger, mage-og tarmkanalen, sentralnervesystemet, ben og hud. På grunn av deres partisjonere, deltar de i en rekke fysiologiske og patologiske prosesser. Makrofager er svært allsidige celler som er i stand til å gjenkjenne microenviron endringer og å opprettholde vev homeostase. Mange patogener har utviklet mekanismer for å bruke makrofager som trojanske hester for å overleve, gjenskape i, og infisere både mennesker og dyr, og for å forplante seg i hele kroppen. Den nylige eksplosjon av interesse i evolusjonære, genetiske og biokjemiske aspekter av host-patogen interaksjoner har fornyet vitenskapelig oppmerksomhet om makrofager. Her beskriver vi enFremgangsmåten for å isolere og dyrke makrofager fra murin benmarg som vil gi et stort antall makrofager for å studere host-patogen interaksjoner, så vel som andre prosesser.
Introduction
En betydelig del av makrofagfunksjonen er deres rolle i medfødt og adaptiv immunitet. På grunn av deres evne til å phagocytose inerte partikler, bakterier eller parasitter, makrofager er en første forsvarslinje mot fremmede inntrengere. Når internalisert, er mikrober degradert innen phagolysosomes. Makrofager også sende rekrutterings signaler for og presentere antigener til andre immunceller som T-lymfocytter. Makrofager er avledet fra monocytter. Oppstår monocytter i benmargen fra myeloid stamceller og migrere til perifert blod og ulike vev der de differensieres til makrofager. Det er anslått at en frisk voksen mus inneholder ca 10 8 makrofager som er fordelt over hele kroppen på forskjellige organer og vev (tabell 1) 1,2. Makrofager vise stor fenotypiske og funksjonelle mangfold på grunn av deres evne til å tilpasse seg deres mikromiljøet 3,4. Det viktigste macropHage egenskapen er deres cidiske aktivitet, som er definert ved deres evne til å phagocytose mikrober og ødelegge dem. Den fagocytisk respons er definert ved aktivering av komplekse signalnett som stimuleres av mikrobiell kontakt, derfor, makrofager modulere genekspresjon passende som respons på forskjellige stimuli. Etter fagocytose, er mikrober eliminert i en struktur kalt phagolysosome, men har mange sykdomsfremkallende mikrober utviklet strategier for å styrte den mikrobedrepende funksjon av makrofager fem. Mangfoldet av Subversion mekanismer som benyttes av ulike mikrobielle arter er et testament til kompleksiteten i phagocytic prosessen seks og phagolysosome biogenesis. Smittsomme sykdommer er store menneskelige helseproblemer, og mange mekanismer og molekyler delta i makrofager antimikrobielle aktiviteter. Videre er målene for de mikrobicide egenskaper som er kapret av mikroorganismer er imidlertid ukjent, og derfor er det en eXplosion av interesse i de evolusjonære, genetiske og biokjemiske aspekter av vert-patogen interaksjoner som har fornyet vitenskapelig oppmerksomhet om makrofager. For tiden blir størstedelen av den forskning på feltet gjøres på makrofager cellelinjer, som skiller seg fra primær-makrofager i den fagocytisk aktivitet av cytokiner produksjon og reguleringen av oksidativ brist. I tillegg er de mindre egnet for mikroskopi. For å undersøke samspillet makrofager-patogener, anbefales det å bruke primære makrofager, som for eksempel benmargen makrofager som stammer (BMDMs), som viser mer fysiologiske funksjoner. Videre er det mulig å arbeide på genetisk modifiserte BMDMs, fordi disse makrofagene kan bli isolert direkte fra transgene mus og med tilgjengeligheten av nye teknologier som lentiviral transfeksjon, deres genekspresjon profilen kan endres av genet overekspresjon eller RNA-interferens. Her beskriver vi en prosedyre for å skille murine bein marrow inn makrofager som vil gi et stort antall makrofager i 7 dager for ulike funksjonelle analyser som proteomikk 7, transcriptomics 8, studerer intracellulær trafficking 9, dynamiske studier 10, genetiske skjermer (RNAi) og narkotika screening 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Erklæring
Protokollen for dyr behandling ble godkjent av vår institusjonelle Animal Ethics Committee "Conseil Scientifique du Centre de Dannelse et de Recherche Experimental Médico-Chirurgical" (CFREMC, Prosjekt tillatelse 10-300122013 til Eric Ghigo) fra Aix-Marseille Universitet i samsvar med reglene av Décret N ° 87-848 av 10/19/1987. Forsøkene ble utført ved Faculté de Médecine de la Timone (Eksperimentering tillatelse nummer 13,385 til Eric Ghigo).
En. Materiale og kultur Media Forberedelse
- Steril to tang, to sakser, to kirurgiske kniver, en morter og en stampe.
- Få fullstendig DMEM inneholdende 10% kalvefosterserum (FCS), 2 mM glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin.
- Spe 10x PBS i sterilt distillated vann for å få 1x PBS.
- Skaff iskald 1x PBS, iskald komplett DMEM, komplett DMEM waRMED til 37 ° C.
2. Utarbeidelse av L929 Cell Supernatanter
- Grow L929 celler til samløpet (tjue 175 cm 2 kolber) i fullstendig DMEM ved 37 ° C, 5% CO 2.
Merk: granulocytt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF) er nødvendig for å indusere hematopoietisk celle differensiering til makrofager 12. L929 cellene produserer GM-CSF.
- Ved samløpet, erstatte kultur media med friske komplett DMEM. Overfør kolber til 32 ° C, 5% CO2 i 10 dager.
- Samle, basseng og sentrifuger supernatantene ved 750 xg i 10 min. Kast celle pellets.
- Oppbevar Supernatantene i 15 ml rør og oppbevar ved -20 ° C.
Tre. Bone Marrow-avledet Macrophage (BMDM) Forberedelse
- Sacrifice en mus ved halshugging.
- Bruk sterile kirurgiske kniver gjennom hele forsøket. Desinfiser huden med 70% alkohol, narkohol. Gjøre et snitt på toppen av hvert bakben og trekker huden ned mot foten for å eksponere muskelen.
- Klipp av bakbena, fjerne hud med steril saks og steril pinsett. Plasser ben i en steril petriskål (35/10 mm) inneholdende sterilt, iskald 1 x PBS (5 ml).
- Fjern kjøttet og musklene som fester seg til bein med steril saks og pinsett.
- Overfør benene til en ny, steril petriskål (35/10 mm) inneholdende is-kald, steril 1 x PBS (5 ml). Vask benene to ganger med 5 ml is-kald, steril 1 x PBS.
- Overfør benet i en steril morter med 5 ml is-kald, steril 1 x PBS.
- Skjær tibia fra femur ved skjøten med steril saks. Knuse benene forsiktig i en steril morter med 5 ml is-kald, steril 1 x PBS ved hjelp av en støter.
- Samle supernatanten i iskalde 15 ml rør. Gjenta dette trinnet 3x.
- Filtrer gjennom en 70 mikrometer Nylon celle strainer å fjerne solide fragmenter. Sentrifuger filtratet ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Forsiktig kast supernatanten. Dissosiere pelleten i 10 ml røde blodceller lysis buffer for 30 sek. Legg 20 ml iskald, komplett DMEM.
Merk: Formålet med dette trinnet er å fjerne forurensende røde blodceller, og derfor må dette trinnet kan utføres i løpet av 2 min for å unngå hematopoietic cell endring av den røde blodcellelyseringsbuffer.
- Sentrifuger ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Forsiktig kast supernatanten. Dissosiere pelleten i 20 ml komplett DMEM som har blitt varmet til 37 ° C.
- Overfør dissosiert celler i to petriskåler (100/20 mm). Inkuber dem i 4 timer ved 37 ° C.
- Samle supernatantene i 50 ml rør ved romtemperatur. Kast rettene som inneholder de fastboende makrofager.
Merk: Målet med dette trinnet er å eliminere bosatt bein Marrow makrofager ved sin evne til å forholde seg til kultur-behandlet plast. Disse hørende makrofager kan anvendes i andre eksperimenter.
- Sentrifuger samlede supernatanter ved 450 xg i 10 min ved 4 ° C. Kast supernatanten.
- Distansere forsiktig pelleten i 10 ml komplett DMEM inneholder 15% L929 celle supernatant. Filter cellene gjennom en 40 mikrometer Nylon celle sil.
- Gjenopprette filtratet. Tilsett oppsamlet filtrat (10 ml) til 140 ml komplett DMEM som er supplementert med 15% L929 cellemateriale.
- Fordel 10 ml av cellesuspensjonen pr petriskål (15 petriskåler, 100/20 mm). Inkuber cellene ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Grow celler for tre dager
- Tilsett 10 ml komplett DMEM som er supplementert med 15% L929. Inkuber cellene for fire ekstra dager.
Merk: Overvåk cellevekst jevne med en invertert mikroskop (trinn 3.14 til 3.16). Heftende makrofager vil væreobservert etter 3 dager av kulturen.
4. Høsting BMDMs
- Fjern supernatanten. Vask BMDMs to ganger med komplett DMEM
- Tilsett 5 ml komplett DMEM som er blitt oppvarmet til 37 ° C. Løsne BMDMs ved å forsiktig skrape med en gummistav.
- Samle BMDMs i 50 ml rør og sentrifugert ved 450 xg i 10 min. Forsiktig distansere celle pellets i 20 ml komplett DMEM.
- Telle BMDMs i nærvær av trypan blå (ingen mortalitet mer enn 10% bør observeres).
Merk: Vanligvis er ca 6-7.5 x 10 7 makrofager innhentet fra 15 petriskåler (100/20 mm) av makrofager. Det er ca 4-5 x 10 6 makrofager / petriskål (100/20 mm).
- Forbered BMDMs som kreves for forsøket. Etter 16 timer i fullstendig media ved 37 ° C, 5% CO2, makrofager vil igjen følge til bæreren.
5. Lagring BMDMs
- Samle isolerte BMDMs (trinn 4,3). Sentrifuger ved 450 xg i 10 min. Merk: BMDMs kan fryses i flytende nitrogen.
- Resuspender cellepellets i iskaldt materiale bestående av 10% DMSO og 90% FCS ved en endelig konsentrasjon på 4 x 10 6 celler / ml, og 1 ml pipette til hver ampulle.
- Fryse cellene ved en avkjølingshastighet på 1 ° C / min. Etter 24 hr, overfører ampullen til en flytende nitrogen-beholder for langtidslagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med denne fremgangsmåten var for enkelt å oppnå et stort antall makrofager i noen dager. Den benmargscelle preparatet er illustrert i figur 1.. Bones fra bakbenet ble samlet inn og knust i en morter. Når beboeren makrofager ble fjernet fra benmargen celleforberedelsen, ble benmargceller inkubert med GM-CSF (Dag 0). Etter 3 dager ble cellene, som var runde og ikke-adherente før kulturen, begynner å differensiere til makrofager, og holder seg (figur 1A). Cytometri analyse ved hjelp F4/80 og HLA-DR markører avdekket at cellene uttrykte begge merkene og dermed beviser at de er differensiert i makrofager (Figur 1B). Etter 7 dager, ble en BMDM monolayer fås med 6-7.5 x 10 7 BMDM / mus. Makrofager kan brukes i forskjellige typer av eksperimenter (figur 2). De funksjonelle aktiviteter av BMDMs kan bestemmes på forskjellige måter. For eksempel, BMDM phagocytoser ble overvåket av latex perle intern. Antall perler per celle økte med tiden (fig. 2A). BMDM endocytic potensial (figur 2B), ble bakterielle patogen interaksjoner (Figur 2C) og signaltransduksjonsveiene (figur 2D) også vurdert.
| Beliggenhet | Celletyper |
| Bone | Osteoklast |
| Benmargs | Pro-monocytter, makrofager |
| Sentralnervesystemet | Microglial celle |
| Lamina propria | Resident makrofag |
| Liver | Kupffer celle |
| Lunge | Alveolær makrofag |
| Perifert blod | Monocytter |
| Bukhulen | Peritoneal makrofag |
| Skin | Langerhans celle |
| Spleen | Resident makrofag |
| Thymus | Resident makrofag |
Tabell 1.. Makrofag-kilder i vev og væsker.
Figur 1. Skjematisk oversikt over BMDM produksjon. (A) Denne figuren illustrerer trinnene BMDM differensiering fra stamfar differensiering (dag 0) for å modne makrofager (day7). (B) FACS analyse illustrerer renhet av isolerte celler på dag 7 bruker som makrofager markører HLA-DR og F4/80. Klikk her for å se stortr figur.
Figur 2. Eksempler på forsøk som er mulig med. BMDMs (A) Fagocytose assay. BMDMs ble inkubert i forskjellige perioder med latekskuler, og vulsten opptak ble observert ved mikroskopi. (B) Intracellulær Coxiella burnetii lipopolysakkarid (LPS) lokalisering i BMDMs. LPS (i rødt) ble lokalisert til en kupé som havner lysosomal-assosiert membran protein-1 (LAMP-1) (i blått), men ikke kathepsin D (i grønt). Dette eksperimentet viser at LPS er til stede i slutten endosomes som ikke klarer å fusjonere med lysosomer. (C) BMDMs infisert med Tropheryma whipplei (i rødt) ble ikke lokalisert i kammer som havner cathepsin D (i grønt). (D) Representant immunobMange viser total (t) og fosforylert (p) p38α MAP Kinase nivåer i Escherichia coli LPS-stimulerte BMDMs (1 pg / ml). Scale barer representerer 5 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet heri detaljer en metode for å produsere et stort antall BMDMs. BMDM er primære celler og har den biologiske funksjon og egenskaper av makrofager skiller seg fra monocytter, fordi det er modent, i motsetning til makrofag-cellelinjer, som er umoden. BMDMs kan anvendes for genetisk screening (RNAi), medikamentscreening, funksjonelle studier, vert-patogen interaksjonsstudier og mange andre deler av undersøkelsen.
Fremgangsmåten presentert heri er meget enkel og krever ikke noe spesialutstyr, og derfor kan det lett utføres i et laboratorium eller et klasserom. Denne metoden krever litt øvelse og fingerferdighet. Det er også mulig å lagre BMDMs i flytende nitrogen og letter således fremtidige eksperimenter.
Det er flere viktige skritt for vellykket BMDM kultur: 1) opprettholde et sterilt, sunn kultur, 2) benmarg utvinning må være effektiv; 3) L929 supernatant kvalitet er kritisk, 4) må ikke utsettes cellene til de røde blodcellelyse buffer for mer enn to minutter å unngå blodkreft celleskader.
Det er mulig å gjøre noen modifikasjon av protokollen, men det er å begrense antallet. 1) DMEM kan erstattes av RPMI 1640, men BMDM produksjonen er mindre effektive, 2) kommersiell M-CSF (500-1000 UI / ml) kan brukes i stedet for L929 supernatant, men det er dyrt og M-CSF må være tilsatt hver 2 dager til cellene i løpet av differensieringsprosessen, 3) alternativt benmarg kan ekstruderes fra benet ved hjelp av en sprøyte utstyrt med 25 G nål i stedet for å knuse benene i en steril morter ved hjelp av en støter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen Oppgitte interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av CNRS (PICS 2012-2014 til EG) og ved en bevilgning fra Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 til Giovanna Mottola). Filippo Conti er en kar av Scientific Cooperation Foundation'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit er en kar av det franske departementet for forskning og teknologi. Finansieringskildene hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling, dataanalyse, beslutningen om å publisere, eller manuskript forberedelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
