Medula Óssea derivadas de macrófagos Produção
Summary
Os macrófagos têm sido reconhecidos como um componente crítico das respostas imune inata e adaptativa. A recente explosão de conhecimentos relativos aos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos da interação entre macrófagos e micróbios renovou atenção científica para macrófagos. Este artigo descreve um método para diferenciar macrófagos de medula óssea de ratinho.
Abstract
Os macrófagos são componentes críticos das respostas imune inata e adaptativa, e eles são a primeira linha de defesa contra invasores estrangeiros por causa de suas poderosas atividades microbicidas. Os macrófagos são amplamente distribuído por todo o corpo e estão presentes nos órgãos linfóides, fígado, pulmões, tracto gastrointestinal, sistema nervoso central, ossos e pele. Por causa da sua repartição, que participam numa vasta gama de processos fisiológicos e patológicos. Os macrófagos são células altamente versáteis que são capazes de reconhecer alterações do microambiente e para manter a homeostase do tecido. Numerosos agentes patogénicos desenvolveram mecanismos para usar macrófagos como cavalos de Tróia para sobreviver, replicam em, e infectam os seres humanos e animais e para propagar ao longo do corpo. A recente explosão de interesse em aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos de interação patógeno-hospedeiro renovou atenção científica sobre macrófagos. Aqui, descrevemos umProcesso para isolar e cultivar macrófagos de medula óssea de murino que irá proporcionar um grande número de macrófagos para estudar interacções hospedeiro de organismos patogénicos, assim como outros processos.
Introduction
Um aspecto importante da função dos macrófagos é o seu papel na imunidade inata e adaptativa. Devido à sua capacidade de fagocitar partículas inertes, bactérias ou parasitas, os macrófagos são a primeira linha de defesa contra os invasores externos. Uma vez internalizado, micróbios são degradados dentro de fagolisossomas. Os macrófagos também enviam sinais de recrutamento para e antígenos presentes a outras células do sistema imunológico, como os linfócitos T. Os macrófagos são derivados dos monócitos. Os monócitos surgem na medula óssea a partir de células-tronco mielóides e migrar para o sangue periférico e vários tecidos, onde eles diferenciam-se em macrófagos. Estima-se que um rato adulto saudável contém aproximadamente 10 8 macrófagos que são distribuídos ao longo do corpo em vários órgãos e tecidos (Tabela 1) 1,2. Os macrófagos exibem grande diversidade fenotípica e funcional por causa de sua capacidade de se adaptar ao seu microambiente 3,4. O mais importante macrophage propriedade é a sua actividade microbicida, a qual é definida pela sua capacidade de fagocitose de micróbios e as destroem. A resposta fagocítica está definido pela activação de redes de sinalização complexas que são estimulados por contacto microbiana, assim, para modular a expressão de genes de macrófagos de forma apropriada em resposta a diversos estímulos. Após a fagocitose, os micróbios são eliminados em uma estrutura chamada fagolisossomo, no entanto, muitos micróbios patogénicos têm desenvolvido estratégias para subverter a função microbicida dos macrófagos 5. A diversidade de mecanismos de subversão que são utilizadas por diferentes espécies microbianas é uma prova da complexidade do processo de fagocitose 6 e fagolisossomo biogênese. As doenças infecciosas são os principais problemas de saúde humana, e vários mecanismos e moléculas de participar de atividades antimicrobianas de macrófagos. Além disso, os alvos das propriedades microbicidas que são sequestradas por micróbios permanecem desconhecidos, assim, existe uma mensagemxplosion de interesse nos aspectos evolutivos, genéticos e bioquímicos de interação patógeno-hospedeiro, que renovou a atenção científica sobre macrófagos. Atualmente, a maioria das pesquisas no campo é feito em macrófagos linhagens celulares, que diferem de macrófagos primários na atividade fagocitária, a produção de citocinas e da regulação do burst oxidativo. Além disso, eles são menos adequados para microscopia. Investigar a interação macrófagos-patógenos é recomendado o uso de macrófagos primários, tais como medula macrófagos derivados (BMDMs), que apresentam características mais fisiológicas. Além disso, é possível trabalhar em BMDMs geneticamente modificados, porque estes macrófagos pode ser isolado directamente a partir de ratinhos transgénicos e, com a disponibilidade de novas tecnologias, tais como a transfecção lentiviral, o perfil de expressão do gene podem ser alterados por sobre-expressão do gene ou ARN de interferência. Aqui, descrevemos um procedimento para diferenciar murino osso marrow em macrófagos que irão proporcionar um grande número de macrófagos em 7 dias para várias análises funcionais, como a proteômica 7, 8 transcriptômica, tráfico intracelular estuda 9, estudos dinâmicos 10, telas genéticos (RNAi) e triagem de drogas 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito detalha um método para produzir grandes números de BMDMs. BMDM são células primárias e têm a função biológica e as propriedades dos macrófagos diferenciados a partir de monócitos, porque há madura, em contraste com as linhas celulares de macrófagos, que são imaturos. BMDMs podem ser utilizados para o rastreio genético (RNAi), a triagem de drogas, estudos funcionais, estudos de interação patógeno-hospedeiro e muitas outras áreas de investigação.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo CNRS (PICS 2012-2014 a GE) e por uma bolsa da Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 para Giovanna Mottola). Filippo Conti é membro da Cooperação Científica Foundation'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit é um companheiro do Ministério Francês de Pesquisa e Tecnologia. As fontes de financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados, análise de dados, a decisão de publicar ou preparação do manuscrito.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. . Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. . Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
