Summary
यहाँ हम microsecond और मिलीसेकंड गतिशीलता और एक neuronal कैल्शियम सेंसर, डाउनस्ट्रीम नियामक तत्व विरोधी न्यूनाधिक करने के लिए कैल्शियम एसोसिएशन के साथ जुड़े संरचनात्मक परिवर्तन की ऊर्जा की निगरानी के लिए एक बंदी कैल्शियम परिसर, डीएम nitrophen, के साथ संयोजन में photothermal किरण विक्षेपन तकनीक का एक आवेदन पत्र की रिपोर्ट .
Abstract
एक साथ तस्वीर ध्वनिक उष्मामिति और थर्मल झंझरी के साथ Photothermal किरण विक्षेपन पारंपरिक स्टॉप का उपयोग नहीं पहुँचा रहे हैं कि समय तराजू millisecond के लिए microsecond पर प्रोटीन में गठनात्मक परिवर्तन प्रेरित प्रकाश के समय प्रोफाइल मात्रा और तापीय धारिता परिवर्तन की निगरानी कि photothermal तरीकों के परिवार का है प्रवाह के साधन. मात्रा और / या तापीय धारिता में समग्र परिवर्तन की जांच कर रहे हैं इसके अलावा, इन तकनीकों का एक fluorophore और या एक क्रोमोफोर लेबल की कमी है कि प्रोटीन और अन्य Biomacromolecules के लिए लागू किया जा सकता है. 2 सीए के साथ जुड़े संरचनात्मक परिवर्तन की गतिशीलता और ऊर्जा की निगरानी करने के लिए + कैल्शियम transducers, ऐसे neuronal कैल्शियम सेंसर, एक बंदी कैल्शियम परिसर, डीएम nitrophen, फोटो ट्रिगर करने के लिए स्वतंत्र कैल्शियम में एक तेजी से (τ <20 μsec) वृद्धि कार्यरत है के लिए बाध्य एकाग्रता और संबद्ध मात्रा और तापीय धारिता परिवर्तन photothermal किरण विक्षेपन तकनीक का उपयोग कर जांच की जा रही.
Introduction
ऐसे photoacoustic उष्मामिति, photothermal किरण विक्षेपन (पीडीबी), और nanosecond लेजर उत्तेजना के साथ मिलकर क्षणिक झंझरी के रूप में फोटो थर्मल तरीकों अल्पकालिक मध्यवर्ती 1,2 का समय हल पढ़ाई के लिए ऑप्टिकल spectroscopies क्षणिक के लिए एक शक्तिशाली विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं. ऐसे क्षणिक अवशोषण और आईआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के रूप में ऑप्टिकल तकनीक, के विपरीत, कि आसपास के क्रोमोफोर में अवशोषण परिवर्तन के लिए समय रुपरेखा की निगरानी; photothermal तकनीक ऑप्टिकली के समय प्रोफाइल की जांच के लिए कीमती उपकरण गर्मी / मात्रा में परिवर्तन के समय निर्भरता का पता लगाने और इसलिए कर रहे हैं "चुप" प्रक्रियाओं. अब तक, photoacoustic उष्मामिति और क्षणिक झंझरी सफलतापूर्वक globins 3,4, ऑक्सीजन सेंसर प्रोटीन के साथ ligand बातचीत में द्विपरमाणुक ligand माइग्रेशन सहित फोटो प्रेरित प्रक्रियाओं के गठनात्मक गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है FixL 5, 6 oxidases इलेक्ट्रॉन और हीम तांबे में प्रोटॉन परिवहन एकएन डी प्रकाशतंत्र द्वितीय के साथ ही rhodopsin 7 और cryptochrome 8 में गठनात्मक गतिशीलता में फोटो isomerization.
एक आंतरिक क्रोमोफोर और / या फ्लोरोफोरे कमी कर रहे हैं कि जैविक प्रणालियों को photothermal तकनीक के इस्तेमाल का विस्तार, प्रवासी भारतीय दिवस तकनीक के आधार पर, फोटो ट्रिगर करने के लिए बंदी परिसर के उपयोग कुछ microseconds के भीतर ligand / सब्सट्रेट एकाग्रता में वृद्धि के साथ या तेजी से जोड़ दिया गया था बंदी परिसर पर. इस दृष्टिकोण की अनुमति देता है ligand / सब्सट्रेट एक आंतरिक fluorophore या क्रोमोफोर कमी कर रहे हैं कि प्रोटीन के लिए और वाणिज्यिक ठहराव प्रवाह उपकरणों से सुलभ नहीं हैं कि समय पैमाने पर बाध्यकारी के साथ जुड़े संरचनात्मक परिवर्तन की गतिशीलता और ऊर्जा की निगरानी. यहाँ पिंजरे परिसर, सीए की ऊष्मा 2 + डीएम nitrophen, फोटो दरार के साथ ही neuronal कैल्शियम सेंसर की सी टर्मिनल डोमेन के लिए सीए 2 + सहयोग के लिए कैनेटीक्स नीचे नजर रखने के लिए प्रवासी भारतीय दिवस के लिए एक आवेदन पत्रधारा नियामक तत्व विरोधी न्यूनाधिक (सपना) प्रस्तुत किया है. सीए 2 + 10 μsec भीतर तस्वीर जारी की सीए से 2 + डीएम nitrophen है और ~ 300 μsec की एक समय लगातार साथ एक unphotolysed पिंजरे में rebinds. दूसरी ओर, apoDREAM की उपस्थिति में मिलीसेकंड समय पैमाने पर होने वाली एक अतिरिक्त गतिज मनाया और प्रोटीन के लिए बाध्य ligand को दर्शाता है. जैविक प्रणालियों में गठनात्मक संक्रमण की जांच के लिए प्रवासी भारतीय दिवस का आवेदन किसी भी तरह वाद्य कठिनाइयों के कारण सीमित किया गया है, एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रवासी भारतीय दिवस संकेत प्राप्त करने के लिए जांच और पंप बीम की जैसे दुरूह संरेखण. हालांकि, एक उपकरण सेट अप की एक जटिल डिजाइन, तापमान का एक सटीक नियंत्रण, और जांच और पंप बीम का एक सावधान संरेखण एक व्यापक पर समय हल मात्रा और तापीय धारिता परिवर्तन की निगरानी की अनुमति देता है कि एक सुसंगत और मजबूत पीबीडी संकेत प्रदान 10 μsec लगभग 200 मिसे करने से समय पैमाने. इसके अलावा, modific मेंआदि समान तापमान, बफर रचना, ऑप्टिकल सेल अभिविन्यास, लेजर बिजली, के तहत नमूना और संदर्भ के निशान का पता लगाने के आश्वस्त करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया के ations काफी मापा प्रतिक्रिया मात्रा और enthalpies में प्रयोगात्मक त्रुटि कम कर देता है.
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Protocol
1. नमूना तैयारी
- नमूना तैयार करने और एक अवांछित uncaging को रोकने के लिए एक अंधेरे कमरे में सभी नमूना जोड़तोड़ बाहर ले.
- 50 मिमी HEPES में एन, एन, एन ',' एन-tetrakis [(ऑक्सी कार्बोनिल) मिथाइल] -1,2-ethanediamine) - (2 नाइट्रो-4, 5 dimethoxyphenyl) - डीएम nitrophen ((1 solubilize बफर, 100 मिमी KCl, 400 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए पीएच 7.0 (ε 350nm = 4330 एम -1 -1 सेमी 9).
- [डीएम nitrophen] [2 Ca +] के एक वांछनीय अनुपात को प्राप्त करने के लिए 0.1 एम शेयर समाधान से 2 CaCl जोड़ें. 10 माइक्रोन से बड़ा सीए 2 + सहयोग के लिए कश्मीर डी के साथ प्रोटीन के लिए, [2 Ca +] का अनुपात 1:1 [डीएम nitrophen] Uncaged डीएम nitrophen के लिए तस्वीर जारी की सीए 2 + के बंधन को रोकने के लिए बेहतर है . दरअसल, एक कैल्शियम की 90% प्रोटीन बंधन ~, 10 एनएम और 400 मिमी होना करने के लिए डीएम nitrophen और सीए 2 + की कुल एकाग्रता होने के लिए डीएम nitrophen के लिए कश्मीर घ मूल्य पर विचारकश्मीर डी के साथ = 10 माइक्रोन apoform में किया जाएगा. दूसरी ओर, कश्मीर डी <10 माइक्रोन के साथ प्रोटीन के लिए बाध्य सीए 2 + के अध्ययन के लिए, यह [2 Ca +] में कमी करने के लिए बेहतर है: के साथ सीए 2 + complexation को रोकने के लिए 0.95 के लिए [डीएम nitrophen] अनुपात एपीओ- प्रोटीन पिंजरे फोटो हदबंदी से पहले.
- संदर्भ परिसर, कश्मीर 3 solubilize [फे (तृतीय) (सीएन) 6] या नमूना के लिए के रूप में ही बफर में ना 2 सीआरओ 4,.
2. प्रयोग सेट करना
- बुनियादी प्रयोगात्मक विन्यास चित्रा 2 में दिखाया गया है.
- 1 मिमी जांच किरण के व्यास (वह-NE लेजर की 632 एनएम उत्पादन, ~ 5 मेगावाट लेजर शक्ति) को समायोजित करने और एक के तापमान में रखा एक सेल के केंद्र के माध्यम से जांच बीम का प्रचार करने के लिए एक पिन होल (पी 2) का प्रयोग करें एक एम 1 दर्पण का उपयोग सेल धारक नियंत्रित.
- जांच किरण केंद्र को नमूना के पीछे एक दर्पण (एम 2) का प्रयोग करेंस्थिति संवेदनशील डिटेक्टर का एक केंद्र पर.
- शीर्ष दो डायोड और नीचे दो डायोड के साथ ही डिटेक्टर के बाएँ और दाएँ पक्ष पर दो डायोड के बीच वोल्टेज में अंतर के बीच वोल्टेज में अंतर यह है कि इस तरह डिटेक्टर के केंद्र पर जांच बीम ध्यान शून्य.
- YAG लेजर, FWHM 5 NSEC) दो 355 एनएम लेजर दर्पण के बीच में रखा एक 3 मिमी पिनहोल (पी 1) का उपयोग कर: इसके बाद पंप बीम की एक व्यास, क्यू स्विच एन डी के एक 355 एनएम उत्पादन आकार.
- चित्रा 2 में प्रदर्शन के रूप क्युवेट के केंद्र के माध्यम से पंप किरण Copropagate. यह दोनों लेजर बीम एक औसत दर्जे का विक्षेपन कोण और प्रवासी भारतीय दिवस संकेत के इस प्रकार उच्च आयाम प्राप्त करने के लिए लगभग colinear ढंग से ऑप्टिकल सेल के केंद्र के माध्यम से प्रचार कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है. प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, जांच और पंप मुस्कराते हुए चौराहे के कोण कम से कम 15 डिग्री है.
- जांच और पंप के लिए पंक्ति में एक संदर्भ यौगिक प्रयोग करेंअब समय तराजू (~ 100 मिसे) पर एक अच्छा एस / एन अनुपात और स्थिर प्रवासी भारतीय दिवस आयाम यानी, एक संतोषजनक पीबीडी संकेत प्राप्त करने के लिए बीम.
- 355 एनएम लेजर दर्पण की एक वृद्धिशील समायोजन द्वारा जांच किरण के संबंध में पंप बीम की स्थिति को समायोजित करें.
- स्थिति संवेदनशील डिटेक्टर पर दो ऊपर और नीचे photodiodes के बीच में एक अंतर के रूप में प्रवासी भारतीय दिवस संदर्भ संकेत के आयाम को मापने. प्रवासी भारतीय दिवस संकेत एक तेजी से समय के पैमाने (<10 μsec) पर आयाम में एक तेजी से वृद्धि का प्रदर्शन और चित्रा 3 में प्रदर्शन के रूप में 100 मिसे timescale पर स्थिर रहना चाहिए. पीडीबी आयाम की गोली मार दी परिवर्तनशीलता के लिए शॉट संकेत आयाम के 5% के भीतर है और संकेत reproducibility मुख्य रूप से कंपन से प्रभावित है.
- अवशोषित उत्तेजना लेजर शक्ति पर और आइंस्टीन की संख्या पर पीबीडी संकेत के रैखिक निर्भरता, ई एक को मापने के द्वारा जारी गर्मी ऊर्जा के संबंध में प्रवासी भारतीय दिवस संकेत आयाम में linearity की जाँच करें= एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य संदर्भ absorbance से मेल खाती है, जहां (1-10-ए),.
- लेजर नीचे शक्ति लगभग 1,000 μJ multiphoton और अवशोषण और क्रमशः पंप किरण बिजली की कमी को रोकने के लिए उत्तेजना तरंग दैर्ध्य कम से कम 0.5 पर नमूना / संदर्भ परिसर के absorbance रखें, और प्रवासी भारतीय दिवस संकेत के linearity देती है.
3. प्रवासी भारतीय दिवस माप
- संदर्भ के लिए प्रवासी भारतीय दिवस निशान की माप के साथ शुरू करो. एक एक्स 1.0 सेमी 1.0 सेमी या 1.0 सेमी x 0.5 सेमी क्वार्ट्ज सेल में संदर्भ परिसर के समाधान प्लेस और तापमान नियंत्रित धारक में सेल की स्थिति. दोनों पथ लंबाई तुलनीय पीबीडी आयाम प्रदान करते हैं.
- 3 डिग्री सेल्सियस के तापमान वेतन वृद्धि के साथ 16-35 डिग्री सेल्सियस से तापमान रेंज में तापमान के एक समारोह के रूप में संदर्भ पीबीडी संकेत का पता लगाने
- प्रत्येक तापमान परिवर्तन करने पर, स्थिति संवेदनशील डिटेक्टर पर जांच किरण की स्थिति की जाँच करें और फिर सेयदि आवश्यक हो तो डिटेक्टर के केंद्र के लिए स्थिति को समायोजित.
- 2 समीकरण के अनुसार के रूप में एक समारोह [(DN / डीटी) / सी पी ρ] अवधि प्रवासी भारतीय दिवस संकेत के linearity की जाँच करें.
- संदर्भ माप के लिए के रूप में ऑप्टिकल सेल का एक ही उन्मुखीकरण रखने संदर्भ परिसर के लिए के रूप में एक ही ऑप्टिकल सेल में नमूना समाधान रखें.
- संदर्भ के लिए के रूप में ही तापमान रेंज में नमूना प्रवासी भारतीय दिवस निशान का पता लगाने और [(DN / डीटी) / सी पी ρ] अवधि के लिए सम्मान के साथ नमूना पीबीडी आयाम के linearity की जाँच करें.
4. डेटा विश्लेषण
नीचे को झुकाव का परिमाण की वजह से 1 समीकरण के अनुसार नमूना हीटिंग (ΔV वें) और nonthermal मात्रा परिवर्तन (ΔV nonth) के लिए मात्रा बदलने के लिए सीधे आनुपातिक है: 
नमूना (ए एस के आयाम) और संदर्भ (ए आर) प्रवासी भारतीय दिवस संकेत क्रमश समीकरण 2 और 3, का उपयोग वर्णित किया जा सकता है. 
प्रवासी भारतीय दिवस संकेत साधन प्रतिक्रिया पैरामीटर (कश्मीर) के लिए आनुपातिक है और आइंस्टीन की संख्या अवशोषित (ई एक). 2 समीकरण में पहले कार्यकाल (DN / डीटी) (1/ρC पी) क्यू, कारण विलायक के लिए जारी गर्मी के संकेत परिवर्तन से मेल खाती है. डी.एन. / डीटी अवधि अपवर्तन के सूचकांक में तापमान पर निर्भर परिवर्तन का प्रतिनिधित्व करता है, ρ विलायक का घनत्व है, सी पी गर्मी क्षमता है. सभी मापदंडों आसुत जल के लिए जाना जाता है और आसुत जल में और एक उपयुक्त बफर में संदर्भ परिसर के लिए एक प्रवासी भारतीय दिवस संकेत तुलना द्वारा एक बफर समाधान के लिए निर्धारित किया जा सकता है. क्यू गर्मी returne की राशि हैविलायक डी. ρ (DN / डी ρ) अवधि 10-40 डिग्री सेल्सियस 10 से तापमान रेंज में तापमान स्वतंत्र है कि एक इकाई से कम स्थिर है. Δn ABS अवधि के कारण समाधान में अवशोषित प्रजातियों की उपस्थिति के अपवर्तन के सूचकांक में परिवर्तन से मेल खाती है और जांच किरण की तरंग दैर्ध्य समाधान में किसी भी प्रजाति के अवशोषण स्पेक्ट्रा के सापेक्ष स्थानांतरित कर दिया गया है तो यह नगण्य है. संदर्भ यौगिक (ए आर) से उत्पन्न होने वाले संकेत ई घंटे ν, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर फोटान ऊर्जा है जहां 3 समीकरण द्वारा व्यक्त की है ई घंटे ν = 80.5 किलो कैलोरी / मोल 355 एनएम उत्तेजना के लिए.
- चित्रा 3 में प्रदर्शन के रूप pretrigger और बाद ट्रिगर पीबीडी संकेत के बीच अंतर के रूप में संदर्भ पीबीडी संकेत के आयाम ले लो. इसी तरह रास्ते में, तेजी से (एक तेजी से) के आयाम निर्धारित करने और धीमी चरण (ए एस धीमी) नमूना पीबीडी संकेत की.
- , साधन प्रतिक्रिया पैरामीटर, कश्मीर को खत्म संदर्भ के लिए प्रवासी भारतीय दिवस संकेत के आयाम से नमूना पीबीडी संकेत के आयाम पैमाने पर करने की. संदर्भ संकेत के लिए नमूना संकेत के अनुपात समीकरण 4 देता है और के रूप में लिखा जा सकता है:
- इस समीकरण का प्रयोग, समाधान (क्यू) और nonthermal मात्रा परिवर्तन [के एक भूखंड के क्रमश ढलान और अवरोधन, से एक तस्वीर की पहल की प्रतिक्रिया के साथ जुड़े (ΔV nonth) (ए एस / ए आर) ई के लिए जारी गर्मी का निर्धारण ज ν] तापमान निर्भर अवधि [(DN / डीटी) (1/ρCp)] बनाम अवधि.
- , प्रतिक्रिया मात्रा और तेज और धीमी प्रक्रिया के लिए तापीय धारिता परिवर्तन निर्धारित समीकरण 5-7 के अनुसार उचित मात्रा उपज को मनाया मात्रा और तापीय धारिता परिवर्तन पैमाने पर करने की.
कैनेटीक्स 10 μsec ~ 200 मिसे के बीच समय पैमाने पर होने वाली के साथ एक multistep प्रक्रिया के लिए, मात्रा और प्रतिक्रिया के अलग अलग चरणों के साथ जुड़े तापीय धारिता परिवर्तन निर्धारित किया जा सकता है. अलग अलग चरणों के लिए आयाम और जन्मों मात्रा और तापीय धारिता परिवर्तन के लिए समय रुपरेखा का वर्णन करता है कि समारोह एफ (टी) के लिए डेटा ढाले से विश्लेषण कर रहे हैं.
α 0 ए के तेजी से मेल खाती है और मैं एक धीमी प्रत्येक व्यक्ति की प्रक्रिया के लिए करने के लिए संगत α और τ जहां मैं व्यक्तिगत प्रतिक्रिया कदम के जीवनकाल हैं. के लिए दर लगातार की तापमान निर्भरता सेआर व्यक्तिगत प्रक्रियाओं सक्रियण तापीय धारिता और एन्ट्रापी मापदंडों आसानी Eyring भूखंडों का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है (मैं मैं = 1 / τ कश्मीर).
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Representative Results
प्रवासी भारतीय दिवस का एक प्रतिनिधि उदाहरण सीए 2 + डीएम nitrophen से सीए 2 + फोटो जारी करने के लिए निशान चित्रा 3 में दिखाया गया है. धीमी चरण सीए 2 + nonphotolysed पिंजरे के लिए बाध्य दर्शाता है जबकि तेज चरण, सीए 2 + डीएम nitrophen और सीए 2 + मुक्ति की तस्वीर दरार से मेल खाती है. तापमान निर्भर कारक [सी पी ρ / (DN / डीटी)] के एक समारोह के रूप में संदर्भ परिसर के आयाम तक पहुंचा तेज और धीमी चरण के लिए नमूना पीबीडी आयाम की साजिश कारक समीकरण 4 के अनुसार और मनाया राशि स्केलिंग - डीएम nitrophen फोटो हदबंदी के लिए क्वांटम उपज का हल और nonthermal मात्रा बदलने के लिए जारी की गर्मी से (Φ = 0.18) 11 समीकरण 5-7 के अनुसार (ΔV तेजी = तेजी से चरण के लिए प्रतिक्रिया तापीय धारिता और मात्रा के मूल्यों को प्रदान की 12 ± 5 एमएल / मोल और ΔH तेजी = -50 ± 20 किलो कैलोरी / मोल) औरधीमी चरण (ΔV धीमी = 9 ± 5 एमएल / मोल और ΔH धीमी = -23 ± 12 किलो कैलोरी / मोल) के लिए. Neuronal कैल्शियम सेंसर डाउनस्ट्रीम नियामक तत्व विरोधी नियामक (सपना) के सी टर्मिनल डोमेन के लिए सीए 2 + एसोसिएशन (अमीनो एसिड के अवशेष 161-256) के लिए प्रवासी भारतीय दिवस ट्रेस 4 चित्र में दिखाया गया. सीए पर 2 फोटो हदबंदी, 20 डिग्री सेल्सियस पर 1.3 ± 0.3 मिसे के समय लगातार साथ सपना के सी टर्मिनल डोमेन के लिए तस्वीर जारी की ligand एसोसिएट्स लगातार मनाया दर के तापमान निर्भरता से, CA के लिए सक्रियण बाधा 2 + सपना के सी टर्मिनल डोमेन के लिए बाध्य 9.2 ± 0.4 किलो कैलोरी / मोल होने के लिए निर्धारित किया गया था.
चित्रा 1. सीए 2 + डीएम एनआईटी के लिए रिएक्शन योजनासीए 2 + ट्रांसड्यूसर में सीए 2 + ट्रिगर गठनात्मक संक्रमण की एक तस्वीर दीक्षा की rohen + 2 uncaging और सीए एक सीए 2 + सेंसर करने के लिए बाध्य. योजनाबद्ध प्रस्तुति. सीए की फोटो दरार 2 + डीएम nitrophen मुक्त सीए 2 + एकाग्रता में वृद्धि (1 प्रोटोकॉल) की ओर जाता है, सीए 2 + ट्रांसड्यूसर और सहवर्ती संरचनात्मक संक्रमण (प्रोटोकॉल 2) के लिए सीए 2 + एसोसिएशन. बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें छवि .
चित्रा 2. Photothermal किरण विक्षेपन सेट अप. प्रायोगिक समरेख विन्यास में फोटो थर्मल किरण विक्षेपन माप के लिए सेट अप. एम 1 और एम
चित्रा 3. प्रतिनिधि प्रवासी भारतीय दिवस सीए 2 + डीएम nitrophen uncaging के लिए बताते हैं. (लाल रंग में दिखाया गया है) सीए 2 + डीएम nitrophen से सीए 2 + फोटो रिलीज जारी है और (नीले रंग में दिखाया गया है) संदर्भ परिसर के लिए प्रवासी भारतीय दिवस ट्रेस. स्थिति: 20 मिमी HEPES बफर में 1 मिमी डीएम nitrophen, 100 मिमी KCl पीएच 7.0 और 0.8 मिमी सीए 2 +. कश्मीर 3 [फे (सीएन) 6] एक संदर्भ यौगिक के रूप में इस्तेमाल किया गया था. यह अवशोषित आइंस्टीन की संख्या के एक समारोह के रूप में प्रवासी भारतीय दिवस संकेत के linearity की सीमा में है, क्योंकि संदर्भ यौगिक (एक 355nm = 0.4) के उस मेल हुआ एनएम 355 पर नमूना के अवशोषण. 0.4 की ऑप्टिकल घनत्व चयन किया गया है . प्रवासी भारतीय दिवस के निशान 20 निशान के एक औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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चित्रा 4. प्रतिनिधि प्रवासी भारतीय दिवस (सपना के सी टर्मिनल डोमेन सपना प्रोटीन की सी टर्मिनल डोमेन की उपस्थिति में सीए 2 + डीएम nitrophen से सीए 2 + फोटो जारी करने के लिए. प्रवासी भारतीय दिवस का पता लगाने की उपस्थिति में सीए 2 + डीएम nitrophen uncaging के लिए निशान और काले रंग में दिखाया संदर्भ यौगिक () के लिए लाल रंग में) दिखाया. इनसेट: अलग तापमान पर नमूना पीबीडी का पता लगाने के लिए एक घातीय क्षय से बरामद कैनेटीक्स का उपयोग Eyring साजिश है. स्थितियां 400 माइक्रोन डीएम nitrophen, 390 माइक्रोन 2 CaCl, 20 मिमी HEPES बफर पीएच 7.4, 100 मिमी KCl और 500 माइक्रोन TCEP और एक ही परिस्थितियों में संदर्भ के लिए पता लगाने में 100 माइक्रोन सी टर्मिनल सपना है. संदर्भ के लिए प्रवासी भारतीय दिवस का पता लगाने के 20 निशान के एक औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं और नमूने के लिए कि तीन निशान के एक औसत है.hres.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
photothermal तरीकों के पीछे भौतिक सिद्धांत एक फोटो उत्साहित अणु आसपास विलायक 1,12 के थर्मल ताप, जिसके परिणामस्वरूप राज्य भूमि को कंपन विश्राम के माध्यम से अतिरिक्त ऊर्जा dissipates है. जैसे पानी विलायकों के लिए, यह एक तेजी मात्रा विस्तार (ΔV वें) पैदा करता है. उत्साहित राज्य अणुओं की वजह से भी बंधन दरार / गठन और / या अणु (ओं) (वान डेर यानी परिवर्तन की आणविक आयामों को बदल सकते हैं कि आणविक संरचना में परिवर्तन करने के लिए nonthermal मात्रा परिवर्तन (ΔV nonth) में होने वाली रासायनिक प्रक्रियाओं से गुजरना सकता है वाल्स मात्रा), और साथ ही electrostriction प्रभाव में जिसके परिणामस्वरूप अणु (एस) के प्रभारी वितरण में परिवर्तन. इस ऑप्टिकल तरीकों की एक किस्म से जांच की जा सकती है कि अपवर्तनांक परिवर्तन उत्पन्न करता है कि प्रबुद्ध मात्रा का तेजी से विस्तार में यह परिणाम है. प्रवासी भारतीय दिवस एक अपवर्तनांक ढाल नमूना डी में स्थापित तथ्य है कि का लाभ लेता हैUE गाऊसी आकृति लेजर पल्स, चित्रा 2 में प्रदर्शन के रूप में नमूना के माध्यम से प्रचारित एक जांच बीम के नीचे को झुकाव का कारण बनता है.
फोटो थर्मल किरण विक्षेपन तकनीक ligand के हीम परिसरों 13 और पिंजरे से एक bioactive अणु की रिहाई की तस्वीर दरार की प्रतिक्रिया तंत्र सहित फोटो शुरू की प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए समय हल मात्रा और तापीय धारिता परिवर्तन के निर्धारण के लिए सक्षम बनाता है मिश्रित जटिल 14 के रूप में अच्छी फ्लोरोफोरे triplet राज्य जीवनकाल की जांच कर रही है. इस दृष्टिकोण आमतौर पर ऐसी क्षणिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति के रूप में Biomacromolecules में संरचनात्मक परिवर्तन, निगरानी के लिए इस्तेमाल परंपरागत तकनीकों की तुलना में कई लाभ प्रदान करता है. संरचनात्मक बदलाव मात्रा में और / या तापीय धारिता में निगरानी परिवर्तन से जांच कर रहे हैं के बाद से कोई आंतरिक क्रोमोफोर / फ्लोरोफोरे या अतिरिक्त प्रोटीन लेबलिंग, आवश्यक हैं, हालांकि नमूने में एक क्रोमोफोर की उपस्थिति तोlution पीबीडी संकेत उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, बंद प्रवाह प्रयोगों से हल नहीं कर रहे हैं जो submicrosecond timescale, पर होने वाली प्रक्रियाओं के लिए गतिज मानकों (दर स्थिरांक, सक्रियण तापीय धारिता और एन्ट्रापी), प्रवासी भारतीय दिवस माप में आसानी से उपलब्ध हैं. हाल ही में, अपवर्तन के सूचकांक या ऐसी सतह plasmon अनुनाद और biolayer इंटरफेरोमेट्री के रूप में एक तरंग दैर्ध्य पारी में एक परिवर्तन की जांच कि अन्य लेबल मुक्त पता लगाने प्रणालियों, क्रमशः, विकसित और ligand / प्रोटीन और प्रोटीन / प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया. हालांकि, प्रवासी भारतीय दिवस के विपरीत, इन तरीकों की सतह पर जैविक अणु लक्ष्य का स्थिरीकरण शामिल है और कहा कि इस प्रकार के लिए आवश्यक अतिरिक्त जैव macromolecule संशोधनों मनाया प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं.
हम बरामद thermodynamic के मापदंडों में बेहतर डेटा reproducibility और छोटे त्रुटियों के परिणामस्वरूप कई संशोधनों हमारे इंस्ट्रुमेंटेशन सेट अप अपनाया है. विशेष रूप से, एक के आवेदनप्रवासी भारतीय दिवस यंत्र के रूप में चौगुनी फोटो डायोड damped बढ़ते पदों का उपयोग कर जांच किरण और प्रवासी भारतीय दिवस डिटेक्टर दोनों का एक अतिरिक्त कंपन अलगाव पीबीडी संकेत के शोर में कमी आई है, जबकि स्थिति डिटेक्टर और इस तरह बेहतर संकेत reproducibility पर जांच किरण की एक सटीक संरेखण की अनुमति दी और प्रवासी भारतीय दिवस माप में सुलभ समय तराजू का विस्तार किया. हम प्रयोग की संवेदनशीलता इंस्ट्रूमेंटेशन सेटअप और प्रयोगात्मक शर्तों को अत्यधिक संवेदनशील है घटना (एस) और धीमी प्रक्रियाओं की निगरानी (τ> 10 मिसे) के timescale पर निर्भर करता है कि रेखांकित करने के लिए करना चाहते हैं. इसके अलावा, नमूना सेल के सामने एक dichroic दर्पण रखकर पीबीडी संकेत के एस / एन अनुपात में वृद्धि, जांच और पंप किरण की एक समरेख संरेखण आसान बनाता है.
प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम) मैं के रूप में एक समारोह के तापमान पर निर्भर कारक, [(DN / डीटी) / सी पी ρ], द्वितीय) लेजर पीओ पीबीडी संकेत के linearity का नियमित सत्यापन शामिलwer, और उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर iii) नमूना / संदर्भ absorbance. इसके अलावा, नमूना और संदर्भ माप के लिए तापमान और समान प्रयोगात्मक शर्तों के सटीक नियंत्रण मजबूत प्रवासी भारतीय दिवस माप और सफल डाटा अधिग्रहण के लिए महत्वपूर्ण है.
प्रवासी भारतीय दिवस तकनीक का मुख्य सीमा एक अध्ययन जैव macromolecule एक फोटो लेबल समूह में किया जाता है कि आवश्यकता याद दिलाता है. इस खामी विभिन्न कैद यौगिकों के आवेदन के द्वारा दूर किया जा सकता है. पेप्टाइड और प्रोटीन - - दरअसल, बंदी पेप्टाइड्स, बंदी प्रोटीन और बंदी डीएनए सहित नई caging रणनीति की हाल ही में विकास प्रोटीन सहित जटिल जैविक प्रणालियों और प्रक्रियाओं की निगरानी करने के लिए प्रवासी भारतीय दिवस का व्यापक आवेदन के लिए अनुमति देता है प्रोटीन बातचीत के साथ ही डीएनए पर तह के साथ जुड़े तेजी कैनेटीक्स physiologically प्रासंगिक समय तराजू. यहाँ प्रस्तुत रणनीति स्पष्ट रूप से एक उपयुक्त पिंजरे मिश्रित प्रणाली के साथ संयोजन में, प्रवासी भारतीय दिवस तकनीक को आसानी से करने के लिए नियोजित किया जा सकता है कि यह दर्शाता हैसीए 2 + आदि कैल्शियम सेंसर के लिए बाध्य करने के साथ ही प्रोटीन transducers के साथ छोटे ligands बातचीत की निगरानी करने के लिए या एंजाइमों को सब्सट्रेट अणुओं के बंधन के साथ जुड़े संरचनात्मक बदलाव millisecond के लिए microsecond विशेषताएँ
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एमसीबी 1021831, जेएम) और जे एंड ई. बायोमेडिकल रिसर्च प्रोग्राम (फ्लोरिडा स्वास्थ्य विभाग, जेएम) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide (III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurements |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurements |
| He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurements |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurements |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmund Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlabs | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
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