Summary
Hier een toepassing van de fotothermische straalafbuigingsbuizen techniek in combinatie met een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen tot microseconde en milliseconde dynamiek en energiebalans van structurele veranderingen met betrekking tot calcium vereniging een neuronale calcium sensor downstream Regulatory Element Antagonist Modulator volgen we verslag .
Abstract
Fotothermische straalafbuiging met fotoakoestische calorimetrie en thermische raster behoort tot de familie van fotothermische methoden die de tijd-profiel volume en enthalpie veranderingen van licht geïnduceerde conformationele veranderingen in eiwitten op microseconde tijdschaal die niet toegankelijk zijn milliseconde traditionele stop bewaken flow instrumenten. Bovendien, omdat algemene wijzigingen in volume en / of enthalpie gepeild, deze technieken kunnen worden toegepast om proteïnen en andere biomacromolecules die een fluorofoor en een chromofoor label of ontbreekt. Om dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met Ca 2 monitoren + binden aan calcium transducers, zoals neuronale calcium sensoren, een gekooide calciumverbinding, DM-nitrophen, wordt gebruikt om foto-trekker een snelle (τ <20 msec) toename van vrije calcium concentratie en het bijbehorende volume en enthalpie veranderingen worden gesondeerd met fotothermische bundeldeflectie techniek.
Introduction
Fotothermische werkwijzen zoals fotoakoestische calorimetrie, fotothermische straalafbuigingsbuizen (VOB), en voorbijgaande rooster gekoppeld nanoseconde laser excitatie vormen een krachtig alternatief voor optische spectroscopie voorbijgaande voor tijdsopgeloste studies kortstondige tussenproducten 1,2. In tegenstelling tot optische technieken, zoals transiënte absorptie-en IR-spectroscopie, die volgen het tijdsprofiel van absorptie veranderingen in de chromofoor omgeving; fotothermische technieken detecteren tijdsafhankelijkheid van warmte / volumeveranderingen en daarom waardevolle gereedschappen voor het onderzoeken tijdprofielen optisch "stille" processen. Tot dusver fotoakoestische calorimetrie en voorbijgaande rooster is met succes toegepast op conformationele dynamica van foto-geactiveerde processen waaronder twee atomen ligand migratie globins 3,4 ligand interacties met zuurstofsensor eiwit bestuderen FixL 5, elektronen en protonen transport in heem-koper oxidasen 6 eennd fotosysteem II evenals foto-isomerisatie in rhodopsin 7 en conformationele dynamica in cryptochrome 8.
Om de toepassing van fotothermische technieken om biologische systemen die ontbreken intern chromofoor en / of fluorofoor te breiden, werd de PBD techniek in combinatie met het gebruik van gekooide verbinding aan foto-trekker verhoging van ligand / substraat concentratie binnen enkele microseconden of sneller, afhankelijk het gekooide compound. Deze aanpak zorgt voor de opvolging van de dynamiek en energetica van structurele veranderingen in verband met de ligand / substraat binden aan eiwitten die ontbreken een interne fluorofoor of chromofoor en op tijd-schaal die niet toegankelijk door commerciële stopstroming instrumenten. Hier een toepassing van PBD de thermodynamica van de kooi verbinding Ca2 + DM-nitrophen, foto-splitsing en de kinetiek voor Ca 2 + associatie met het C-terminale domein van de neuronale calcium sensor omlaag monitorenstroom Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wordt gepresenteerd. De Ca 2 + is foto-vrijgelaten uit Ca 2 + DM-nitrophen binnen 10 usee en rebinds een unphotolysed kooi met een tijdconstante van ~ 300 msec. Anderzijds, in aanwezigheid van apoDREAM extra kinetische zich op de milliseconde tijdschaal waargenomen en weerspiegelt de ligand binding aan het eiwit. De toepassing van PBD conformationele transities in biologische systemen sonde of andere manier beperkt vanwege de instrumentele moeilijkheden, bijvoorbeeld zware uitlijning van de sonde en pompbundel een sterke en reproduceerbare PBD signaal bereiken. Echter, een zorgvuldige ontwerp van een instrumentatie set-up, een nauwkeurige controle van de temperatuur, en een zorgvuldige afstemming van de sonde en pompbundel een consistente en robuuste PBD signaal dat monitoring van tijdopgeloste volume en enthalpie veranderingen maakt op een breed tijdschaal van 10 usee ongeveer 200 msec. Bovendien modificaties van de experimentele procedure voor de detectie van monster en referentiesporen verzekeren onder identieke temperatuur, buffersamenstelling, optische cel oriëntatie, laservermogen, etc. vermindert de experimentele fout in afgemeten reactievolumes en enthalpie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monster Voorbereidingen
- Voer de monstervoorbereiding en alle monster manipulaties in een donkere kamer om een ongewenste uncaging voorkomen.
- Oplosbaar DM-nitrophen ((1 - (2-nitro-4 ,5-dimethoxyfenyl) - N, N, N ', N'-tetrakis [(oxy-carbonyl) methyl] -1,2-ethaandiamine) in 50 mM HEPES buffer, 100 mM KCl, pH 7,0 tot een eindconcentratie van 400 uM (ε 350 nm = 4330 M-1 cm -1 9).
- Voeg CaCl2 van de 0,1 M stockoplossing aan een wenselijke verhouding van [Ca 2 +] te bereiken: [DM-nitrophen]. Voor eiwitten met Kd voor Ca 2 + associatie groter dan 10 uM, de verhouding van [Ca 2 +] [DM-nitrophen] 1:1 de voorkeur binding van foto-model Ca2 + tot uncaged DM-nitrophen voorkomen . Immers, gezien de Kd waarde DM-nitrophen zijn 10 nM en de totale concentratie van DM-nitrophen en Ca2 + om 400 mM, ~ 90% van een calcium bindend eiwitmet K d = geeft 10 uM in de apoform. Anderzijds, voor studie van Ca2 + bindende eiwitten met Kd <10 uM, het de voorkeur de [Ca 2 +] verlagen: [DM-nitrophen] ratio 0.95 Ca 2 + complexering voorkomen dat de apo- eiwit voorafgaand de kooi fotodissociatiegebieden.
- Solubiliseren de referentieverbinding, K3 [Fe (III) (CN) 6] of Na 2 CrO 4, in dezelfde buffer als het monster.
2. Het opzetten van het experiment
- De basis experimentele configuratie is getoond in figuur 2.
- Gebruik een pengat (P2) aan de diameter van de sonde bundel (632 nm uitgang van He-Ne laser, ~ 5 mW laservermogen) aanpassen aan 1 mm en propageren de testbundel door het midden van een cel in een temperatuur gecontroleerde cel houder met behulp van een M 1 spiegel.
- Gebruik een spiegel (M 2) achter het monster aan de testbundel centrerenop een centrum van positie gevoelige detector.
- Concentreer de sonde bundel op het midden van de detector zodanig dat het verschil in spanning tussen de bovenste twee diodes en onderste twee dioden en het verschil in spanning tussen de twee diodes links en rechts van de detector nul.
- Vervolgens vorm een diameter van de pompbundel, een 355 nm uitgang Q-switched Nd: YAG laser, FWHM 5 nsec) met een 3 mm pinhole (P1) geplaatst tussen twee spiegels 355 nm laser.
- Copropagate de pompbundel door het midden van de cuvet zoals aangetoond in figuur 2. Het is belangrijk dat beide laserstralen worden voortgeplant door het midden van de optische cel in bijna collineaire wijze een meetbare afbuighoek en dus hoge amplitude van PBD signaal te verkrijgen. Onder experimentele omstandigheden, de hoek van het snijpunt van de sonde en pomp bundels kleiner is dan 15 °.
- Gebruik een referentieverbinding de sonde en pomp uitlijnenbeam om een bevredigende PBD signaal bereiken, dat wil zeggen een goede S / R-verhouding en stabiel PBD amplitude op langere tijdschalen (~ 100 msec).
- Pas de positie van de pompbundel ten opzichte van de testbundel met een incrementele aanpassing van de 355 nm laser spiegels.
- Meet de amplitude van de PBD referentiesignaal als een verschil tussen twee bovenste en onderste fotodiodes op de positiegevoelige detector. De PBD signaal zou een snelle toename van de amplitude op een snelle tijdschaal (<10 usec) vertonen en stabiel op 100 msec tijdschema zoals aangetoond in figuur 3. De twee opnamen variabiliteit van de VOB amplitude ligt op 5% van het signaal amplitude en het signaal reproduceerbaarheid wordt vooral beïnvloed door trillingen.
- Controleer de lineariteit van de PBD signaalamplitude ten opzichte van de vrijkomende warmte-energie door meting van de lineaire afhankelijkheid van de PBD signaal op de excitatie laservermogen en het aantal Einsteins geabsorbeerd, E een= (1-10-A), waarbij A overeen met de referentie absorptie bij de excitatiegolflengte.
- Houd het laservermogen onder ca. 1000 mJ en absorptie van het monster / referentieverbinding bij de excitatie golflengte van minder dan 0,5 multiphoton absorptie en vermindering van de pomp bundelvermogen respectievelijk voorkomen en zorgen lineariteit van de PBD signaal.
3. PBD Metingen
- Begin met de meting van de PBD sporen voor de referentie. Plaats de oplossing van de referentieverbinding in een 1,0 cm x 1,0 cm of 1,0 cm x 0,5 cm kwarts cel en plaats de cel in de temperatuur gecontroleerde houder. Beide weglengtes verstrekken vergelijkbare PBD amplitude.
- Detecteer referentie PBD signaal als functie van de temperatuur in het temperatuurgebied 16-35 ° C waarbij de temperatuur toename van 3 ° C.
- Bij iedere wijziging van de temperatuur, controleren van de positie van de sonde straal op de positie gevoelige detector en rede aan te passen naar het midden van de detector indien nodig.
- Controleer de lineariteit van de PBD signaal als functie van de [(dn / dt) / Cp ρ] termijn volgens vergelijking 2.
- Plaats de monsteroplossing in dezelfde optische cel als de referentieverbinding houden dezelfde oriëntatie van de optische cel en voor de referentiemeting.
- Detecteer sample PBD sporen op dezelfde temperatuur als de referentie en controleer de lineariteit van het monster PBD amplitude ten opzichte van het [(dn / dt) / Cp ρ] termijn.
4. Data Analysis
De grootte van de vervorming is recht evenredig met de volumeverandering door het monster verwarming (AV th) en nonthermal volumeverandering (AV nonth) volgens vergelijking 1: 
De amplitude van de bemonstering (A S) En referentie (A r) PBD signaal kan worden beschreven met behulp van respectievelijk de vergelijkingen 2 en 3. 
PBD signaal is recht evenredig met het parameterantwoord instrument (K) en het aantal Einsteins geabsorbeerd (Ea). De eerste term in vergelijking 2, (dn / dt) (1/ρC p) Q overeenkomt met het signaal wisselgeld voor de vrijkomende warmte het oplosmiddel. De dn / dt term vertegenwoordigt de temperatuurafhankelijke verandering van de brekingsindex, ρ de dichtheid van het oplosmiddel, Cp de warmtecapaciteit. Alle parameters bekend voor gedestilleerd water en kan worden bepaald voor een bufferoplossing door vergelijking van een PBD signaal voor de referentieverbinding in gedestilleerd water en in een geschikte buffer. Q is de hoeveelheid warmte returned om het oplosmiddel. De ρ (dn / d ρ) termijn is een eenheid meer constante die onafhankelijk van de temperatuur in het temperatuurbereik 10-40 ° C 10. An abs stemt overeen met de verandering van de brekingsindex door de aanwezigheid van absorberende species in de oplossing en het is verwaarloosbaar indien de golflengte van de sonde bundel wordt verschoven ten opzichte van de absorptiespectra van elke species in de oplossing. Het signaal ontstaan uit de referentieverbinding (A r) wordt uitgedrukt door Vergelijking 3 waar Eh ν is de foton energie op de excitatiegolflengte, Eh ν = 80,5 kcal / mol voor 355 nm excitatie.
- Neem de amplitude van de referentie-PBD signaal als het verschil tussen de pretrigger en na de trigger-PBD signaal zoals getoond in figuur 3. Op soortgelijke wijze bepaalt de amplitude van de snelle (A en snelle) en langzame fase (A en langzame) Van het monster PBD signaal.
- De parameter instrumentresponstijd, K elimineren schaal de amplitude van de bemonstering PBD signaal de amplitude van het PBD signaal voor de referentie. De verhouding van het monster signaal het referentiesignaal geeft Vergelijking 4 en kan worden geschreven als:
- Met deze vergelijking bepaalt de vrijkomende warmte aan de oplossing (Q) en nonthermal volumeverandering (AV nonth) geassocieerd met een foto-geïnitieerde reactie van de helling en intercept van respectievelijk een grafiek van [(A s / A r) e h ν] termijn versus temperatuur afhankelijke term [(dn / dt) (1/ρCp)].
- Om het reactievolume en enthalpie verandering voor de snelle en de langzame proces bepalen schaal de waargenomen omvang en enthalpie verandering de juiste quantum opbrengst volgens Vergelijkingen 5-7.
Voor een meerstaps proces kinetiek plaatsvindt op de tijdschaal tussen 10 psec ~ 200 msec, het volume en de enthalpie veranderingen in verband met de afzonderlijke stappen van de reactie worden bepaald. De amplitudes en looptijden van de afzonderlijke stappen worden geanalyseerd door het aanbrengen van de gegevens aan de functie F (t) die het tijdsprofiel van het volume en enthalpie veranderingen beschrijft.
waarbij α 0 correspondeert met de A is snel en α i stemt overeen met een langzame s voor elk proces en τ i zijn de levensduur van de afzonderlijke reactiestappen. Van de temperatuur-afhankelijkheid van de snelheidsconstante for individuele processen (k i = 1 / τ i) de activering enthalpie en entropie parameters kunnen gemakkelijk worden bepaald met behulp Eyrings plaatsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een representatief voorbeeld van PBD sporen voor Ca 2 + foto afgifte van Ca2 + DM-nitrophen wordt getoond in figuur 3. De snelle fase komt overeen met de foto-splitsing van Ca 2 + DM-nitrophen en Ca 2 + bevrijding, terwijl de langzame fase weerspiegelt Ca 2 + binding aan de nonphotolysed kooi. De plot van het monster PBD amplitude van de snelle en langzame fase geschaald op de amplitude van de referentieverbinding als functie van de temperatuur afhankelijk van factor [Cp ρ / (dn / dt)] factor volgens vergelijking 4 en schalen van de waargenomen hoeveelheid warmte vrij aan de oplossing en nonthermal volumeverandering de quantum opbrengst voor DM-nitrophen fotodissociatiegebieden (Φ = 0,18) 11 volgens Vergelijkingen 5-7 ontvangen de waarden van reactie-enthalpie en het volume voor de snelle fase (AV = fast - 12 ± 5 ml / mol en AH snel = -50 ± 20 kcal / mol) envoor de trage fase (AV slow = 9 ± 5 ml / mol en AH langzaam = -23 ± 12 kcal / mol). De PBD trace van de Ca2 + associatie met het C-terminale domein van de neuronale calcium sensor downstream Regulatory Element Antagonist Regulator (DREAM) (aminozuurresten 161-256) worden getoond in Figuur 4. Bij Ca 2 + fotodissociatiegebieden, foto-vrijgegeven ligand medewerkers om de C-terminale domein van DREAM met de tijdconstante van 1,3 ± 0,3 msec bij 20 ° C. Uit de temperatuurafhankelijkheid van de waargenomen snelheidsconstante, de activering barrière voor Ca 2 +-binding aan de C-terminale domein van Dream werd bepaald 9,2 ± 0,4 kcal / mol is.
Figuur 1. Reactieschema voor de Ca 2 + DM-nitrohen uncaging en Ca 2 + te binden aan een Ca 2 + sensor. Schematische weergave van een foto-initiatie van de Ca 2 + geactiveerd conformationele overgang in Ca 2 + transducers. Foto-splitsing van Ca 2 + DM-nitrophen leidt tot een verhoging van het vrije Ca2 +-concentratie (Protocol 1), Ca2 + associatie met de Ca2 + transducer en bijkomende structurele overgang (protocol 2). Klik hier voor vergroting afbeelding .
Figuur 2. Fotothermische straalafbuiging set-up. Experimentele set-up voor de foto-thermische straalafbuigingsbuizen metingen in de collineair configuratie. M 1 en M
Figuur 3. Vertegenwoordiger PBD sporen voor Ca 2 + DM-nitrophen uncaging. PBD trace voor de Ca 2 + foto afgifte afgifte van Ca 2 + DM-nitrophen (aangegeven in rood) en de referentie-verbinding (in blauw weergegeven). De voorwaarden: 1 mM DM-nitrophen in 20 mM HEPES-buffer, 100 mM KCl pH 7,0 en 0,8 mM Ca2 +. K3 [Fe (CN) 6] werd gebruikt als referentieverbinding. De absorptie van het monster bij 355 nm overeen die van de referentieverbinding (A 355 nm = 0,4). De optische dichtheid van 0.4 is gekozen omdat het in het bereik van de lineariteit van de PBD signaal als functie van het aantal Einsteins geabsorbeerd . De PBD sporen vertegenwoordigen een gemiddelde van 20 sporen. Klik hier voor grotere afbeelding .
content-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4.jpg" width = "600px" />
Figuur 4. Representatieve PBD sporen voor Ca 2 + DM-nitrophen uncaging bij aanwezigheid van C-terminale domein van Dream. PBD trace voor Ca 2 + foto afgifte van Ca2 + DM-nitrophen bij aanwezigheid van C-terminale domein van Dream eiwit ( aangegeven in rood) en voor de referentie-verbinding (in zwart). Inzet: Eyring plot met behulp van de kinetiek hersteld van een exponentiële verval aan het monster PBD spoor bij verschillende temperaturen. Voorwaarden 400 uM DM-nitrophen, 390 uM CaCl2, 100 uM C-terminale DREAM in 20 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl en 500 uM TCEP en trace voor de referentie onder dezelfde voorwaarden. De PBD trace van de referentie vertegenwoordigen een gemiddelde van 20 sporen en dat het monster een gemiddelde van drie sporen.hres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het fysieke principe fotothermische werkwijzen is dat een foto-geëxciteerd molecuul verspreidt overtollige energie via vibrationele relaxatie naar de grondtoestand, waardoor thermische verwarming van de omringende oplosmiddel 1,12. Voor oplosmiddelen zoals water, dit tot een snelle-expansie (AV Th). Aangeslagen toestand moleculen kunnen ook onder fotochemische processen die leiden tot niet-thermische volumeveranderingen (AV nonth) door bindingssplitsing / formatie en / of veranderingen in de moleculaire structuur die de moleculaire afmetingen van de molecule (n) (dwz veranderingen in van der kan veranderen Waals volume), en verandert de ladingsverdeling van het molecuul (s) resulteert in elektrostrictie effecten. Dit resulteert in een snelle toename van het verlichte volume brekingsindex verandering die kan worden gesondeerd door verschillende optische werkwijzen genereert. PBD maakt gebruik van het feit dat een brekingsindex gradiënt opgericht in het monster due Gaussiaans gevormde laserpuls, veroorzaakt afbuiging van een testbundel gepropageerd door het monster, zoals aangetoond in figuur 2.
De fotothermische straalafbuigingsbuizen techniek maakt de bepaling van tijdsopgeloste volume en enthalpie veranderingen van diverse foto-geïnitieerde processen inclusief de reactiemechanisme van foto-splitsing van ligand-complexen heem 13 en vrijmaking van een biologisch actief molecuul van de kooi samengestelde complex 14 evenals het sonderen van de fluorofoor triplet toestand leven. Deze aanpak biedt een aantal voordelen ten opzichte van traditionele technieken vaak gebruikt om structurele veranderingen in biomacromolecules, zoals transiënt absorptie spectroscopie en fluorescentie monitoren. Nr. intrinsieke chromofoor / fluorofoor of extra eiwitmarkerend zijn nodig omdat structurele overgangen worden gesondeerd door het volgen van veranderingen in volume en / of enthalpie, hoewel de aanwezigheid van een chromofoor in het monster zolutie moet PBD genereren. Bovendien kinetische parameters (snelheidsconstanten activatie enthalpie en entropie) voor processen zich op de submicrosecond tijdschaal die niet stop-flow experimenten zijn opgelost, zijn gemakkelijk toegankelijk in PBD metingen. Recentelijk andere labelvrije detectiesystemen dat een verandering in de brekingsindex of golflengteverschuiving zoals oppervlakte plasmon resonantie en biolayer interferometrie sonde respectievelijk ontwikkeld en toegepast op ligand / eiwit en eiwit / eiwit-interacties te bestuderen. In tegenstelling PBD, deze benaderingen omvatten immobilisatie van biologische doelmoleculen op het oppervlak en dus vereiste bijkomende biologische macromolecuul modificaties van die kunnen interfereren met het waargenomen proces.
We hebben een aantal wijzigingen onze instrumentatie set-up die resulteerde in betere gegevens reproduceerbaarheid en kleinere fouten in herstelde thermodynamische parameters vastgesteld. Met name de toepassing van eenquadruple fotodiode als PBD detector kon een nauwkeurige uitlijning van de sonde straal op de positiedetector en dus betere reproduceerbaarheid signaal dat een aanvullende vibratie isolatie van zowel de probe balk en PBD detector met gedempte montagekolommen verminderde het lawaai van de PBD signaal en breidde het tijdschalen toegankelijk in PBD metingen. Wij willen benadrukken dat de gevoeligheid van het experiment hangt af van de tijdschaal van de gebeurtenis (sen) en monitoring van tragere processen (τ> 10 msec) is zeer gevoelig voor de instrumentatie installatie en experimentele omstandigheden. Ook het plaatsen van een dichroïsche spiegel voor de monstercel vereenvoudigt een collineaire uitlijning van de sonde en pompbundel, waardoor de S / N-verhouding van het PBD signaal.
De kritische stappen van het protocol omvat regelmatige controle van de lineariteit van de PBD signaal als functie van i) temperatuursafhankelijke factor [(dn / dt) / Cp ρ], ii) laser power, en iii) monster / referentie absorptie bij de excitatie golflengte. Bovendien, nauwkeurige regeling van de temperatuur en identieke experimentele omstandigheden voor de monsters en referentiemetingen cruciaal voor robuuste PBD metingen en succesvolle data acquisitie.
De belangrijkste beperking van PBD techniek herinnert de eis dat een bestudeerde biologische macromolecuul draagt een foto-label groep. Dit nadeel kan worden ondervangen door toepassing van verschillende gekooide verbindingen. Sterker nog, de recente ontwikkeling van nieuwe kooien strategieën, waaronder gekooide peptiden, gekooid eiwit en gekooide DNA zorgt voor brede toepassing van PBD om complexe biologische systemen en processen met inbegrip van eiwitten bewaken - peptide en eiwit - eiwit interacties en een snelle kinetiek geassocieerd met DNA vouwen op fysiologisch relevante termijnen. De hier voorgestelde strategie blijkt duidelijk dat in combinatie met een geschikte kooi samenstellingssysteem, de PBD technieken kunnen worden gebruikt om eenvoudigkarakteriseren microseconde structurele overgangen verbonden met de Ca2 + binding aan calcium sensoren alsmede kleine liganden interacties met eiwitten transducers controleren of binding van substraat moleculen enzymen enz. milliseconde
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) en J. & E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide (III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurements |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurements |
| He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurements |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurements |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmund Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlabs | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
- Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
- Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).
- Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).
- Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).
- Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).
- Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).
- Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
- Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).
- Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).
- Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
- Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
- Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).
- Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
