Summary
Макрофаги уже давно признаны как ключевой компонент врожденной и адаптивной иммунной реакции. Недавний взрыв знаний по проблемам эволюционной, генетических и биохимических аспектов взаимодействия между макрофагами и микробов возобновил научную внимание макрофагов. Эта статья описывает способ дифференцироваться макрофаги из костного мозга мыши.
Abstract
Макрофаги являются важнейшими компонентами врожденной и адаптивной иммунных реакций, и они являются первой линией обороны против иноземных захватчиков из-за их мощных бактерицидных деятельности. Макрофаги широко распространены по всему телу и присутствуют в лимфоидных органах, печени, легких, желудочно-кишечного тракта, центральной нервной системы, костей, и кожа. Из-за их передела, они участвуют в широком диапазоне физиологических и патологических процессах. Макрофаги очень универсальный клетки, которые способны распознавать микросреды изменения и поддерживать тканевого гомеостаза. Многочисленные патогены развивались механизмы использовать макрофаги как троянские кони, чтобы выжить, размножаться в, и заразить людей и животных и пропагандировать по всему телу. Недавний взрыв интереса к эволюционных, генетических и биохимических аспектов хост-патогенных взаимодействий возобновил научную внимание относительно макрофагов. Здесь мы описываемПроцедура, чтобы изолировать и культивировать макрофаги от мышиного костного мозга, который будет обеспечивать большое количество макрофагов для изучения хост-патогенных взаимодействий, а также другие процессы.
Introduction
Существенным аспектом функции макрофагов их роль в врожденного и адаптивного иммунитета. Из-за их способности фагоцитируют инертные частицы, бактерии или паразиты, макрофаги являются первой линией обороны против иноземных захватчиков. После того, как усвоены, микробы разлагаются в фаголизосомах. Макрофаги также отправить по подбору сигналы для и представить антигены других иммунных клеток, таких как Т-лимфоцитов. Макрофаги получены из моноцитов. Моноциты возникают в костном мозге из миелоидных стволовых клеток и мигрируют в периферической крови и различных тканях, где они дифференцируются в макрофаги. Считается, что здоровый взрослый мыши содержит около 10 8 макрофаги, которые распространяются по всему телу в различных органах и тканях (табл. 1) 1,2. Макрофаги проявляют большую фенотипические и функциональное разнообразие из-за их способности адаптироваться к их микросреды 3,4. Наиболее важным macropХадж свойство их бактерицидная активность, которая определяется их способностью фагоцитируют микробы и уничтожить их. Фагоцитарной ответ определяется активации сложных сетей сигнализации, которые стимулируются микробной контакта, таким образом, макрофаги модулировать экспрессию генов соответствующим образом в ответ на различные стимулы. После фагоцитоза, микробы будут устранены в структуре, называемой фаголизосом, однако многие болезнетворные микробы разработали стратегии, чтобы подорвать функцию микробицидную макрофагов 5. Разнообразие механизмов подрывной, которые используются различными видов микроорганизмов является свидетельством сложности процесса фагоцитоза 6 и фаголизосомы биогенеза. Инфекционные болезни являются главной проблемы со здоровьем человека, а также многочисленные механизмы и молекулы участвуют в макрофагов антимикробных деятельности. Кроме того, мишенями бактерицидных свойств, которые угнанных микробами остаются неизвестными, таким образом, существует еXplosion интереса к эволюционных, генетических и биохимических аспектов хозяин-патоген взаимодействий, которые возобновил научную внимание относительно макрофагов. В настоящее время большинство исследований в области делается на макрофагах клеточных линий, которые отличаются от первичных макрофагов в фагоцитарной активности, производство цитокинов и регуляции окислительного всплеска. Кроме того, они менее пригодны для микроскопии. Исследовать взаимодействие макрофагов-патогенные рекомендуется использовать первичные макрофаги, таких как костный мозг, полученных макрофагов (BMDMs), которые проявляют более физиологические особенности. Кроме того, можно работать на генетически модифицированных BMDMs, потому что эти макрофаги могут быть выделены непосредственно из трансгенных мышей и, при наличии новых технологий, таких как лентивирусов трансфекции их профиль экспрессии генов может быть изменена путем генной экспрессией или РНК-интерференции. Здесь мы описываем процедуру дифференцировать мышиный кости мстрелка в макрофаги, которые обеспечат большое количество макрофагов в 7 дней для различных функциональных анализов, таких как протеомики 7, транскриптомику 8, внутриклеточный торговля изучает 9, динамические исследования 10, генетические экранов (RNAi) и наркотики 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике
Протокол для обращения с животными был одобрен нашей институциональной комитета животных Этика "Conseil Scientifique дю-центр де Формирование и др. по исследованиям экспериментальной медико-Chirurgical" (CFREMC, разрешение Проект 10-300122013 Эрику Ghigo) от Экс-Марсель университета в соответствии с правилами из Décret N ° 87-848 от 10/19/1987. Эксперименты проводились на faculté де Médecine де-ла-Timone (разрешение Эксперименты числа 13,385 Эрику Ghigo).
1. Материал и культура Подготовка Медиа
- Стерилизовать два щипцы, два ножницы, две хирургические лезвия, ступки и пестика.
- Получить полную DMEM, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FCS), 2 мМ глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
- Развести 10x PBS в стерильной дистиллированной воде, чтобы получить 1X PBS.
- Получить ледяной 1x PBS, ледяной полный DMEM, полные DMEM ваРМЕД до 37 ° C.
2. Подготовка L929 клеток супернатантов
- Расти клетки L929 до слияния (двадцать 175 см 2 колбы) в полной DMEM при 37 ° С, 5% СО 2.
Примечание: гранулоцитов-макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF) требуется, чтобы побудить кроветворную дифференцировку клеток в макрофаги 12. L929 клетки производят GM-CSF.
- При слиянии, заменить питательные среды с свежей полной DMEM. Трансфер колбы до 32 ° C, 5% CO 2 в течение 10 дней.
- Сбор, бассейн и центрифуги супернатантов при 750 мкг в течение 10 мин. Откажитесь ячейки гранул.
- Храните супернатанты в 15 мл пробирки и хранят при температуре -20 ° С.
3. Костного мозга, полученных макрофагов (BMDM) подготовка
- Жертвоприношение 1 мышь путем смещения шейных позвонков.
- Используйте стерильные хирургические лезвия в течение всего эксперимента. Лечить кожу 70% алкохол. Сделайте надрез в верхней части каждой задней ноги и потяните кожу вниз, к подножию, чтобы разоблачить мышцы.
- Отрежьте задние ноги, снять кожу с стерильными ножницами и стерильным пинцетом. Поместите ноги в стерильную чашку Петри (35/10 мм), содержащей стерильный, ледяной 1X PBS (5 мл).
- Снимите плоть и мышцы, которые, придерживаясь костей с стерильными ножницами и щипцами.
- Передача кости в новую, стерильную чашку Петри (35/10 мм), содержащего ледяной, стерильную 1X PBS (5 мл). Вымойте костей два раза 5 мл охлажденного льдом, стерильной 1x PBS.
- Передача кость в стерильных раствора, содержащего 5 мл охлажденного льдом, стерильную 1X PBS.
- Отрежьте голень от бедра на совместной с стерильными ножницами. Разбить кости осторожно в стерильной раствора, содержащего 5 мл охлажденного льдом, стерильную 1X PBS с помощью пестика.
- Сбор супернатант в ледяной 15 мл пробирок. Повторите этот шаг 3 раза.
- Фильтр через страте нейлон клеток 70 мкмIner для удаления твердых фрагментов. Центрифуга фильтрата при 450 х г в течение 10 мин при 4 ° С.
- Аккуратно отбросить супернатант. Диссоциируют осадок в 10 мл буфера для лизиса клеток красной крови в течение 30 сек. Добавить 20 мл ледяной, в комплекте DMEM.
Примечание: Цель этого шага заключается в удалении загрязняющих эритроциты, таким образом, этот шаг должен быть выполнен в течение 2 мин, чтобы избежать кроветворную изменение клеток красной буфера для лизиса клеток крови.
- Центрифуга при 450 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Аккуратно отбросить супернатант. Отделить осадок в 20 мл полной DMEM, который был нагревают до 37 ° С.
- Перенесите разложенных клетки в 2 чашки Петри (100/20 мм). Инкубировать их в течение 4 часов при 37 ° С.
- Сбор супернатантов в 50 мл пробирки при комнатной температуре. Откажитесь от блюд, содержащих макрофаги резидентов.
Примечание: Цель этого шага состоит в ликвидации костный Marro резидентаW макрофаги по их способности прилипать к культуральной обработке пластмассы. Эти резидентные макрофаги могут быть использованы в других экспериментах.
- Центрифуга собранные супернатантов при 450 мкг в течение 10 мин при 4 ° С. Удалите супернатант.
- Диссоциируют осторожно осадок в 10 мл полной DMEM, содержащей 15% L929 клеток супернатанта. Фильтр клетки через ситечко нейлон клеток 40 мкм.
- Восстановление фильтрата. Добавить собранную фильтрат (10 мл) в 140 мл полной DMEM, которая была дополнена 15% L929 клеток средах.
- Распределить 10 мл клеточной суспензии в чашку Петри (15 чашек Петри, 100/20 мм). Инкубируйте клетки при 37 ° С, 5% СО 2.
- Рост клеток в течение 3 суток
- Добавьте 10 мл в комплекте DMEM, которая была дополнена 15% L929. Инкубируйте клетки в течение 4 дополнительных дней.
Примечание: периодически контролировать рост клеток с помощью инвертированного микроскопа (шаги 3.14-3.16). Приверженец макрофаги будетнаблюдалось после 3 дней культивирования.
4. Сбор BMDMs
- Удалить супернатант. Вымойте BMDMs 2 раза с полной DMEM
- Добавить 5 мл полной DMEM, который был нагревают до 37 ° С Снять BMDMs, осторожно очищая с резиновой полицейского.
- Сбор BMDMs в 50 мл пробирки и центрифуге при 450 х г в течение 10 мин. Аккуратно отделить ячейки гранул в 20 мл полной DMEM.
- Всего BMDMs в присутствии трипанового синего (не более 10% смертность не должны быть соблюдены).
Примечание: Как правило, примерно 6-7,5 х 10 7 макрофаги получают из 15 чашки Петри (100/20 мм) от макрофагов. Есть приблизительно 4-5 х 10 6 макрофаги / Чашка Петри (100/20 мм).
- Подготовка BMDMs как это требуется для эксперимента. Через 16 ч в полной среде при 37 ° С, 5% СО 2, макрофаги снова прилипать к опоре.
5. Хранение BMDMs
- Сбор изолированных BMDMs (шаг 4.3). Центрифуга при 450 мкг в течение 10 мин. Примечание: BMDMs могут быть заморожены в жидком азоте.
- Ресуспендируют осадок клеток в замораживании носитель, состоящий из 10% ДМСО и 90% FCS до конечной концентрации 4 × 10 6 клеток / мл и 1 мл пипетки в каждую ампулу.
- Замораживание клеток при скорости охлаждения 1 ° С / мин. Через 24 ч передавать ампулу в емкости для жидкости азота в течение длительного хранения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель этого метода было легко получить большое количество макрофагов в несколько дней. Препарат клеток костного мозга показано на рисунке 1. Кости от задней ноги были собраны и разбил в ступке. После того, как резидентных макрофагов были удалены из клеточного препарата костного мозга, клетки костного мозга инкубируют с GM-CSF (день 0). После 3 дней, клетки, которые были круглыми и прилипших до культуры, начинают дифференцироваться в макрофагах и прилипать (фиг. 1А). Цитометрии анализа с использованием F4/80 и HLA-DR маркеры показали, что клетки выразил оба маркера тем самым доказав, что они дифференцируются в макрофаги (рис. 1б). После 7 дней, монослой BMDM был получен с 6-7,5 х 10 7 BMDM / мышь. Макрофаги могут быть использованы в различных типах экспериментов (рис. 2). Функциональные деятельность BMDMs может быть определена по-разному. Например, BMDM phagocytosе. контролировали с помощью латексный шарик интернализации. Количество шариков на ячейку со временем увеличилась (рис. 2А). BMDM эндоцитотический потенциал (рис. 2В), бактериальные патогенные взаимодействия (рис. 2, в) и путей передачи сигнала (рис. 2D) были также оценены.
| Расположение | Типы клеток |
| Кость | Остеокласт |
| Костный мозг | Pro-моноцитов, макрофагов |
| Центральная нервная система | Микроглии клетки |
| Собственной пластинки | Резидент макрофагов |
| Печень | Купфера клетки |
| Легкое | Альвеолярных макрофагов |
| Периферической крови | Моноцитов |
| Брюшная полость | Перитонеального макрофагов |
| Кожа | Клеток Лангерганса |
| Селезенка | Резидент макрофагов |
| Тимус | Резидент макрофагов |
Таблица 1. Макрофагов источники в тканях и жидкостях.
Рисунок 1. Схематическое изображение BMDM производства. (А) На этом рисунке показано этапы BMDM дифференциации от дифференциации предшественников (день 0) чтобы созреть макрофагов (Day7). (В) анализ СУИМ иллюстрирует чистоту изолированных клеток в 7-й день, используя в качестве макрофагов маркеров HLA-DR и F4/80. Нажмите здесь, чтобы посмотреть большоег цифра.
Рисунок 2. Примеры экспериментов, которые возможны с BMDMs. (А) Фагоцитоз анализов. BMDMs инкубировали в течение различных периодов времени с латексными шариками, и поглощение шарик наблюдали микроскопии. (В) внутриклеточный Coxiella burnetii липополисахарида (ЛПС) локализация в BMDMs. ЛПС (в красном) был локализован в отделение, что таит лизосом связанных мембраны белок-1 (LAMP-1) (синим цветом), но не катепсину D (зеленым цветом). Этот эксперимент показывает, что ЛПС присутствует в поздних эндосом, которые не могут сливаться с лизосом. (C) BMDMs инфицированные Tropheryma whipplei (в красном) не был локализован в отсеке, что таит катепсина D (зеленым цветом). (D) представитель immunobмного демонстрируя общей (т) и фосфорилируется (р) р38 уровни МАР-киназы в кишечной палочки ЛПС-стимулированных BMDMs (1 мкг / мл). Масштабные полоски представляют 5 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь подробно способ получения большого количества BMDMs. BMDM первичные клетки и обладают биологической функцией и свойства макрофагов дифференцированных из моноцитов, потому что есть зрелый, в отличие от макрофагов клеточных линий, которые незрелыми. BMDMs могут быть использованы для генетического скрининга (РНК-интерференции), скрининга лекарственных средств, функциональных исследований, исследований взаимодействия хост-патогенных и многих других областях исследования.
Процедура, представленные здесь очень прост и не требует никакого специального оборудования, поэтому он может быть легко выполнено в лаборатории или классе. Этот метод требует некоторой практики и ловкости рук. Кроме того, можно хранить BMDMs в жидком азоте, таким образом облегчая будущих экспериментов.
Есть несколько важных шагов для успешного BMDM культуры: 1) поддержание стерильной, здоровой культуры; 2) извлечение костного мозга должна быть эффективной, 3) L929 вирernatant качество имеет решающее значение; 4) не подвергайте клетки красной буфера для лизиса клеток крови в течение более 2 мин, чтобы избежать кроветворную повреждения клеток.
Это можно сделать некоторые модификации протокола но есть в ограничении количества. 1) DMEM может быть заменен на среде RPMI 1640, но BMDM производство является менее эффективным, 2) коммерческий M-CSF (500-1000 МЕ / мл) может быть использован вместо L929 супернатанта, но это дорого и M-CSF должен быть добавлены каждые 2 дня в клетках в процессе дифференцировки, 3) альтернативно костного мозга может быть экструдирован из кости с помощью шприца, оснащенный иглой 25 G вместо разбивая кости в стерильной ступке с помощью пестика.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Там нет объявленные конфликты интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана CNRS (фото 2012-2014 в EG) и грантом Regione Кампании (LR n.5, 28.03.2002 в Джованна Моттола). Филиппо Конти является членом Научного Сотрудничества Foundation'' Infectiopole Sud.'' Никола Boucherit является членом французского министерства по исследованиям и технологиям. Источники финансирования не было никакой роли в дизайн исследования, сбор данных, анализ данных, решение о публикации или печатных работ.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T. Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. 112, Raven Press. 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A.
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L.
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
