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Immunology and Infection

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

doi: 10.3791/50966 Published: November 22, 2013

Summary

Makrophagen sind seit langem als eine kritische Komponente der angeborenen und erworbenen Immunantworten erkannt. Die jüngste Explosion des Wissens im Zusammenhang mit evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Interaktion zwischen Makrophagen und Mikroben hat die wissenschaftliche Aufmerksamkeit auf Makrophagen erneuert. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um Makrophagen aus Knochenmark der Maus zu unterscheiden.

Abstract

Makrophagen sind wichtige Komponenten der angeborenen und adaptiven Immunreaktionen, und sie sind die erste Verteidigungslinie gegen fremde Eindringlinge durch ihre starke mikrobizide Aktivitäten. Makrophagen sind im Körper weit verteilt sind und in den lymphatischen Organen vorhanden sind, Leber, Lunge, Magen, Darm, Zentralnervensystem, Knochen und Haut. Aufgrund ihrer Verteilung, nehmen sie an einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Prozessen. Makrophagen sind sehr vielseitige Zellen, die in der Lage, Veränderungen der Mikroumgebung zu erkennen und Gewebe-Homöostase aufrecht zu erhalten. Zahlreiche Krankheitserreger haben Mechanismen entwickelt, um Makrophagen als Trojanische Pferde, um zu überleben, replizieren und infizieren Menschen und Tiere und über den gesamten Körper ausbreiten. Die jüngste Explosion des Interesses an evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktionen hat die wissenschaftliche Aufmerksamkeit in Bezug auf Makrophagen erneuert. Hier beschreiben wir eineVerfahren, um aus murinen Knochenmark, die eine große Anzahl von Makrophagen für die Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen wie auch andere Prozesse zur Verfügung stellt isolieren und kultivieren Makrophagen.

Introduction

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Ein wesentlicher Aspekt der Makrophagenfunktion ist ihre Rolle bei der angeborenen und erworbenen Immunität. Aufgrund ihrer Fähigkeit, inerte Partikel, Bakterien oder Parasiten phagozytieren, Makrophagen eine erste Linie der Verteidigung gegen fremde Eindringlinge. Einmal verinnerlicht, werden Mikroben innerhalb Phagolysosomen abgebaut. Makrophagen Signale für Rekrutierung und Antigene senden auch auf andere Immunzellen wie T-Lymphozyten. Makrophagen aus Monozyten abgeleitet. Monozyten im Knochenmark von myeloischen Stammzellen entstehen und wandern in peripherem Blut und verschiedenen Geweben, wo sie sich zu Makrophagen differenzieren. Es wird geschätzt, dass eine gesunde erwachsene Maus ungefähr 10 8 Makrophagen, die durch den Körper in verschiedenen Organen und Geweben (Tabelle 1) 1,2 verteilt sind. Makrophagen zeigen große phänotypische und funktionelle Vielfalt wegen ihrer Fähigkeit, ihre Mikroumgebung 3,4 anzupassen. Die wichtigste macrophage Eigenschaft ist ihre mikrobizide Aktivität, die durch ihre Fähigkeit definiert ist, Mikroben phagozytieren und zerstören sie. Die phagozytische Reaktion wird durch die Aktivierung von komplexen Signalnetzwerke, die durch mikrobielle Kontakt stimuliert definiert; somit Makrophagen modulieren Genexpression geeignet in Reaktion auf diverse Stimuli. Nach Phagozytose, sind Mikroben in einer Struktur namens Phagolysosom eliminiert, jedoch haben viele pathogene Mikroben Strategien entwickelt, um die Funktion von Makrophagen mikrobizide 5 zu untergraben. Die Vielfalt der Subversion Mechanismen, die von verschiedenen Mikrobenarten genutzt werden, ist ein Beleg für die Komplexität des Prozesses phagocytic 6 und Phagolysosom Biogenese. Infektionskrankheiten sind große Gesundheitsprobleme und zahlreiche Mechanismen und Moleküle teilnehmen Makrophagen antimikrobielle Aktivitäten. Weiterhin können die Ziele der mikrobiziden Eigenschaften, die durch Mikroben fallen sind unbekannt bleiben, und so gibt es eine Explosion von Interesse in der evolutionären, genetischen und biochemischen Aspekte der Wirt-Pathogen-Interaktionen, die wissenschaftliche Aufmerksamkeit in Bezug auf Makrophagen erneuert hat. Gegenwärtig wird der Großteil der Forschung auf dem Gebiet von Makrophagen-Zellinien, die aus primären Makrophagen in der phagozytischen Aktivität der Cytokine Produktion und die Regulierung des oxidativen Burst unterscheiden geführt. Außerdem sind sie für die Mikroskopie weniger geeignet. Um die Interaktion Makrophagen-Erreger zu untersuchen, wird empfohlen, primären Makrophagen, wie Knochenmarkmakrophagen (BMDMs), die mehrere physiologische Funktionen aufweisen verwenden. Darüber hinaus ist es möglich, über gentechnisch veränderte BMDMs arbeiten, weil diese Makrophagen könnte direkt aus transgenen Mäusen isoliert und mit der Verfügbarkeit von neuen Technologien wie lentivirale Transfektion ihrer Genexpressionsprofil durch Gen-Überexpression oder RNA-Interferenz geändert werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Maus-Knochen m unterscheidenPfeil in Makrophagen, die eine große Anzahl von Makrophagen in 7 Tagen für verschiedene Funktions bieten wird analysiert, wie die Proteomik 7, 8 Transkriptomik, studiert intrazellulären Transport 9, 10 dynamische Studien, genetische Screens (RNAi) und Drogen 11.

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Protocol

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Ethikerklärung

Das Protokoll für die Behandlung der Tiere wurde von unseren institutionellen Tierethikkommission "Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Experimentelle medizinisch-Chirurgical" genehmigt (CFREMC, Projektgenehmigung 10-300122013 Eric Ghigo) von Aix-Marseille-Universität in Übereinstimmung mit den Regeln von Dekret Nr. 87-848 von 1987.10.19. Die Experimente wurden an der Faculté de Médecine de la Timone (Experimentieren Zulassungsnummer 13.385 an Eric Ghigo) durchgeführt.

1. Material und Kultur Medien Vorbereitung

  1. Sterilisieren zwei Pinzetten, zwei Scheren, zwei chirurgische Messer, Mörser und ein Stößel.
  2. Erhalten komplettem DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), 2 mM Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin.
  3. Verdünnen 10x PBS in sterilen destillierten Wasser 1x PBS erhalten.
  4. Erhalten eiskaltem 1x PBS, eiskalte kompletten DMEM, komplett DMEM waauf 37 ° C RMED

2. Vorbereitung der L929-Zellüberständen

  1. Wachsen L929-Zellen in vollständigem DMEM bei 37 ° C zur Konfluenz (zwanzig 175 cm 2-Kolben), 5% CO 2.

Hinweis: Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF) ist erforderlich, um hämatopoetische Zelldifferenzierung in Makrophagen 12 induzieren. L929-Zellen produzieren GM-CSF.

  1. Bei Konfluenz ersetzen Kulturmedien mit frischen komplette DMEM. Übertragen Kolben auf 32 ° C, 5% CO 2 für 10 Tage.
  2. Sammeln, Pool und Zentrifugieren der Überstände bei 750 g für 10 min. Entsorgen Zellpellets.
  3. Shopüberstände in 15-ml-Röhrchen und bei -20 ° C

3. Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen (BMDM) Herstellung

  1. Sacrifice 1 Maus durch Genickbruch.
    1. Sterile chirurgische Messer während des Experiments. Desinfizieren Sie die Haut mit 70% Alkoholhol. Einen Einschnitt an der Spitze jedes Hinterbein und ziehen Sie die Haut nach unten in Richtung des Fußes, um den Muskel aus.
    2. Schneiden Sie die Hinterbeine, entfernen Sie die Haut mit einer sterilen Schere und sterile Pinzette. Legen Sie die Beine in einer sterilen Petrischale (35/10 mm), die sterile, eiskalte 1x PBS (5 ml).
    3. Entfernen Sie das Fleisch und Muskeln, die bis auf die Knochen mit einer sterilen Schere und Pinzette anhaften.
  2. Übertragen Sie die Knochen in eine neue, sterile Petrischale (35/10 mm) mit eiskaltem, sterilem 1x PBS (5 ml). Zwei Mal mit 5 ml eiskaltem, sterilen 1x PBS Waschen Sie die Knochen.
  3. Übertragen Sie die Knochen in einem sterilen Mörser mit 5 ml eiskaltem, sterilen 1x PBS.
  4. Schneiden Sie die Tibia vom Femur am Gelenk mit einer sterilen Schere. Smash die Knochen sanft in einem sterilen Mörser mit 5 ml eiskaltem, sterilen 1x PBS mit einem Stößel.
  5. Sammeln Sie den Überstand in eiskaltem 15 ml Tuben. Wiederholen Sie diesen Schritt 3x.
  6. Filtriert durch ein 70 um Nylon Zelle strainer, feste Fragmente zu entfernen. Zentrifugieren des Filtrats bei 450 × g für 10 min bei 4 ° C.
  7. Den Überstand vorsichtig verwerfen. Distanzieren das Pellet in 10 ml Lyse der roten Blutkörperchen Puffer für 30 Sekunden. 20 ml eiskaltem, komplett DMEM.

Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist die Entfernung kontaminierender Erythrozyten, so muss dieser Schritt innerhalb von 2 min durchgeführt werden, um hämatopoetische Zellen Veränderung der roten Blutkörperchen Lysepuffer vermeiden.

  1. Zentrifuge bei 450 × g für 10 min bei 4 ° C. Den Überstand vorsichtig verwerfen. Dissoziation des Pellets in 20 ml vollständigem DMEM, das auf 37 ° C erwärmt worden ist,
  2. Übertragen Sie die dissoziierten Zellen in zwei Petrischalen (100/20 mm). Inkubieren für 4 h bei 37 ° C.
  3. Sammeln der Überstände in 50-ml-Röhrchen bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie die Gerichte, die die Makrophagen enthalten.

Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist es, den Bewohner Knochen marro beseitigenw Makrophagen durch ihre Fähigkeit, an kulturbehandelten Kunststoff haften. Diese Makrophagen in anderen Experimenten verwendet werden.

  1. Zentrifugieren der gesammelten Überstände bei 450 × g für 10 min bei 4 ° C Überstand verwerfen.
  2. Distanzieren sanft das Pellet in 10 ml komplettem DMEM mit 15% L929-Zellüberstand. Filtern Sie die Zellen durch eine 40 um Nylon Zellsieb.
  3. Recover das Filtrat. Füge das gesammelte Filtrat (10 ml) auf 140 ml vollständigem DMEM, das mit 15% L929-Zellmedium ergänzt wurde.
  4. Verteilen von 10 ml der Zellsuspension pro Petrischale (15 Petrischalen, 20/100 mm). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO 2.
  5. Wachsen Zellen für 3 Tage
  6. 10 ml komplettem DMEM, das mit 15% L929 ergänzt wurde. Inkubieren Zellen für 4 weitere Tage.

Hinweis: Überwachung Zellwachstum regelmäßig mit einem inversen Mikroskop (Schritte 3,14-3,16). Adhärenten Makrophagen werdennach 3 Tagen Kultur beobachtet.

4. Ernten BMDMs

  1. Entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie BMDMs 2 mal mit komplettem DMEM
  2. 5 ml vollständigem DMEM, das auf 37 ° C erwärmt wurde, Nehmen BMDMs durch leichtes Kratzen mit einem Gummiwischer.
  3. Sammeln BMDMs in 50 ml Zentrifugenröhrchen und bei 450 g für 10 min. Vorsichtig distanzieren Zellpellets in 20 ml komplettem DMEM.
  4. Zählen BMDMs in Gegenwart von Trypanblau (nicht mehr als 10% Mortalität zu beachten).

Hinweis: In der Regel werden etwa 6-7,5 x 10 7 Makrophagen von 15 Petrischalen (100/20 mm) von Makrophagen erhalten. Es gibt ungefähr 4-5 x 10 6 Macrophagen / Petrischale (100/20 mm).

  1. Vorbereitung BMDMs wie für das Experiment erforderlich ist. Nach 16 Stunden in Vollmedium bei 37 ° C, 5% CO 2, Makrophagen wieder auf dem Träger haften.

5. Speichern BMDMs

  1. Sammeln isoliert BMDMs (Schritt 4.3). Zentrifuge bei 450 × g für 10 min. Hinweis: BMDMs kann in flüssigem Stickstoff eingefroren werden.
  2. Resuspendieren Zellpellets in Gefriermedium, bestehend aus 10% DMSO und 90% FCS auf eine Endkonzentration von 4 x 10 6 Zellen / ml und 1 ml-Pipette in jede Ampulle.
  3. Einfrieren der Zellen bei einer Kühlrate von 1 ° C / min. Nach 24 Stunden übertragen die Ampulle zu einem Flüssigstickstoffbehälter für Langzeitlagerung.

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Representative Results

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Das Ziel dieser Methode war, einfach in wenigen Tagen erhalten, eine große Anzahl von Makrophagen. Die Knochenmarkzellpräparation ist in Fig. 1 dargestellt. Bones aus dem Hinterbein wurden gesammelt und in einem Mörser zerschlagen. Wenn die Makrophagen wurden aus dem Knochenmarkszellpräparat entfernt wurden Knochenmarkzellen mit GM-CSF (Tag 0) inkubiert. Nach 3 Tagen sind die Zellen, die vor rund und nicht-adhärenten Kultur waren, beginnen, in Makrophagen zu differenzieren und zu halten (Abbildung 1A). Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung F4/80 und HLA-DR-Marker gezeigt, dass Zellen sowohl Marker was beweist, daß sie in Makrophagen (1B) unterschieden. Nach 7 Tagen wurde eine Monoschicht mit BMDM 6-7,5 x 10 7 BMDM / Maus erhalten. Makrophagen können in verschiedenen Arten von Experimenten (Fig. 2) verwendet werden. Die funktionellen Aktivitäten des BMDMs kann auf verschiedene Weise bestimmt werden. Zum Beispiel BMDM phagocytoswird, wurde von Latexkügelchen Internalisierung überwacht. Die Anzahl der Kügelchen pro Zelle im Laufe der Zeit erhöht (2A). BMDM endocytic Potential (Fig. 2B), wurden Bakterien-Pathogen-Wechselwirkungen (Fig. 2C) und Signalwege (Fig. 2D) beurteilt.

Lage Zelltypen
Knochen Osteoklasten
Knochenmark Pro-Monozyten, Makrophagen
Zentrales Nervensystem Mikrogliazelle
Lamina propria Einwohner Makrophagen
Leber Kupffer-Zellen
Lunge Alveolarmakrophagen
Periphere Blut Monozyten
Bauchhöhle Peritoneal-Makrophagen-
Haut Langerhans-Zellen
Milz Einwohner Makrophagen
Thymusdrüse Einwohner Makrophagen

Tabelle 1. Macrophage Quellen in Gewebe und Körperflüssigkeiten.

Figur 1
Fig. 1 ist. Schematische Darstellung der BMDM Produktion. (A) Die Abbildung zeigt die Schritte BMDM Differenzierung aus Vorläufer Differenzierung (Tag 0) auf Makrophagen (day7) reifen. (B) FACS-Analyse zeigt die Reinheit der isolierten Zellen am Tag 7 mit Makrophagen Marker HLA-DR und F4/80. Klicken Sie hier zur Ansicht großr Figur.

Figur 2
2. Beispiele von Experimenten, die mit BMDMs möglich. (A) Phagozytosetest. BMDMs wurden für verschiedene Zeiträume mit Latex-Kügelchen inkubiert und Wulst-Aufnahme wurde durch Mikroskopie beobachtet. (B) Intrazelluläre Coxiella burnetii Lipopolysaccharide (LPS) Lokalisation in BMDMs. LPS (in rot) wurde zu einem Raum, der lysosomalen Membran-assoziierten birgt protein-1 (LAMP-1) (in blau) lokalisiert, aber nicht Cathepsin D (in grün). Dieses Experiment zeigt, dass LPS in späten Endosomen, die nicht mit Lysosomen verschmelzen sind vorhanden ist. (C) BMDMs mit Tropheryma whipplei (in rot) infiziert war nicht in der Kammer, die Cathepsin D birgt lokalisiert (in grün). (D) Vertreter immunobViele zeigen insgesamt (t) und phosphoryliert (p) p38 MAP-Kinase-Aktivität in Escherichia coli LPS-stimulierte BMDMs (1 ug / ml). Maßstabsbalken repräsentieren 5 um.

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Discussion

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Das hierin beschriebene Protokoll Informationen ein Verfahren, eine große Anzahl von BMDMs erzeugen. BMDM Primärzellen und die biologische Funktion und die Eigenschaften von Makrophagen aus Monozyten differenziert da reifen, im Gegensatz zu Makrophagen-Zelllinien, die unreif sind. BMDMs kann genetisches Screening (RNAi), Drogen-Screening, funktionelle Studien, Wirt-Pathogen-Interaktionsstudien und viele andere Bereiche der Untersuchung verwendet werden.

Die hierin präsentierten Verfahren ist sehr einfach und erfordert keine spezielle Ausrüstung erforderlich, daher kann es leicht in einem Labor oder Klassenzimmer durchgeführt werden. Diese Methode erfordert etwas Übung und Fingerfertigkeit. Es ist auch möglich, die BMDMs in flüssigem Stickstoff zu speichern, damit zukünftige Experimente zu erleichtern.

Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche Kultur BMDM: 1) die Aufrechterhaltung einer sterilen, gesunde Kultur, 2) Knochenmark-Entnahme muss effizient sein, 3) L929 supernatant Qualität kritisch ist, 4) die Zellen nicht auf die Lyse der roten Blutkörperchen Puffer für mehr als 2 min ausgesetzt werden hämatopoetischen Zellschäden zu vermeiden.

Es ist möglich, eine Änderung des Protokolls zu tun, aber es gibt in Grenzzahl. 1) DMEM durch RPMI 1640 ersetzt werden, aber BMDM Herstellung ist weniger effizient, 2) Handels M-CSF (500-1000 UI / ml) anstelle von L929-Überstand verwendet werden, aber es ist teuer und M-CSF zu sein, Mehr alle 2 Tage, um Zellen während der Differenzierung, 3) alternativ Knochenmark aus dem Knochen mit einer Spritze mit Nadel 25 G statt Zerschlagung der Knochen in einem sterilen Mörser mit einem Stößel ausgerüstet extrudiert werden.

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Disclosures

Es sind keine Interessenkonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom CNRS (PICS 2012-2014 auf EG) und durch einen Zuschuss aus der Region Kampanien (LR n.5, 28.03.2002 um Giovanna Mottola) unterstützt. Filippo Conti ist Mitglied des Wissenschaftlichen Zusammenarbeit Foundation'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit ist ein Fellow der Französisch Ministerium für Forschung und Technologie. Die Finanzierungsquellen hatten keine Rolle in dem Studiendesign, Datenerhebung, Datenanalyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Manuskripterstellung.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco Life Technologies 21969-035
Fetal Calf Serum Gibco Life Technologies 10270
Penicillin/Streptomycin Gibco Life Technologies 15070
Glutamine Gibco Life Technologies 25030-024
PBS (10x) Lonza BEM515F
Red Blood Cell Lysis buffer Sigma R7757
Cell strainer 70 μm Nylon BD Falcon 352350
Cell strainer 40 μm Nylon BD Falcon 352340
50 ml tubes any supplier n/a
15 ml tubes any supplier n/a
Petri dishes (100/20 mm) any supplier n/a culture treated
Petri dishes (35/10 mm) any supplier n/a

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References

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Cite this Article

Trouplin, V., Boucherit, N., Gorvel, L., Conti, F., Mottola, G., Ghigo, E. Bone Marrow-derived Macrophage Production. J. Vis. Exp. (81), e50966, doi:10.3791/50966 (2013).More

Trouplin, V., Boucherit, N., Gorvel, L., Conti, F., Mottola, G., Ghigo, E. Bone Marrow-derived Macrophage Production. J. Vis. Exp. (81), e50966, doi:10.3791/50966 (2013).

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