Bone Marrow-afledt Macrophage Production
Summary
Makrofager har længe været anerkendt som et afgørende element i den medfødte og adaptive immunrespons. Den seneste eksplosion af viden vedrørende evolutionære, genetiske og biokemiske aspekter af samspillet mellem makrofager og mikrober har fornyet videnskabelig opmærksomhed på makrofager. Denne artikel beskriver en fremgangsmåde til at skelne makrofager fra museknoglemarv.
Abstract
Makrofager er kritiske komponenter af det medfødte og adaptive immunrespons, og de er de første linje i forsvaret mod fremmede magter på grund af deres stærke mikrobiocide aktiviteter. Makrofager er bredt fordelt i hele kroppen og er til stede i de lymfoide organer, lever, lunger, mave-tarmkanal, centralnervesystem, knogler og hud. På grund af deres fordeling, de deltager i en lang række fysiologiske og patologiske processer. Makrofager er alsidige celler, der er i stand til at genkende microenvironmental ændringer og opretholde vævshomeostase. Talrige patogener har udviklet mekanismer til at bruge makrofager som trojanske heste for at overleve, replikere i og inficere både mennesker og dyr og til at overføre til hele kroppen. Den seneste eksplosion af interesse i evolutionære, genetiske og biokemiske aspekter af host-patogen interaktioner har fornyet videnskabelig opmærksomhed med hensyn til makrofager. Her beskriver vi enfremgangsmåde til at isolere og dyrke makrofager fra murin knoglemarv, der vil give et stort antal makrofager til at studere vært-patogen interaktioner såvel som andre processer.
Introduction
Et væsentligt aspekt af makrofagfunktion er deres rolle i medfødte og adaptive immunitet. På grund af deres evne til at fagocytere inaktive partikler, bakterier eller parasitter, makrofager er en første linje i forsvaret mod udenlandske angribere. Når internaliseret er mikrober nedbrydes inden for phagolysosomes. Makrofager også sende rekruttering signaler til og præsentere antigener til andre immunceller såsom T-lymfocytter. Makrofager er afledt fra monocytter. Monocytter opstår i knoglemarven fra myeloide stamceller og migrere til perifert blod og væv, hvor de differentierer til makrofager. Det anslås, at en sund voksen mus indeholder ca 10 8 makrofager, der er fordelt over hele kroppen i forskellige organer og væv (tabel 1) 1,2. Makrofager vise stor fænotypisk og funktionel diversitet på grund af deres evne til at tilpasse deres mikromiljø 3,4. Den vigtigste MACROPhage ejendom er deres mikrobicidaktivitet, som er defineret ved deres evne til at fagocytere mikrober og ødelægge dem. Fagocyterende respons er defineret ved aktivering af komplekse signalsystemer netværk, der er stimuleret af mikrobiel kontakt, og dermed makrofager modulere genekspression passende reaktion på forskellige stimuli. Efter fagocytose bliver mikrober elimineret i en struktur kaldet fagolysosomet, men har mange patogene mikrober udviklet strategier til at undergrave mikrobicide funktion af makrofager 5. Mangfoldigheden af undergravende mekanismer, der anvendes af forskellige mikrobielle arter er en hyldest til kompleksiteten af fagocyterende processen 6 og fagolysosomet biogenese. Infektionssygdomme er store sundhedsproblemer, og talrige mekanismer og molekyler deltager i makrofag antimikrobielle aktiviteter. Endvidere målene i mikrobicide egenskaber, der er kapret af mikrober forbliver ukendte, og dermed er der en eXplosion af interesse i de evolutionære, genetiske og biokemiske aspekter af værtspatogene interaktioner, der har fornyet videnskabelig opmærksomhed med hensyn til makrofager. I øjeblikket er størstedelen af forskningen på området gjort på makrofager cellelinjer, som adskiller sig fra primære makrofager i fagocyterende aktivitet, den cytokiner produktion og regulering af den oxidative burst. Desuden er de mindre egnede til mikroskopi. For at undersøge samspillet makrofager-patogener anbefales det at bruge primære makrofager, såsom knoglemarv afledte makrofager (BMDMs), som udviser mere fysiologiske funktioner. Desuden er det muligt at arbejde på genetisk modificerede BMDMs, fordi disse makrofager kan isoleres direkte fra transgene mus og med tilgængeligheden af nye teknologier, såsom lentivirale transfektion deres genekspressionsprofilen kan ændres ved genetisk overekspression eller RNA-interferens. Her beskriver vi en procedure for at differentiere murine knogle mpil til makrofager, der vil give et stort antal makrofager i 7 dage for forskellige funktionelle analyser, f.eks proteomics 7, transcriptomics 8, intracellulær handel studerer 9, dynamiske undersøgelser 10, genetiske skærme (RNAi) og narkotika screening 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den heri beskrevne protokol detaljer en fremgangsmåde til at producere store antal af BMDMs. BMDM er primære celler og har den biologiske funktion og egenskaber af makrofager differentierede fra monocytter, fordi der er modne, i modsætning til makrofag-cellelinier, som er umodne. BMDMs kan anvendes til genetisk screening (RNAi), drug screening, funktionelle undersøgelser, værtspatogene interaktionsstudier og mange andre områder af undersøgelsen.
Proceduren præsenteret heri er meget e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af CNRS (PICS 2012-2014 til EG) og af en bevilling fra Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 til Giovanna Mottola). Filippo Conti er en fyr af det videnskabelige samarbejde Foundation'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit er en fyr fra det franske ministerium for forskning og teknologi. Finansieringskilderne havde nogen rolle i undersøgelsens design, dataindsamling, dataanalyse, beslutning om at offentliggøre, eller manuskriptet forberedelse.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. . Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. . Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
