Submillisecond Conformational Förändringar i Proteiner lösas genom fototermisk Beam Nedböjning
Summary
Här rapporterar vi en tillämpning av den fototermiska strålavböjningsenheten teknik i kombination med en bur kalciumförening, DM-nitrophen att övervaka mikrosekund och millisekund dynamik och energetik av strukturförändringar som är associerade med kalcium association till en neuronal kalciumsensor Nedströms Regulatory Element Antagonist Modulator .
Abstract
Fototermisk strålavböjningsenheten tillsammans med fotoakustisk kalorimetri och termisk galler tillhör familjen av fototermiska metoder som övervakar tidsprofil volym och entalpiförändringar av ljus inducerade konformationsförändringar i proteiner på mikrosekund att millisekund tidsskalor som inte är tillgängliga med hjälp av traditionella stopp flödesinstrument. Eftersom övergripande förändringar i volym och / eller entalpi är sonde, dessa tekniker kan tillämpas på proteiner och andra biomakromolekyler som saknar en fluorofor och eller en kromofor etikett. För att följa dynamiken och energin av strukturella förändringar i samband med Ca2 + binder till kalcium givare, sådana neuronala kalcium sensorer, en bur kalciumförening, DM-nitrophen, används för att foto utlösa en snabb (τ <20 ^ sek) ökning av fritt kalcium koncentration och tillhörande volym och entalpi ändringar sonderas med hjälp av fototermisk strålavböjningsenheten teknik.
Introduction
Fototermiska metoder såsom fotoakustisk kalorimetri, fototermisk strålavböjningsenheten (PDB), och övergående galler i kombination med nanosekund laserexcitation representerar ett kraftfullt alternativ till övergående optiska spektroskopier för tidsupplösta studier av kortlivade intermediärer 1,2. I motsats till optiska tekniker, såsom övergående absorption och IR-spektroskopi, att övervaka tidsprofilen för absorption förändringar i kromoforen omgivningen; fototermiska tekniker detektera tidsberoende förändringar värme / volym och därför är värdefulla verktyg för att undersöka tidsprofilerna för optiskt "tysta" processer. Hittills har fotoakustisk kalorimetri och övergående galler med framgång tillämpats för att studera konforma dynamik foto-inducerade processer inklusive diatomic ligand migration i globiner 3,4, ligand interaktioner med syresensor protein FixL 5, elektron-och protontransport i heme-koppar oxidases 6 ennd fotosystem II samt foto-isomerisering i rhodopsin 7 och konforma dynamik i kryptokrom 8.
För att utvidga tillämpningen av fototermiska tekniker för biologiska system som saknar en inre kromofor och / eller fluoroforen var PBD-tekniken i kombination med användning av bur förening för foto utlösa en ökning av ligand / substratkoncentration inom några mikrosekunder eller snabbare, beroende på bur förening. Detta tillvägagångssätt möjliggör övervakning av dynamik och energetics av strukturella förändringar i samband med den ligand / substrat bindning till proteiner som saknar en intern fluorofor eller kromofor och om tidsskala som inte är tillgänglig för kommersiella stop-flödesinstrument. Här en tillämpning av PBD att övervaka termodynamik av buren förening, Ca 2 + DM-nitrophen, foto-klyvning samt kinetiken för Ca 2 + förening att den C-terminala domänen av det neuronala kalciumsensor fallandeström Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) presenteras. Ca 2 + är foto-frisättas från Ca2 + DM-nitrophen inom 10 ps och rebinds till en unphotolysed bur med en tidskonstant av ~ 300 ^ sek. Å andra sidan, i närvaro av apoDREAM ytterligare kinetisk inträffar på millisekundtidsskala observeras och återspeglar den ligand som binder till proteinet. Tillämpningen av PBD att proba konformationsövergångar i biologiska system har på något sätt begränsad på grund av instrumentella svårigheter, t.ex. mödosam justering av sonden och pumpstrålen för att uppnå en stark och reproducerbar PBD signal. Emellertid en noggrann utformning av en instrumenterings set-up, en exakt kontroll av temperaturen, och en noggrann inriktning av sonden och pumpstrålen får en enhetlig och robust PBD signal som medger övervakning av tidsupplöst volym och entalpiförändringar på ett brett tidsskala från 10 ^ sek till cirka 200 msek. Dessutom MODIFICningar av den experimentella proceduren för att säkerställa upptäckt av prov-och referensspår i samma temperatur, buffertsammansättning, optisk cell orientering, lasereffekt, etc. reducerar avsevärt den experimentella fel i uppmätta reaktionsvolymer och entalpier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den fysikaliska principen bakom fototermiska metoder är att en fotoexciterade molekylen avleder överskottsenergi via vibrational relaxa till grundtillståndet, vilket resulterar i termisk uppvärmning av omgivande 1,12 lösningsmedel. För lösningsmedel, såsom vatten, ger detta en snabb expansion volym (AV: e). Excited state molekyler kan också genomgå fotokemiska processer som resulterar i nonthermal förändringar volym (AV nonth) på grund av att bindningsklyvning / bildning och…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Science Foundation (MCB 1.021.831, JM) och J. & E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM).
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
- Gensch, T., Viappiani, C. Time-resolved photothermal methods: accessing time-resolved thermodynamics of photoinduced processes in chemistry and biology. Photochem. Photobiol. Sci. 2, 699-721 (2003).
- Larsen, R. W., Mikšovská, J. Time resolved thermodynamics of ligand binding to heme proteins. Coord. Chem. Rev. 251 (9-10), 1101-1127 (2007).
- Westrick, J. A., Peters, K. S. A photoacoustic calorimetric study of horse myoglobin. Bioph. Chem. 37 (1-3), 73-79 (1990).
- Belogortseva, N., Rubio, M., Terrell, W., Miksovska, J. The contribution of heme propionate groups to the conformational dynamics associated with CO photodissociation from horse heart myoglobin. J. Inorg. Biochem. 101 (7), 977-986 (2007).
- Mikšovská, J., Suquet, C., Satterlee, J. D., Larsen, R. W. Characterization of Conformational Changes Coupled to Ligand Photodissociation from the Heme Binding Domain of FixL. Biochemistry. 44 (30), 10028-10036 (2005).
- Miksovska, J., Gennis, R. B., Larsen, R. W. Photothermal studies of CO photodissociation from mixed valence Escherichia coli cytochrome bo3. FEBS Lett. 579 (14), 3014-3018 (2005).
- Losi, A., Michler, I., Gärtner, W., Braslavsky, S. E. Time-resolved Thermodynamic Changes Photoinduced in 5,12-trans-locked Bacteriorhodopsin. Evidence that Retinal Isomerization is Required for Protein Activation. Photochem. Photobiol. 72, 590-597 (2000).
- Kondoh, M., et al. Light-Induced Conformational Changes in Full-Length Arabidopsis thaliana Cryptochrome. J. Mol. Biol. 413 (1), 128-137 (2011).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85 (17), 6571-6575 (1988).
- Eisenberg, H. Equation for the Refractive Index of Water. J. Chem. Phys. 43 (11), 3887-3892 (1965).
- Ellis-Davies, G. C., Kaplan, J. H., Barsotti, R. J. Laser photolysis of caged calcium: rates of calcium release by nitrophenyl-EGTA and DM-nitrophen. Biophys. J. 70, 1006-1016 (1996).
- Miksovska, J., Larsen, R. W. Structure-function relationships in metalloproteins. Methods Enzymol. 360, 302-329 (2003).
- Miksovska, J., Norstrom, J., Larsen, R. W. Thermodynamic profiles for CO photodissociation from heme model compounds: effect of proximal ligands. Inorg. Chem. 44 (4), 1006-1014 (2005).
- Dhulipala, G., Rubio, M., Michael, K., Miksovska, J. Thermodynamic profile for urea photo-release from a N-(2-nitrobenzyl) caged urea compound. Photochem. Photobiol. Sci. 8, 1157-1163 (2009).
