Summary
Nous rapportons ici l'application de la technique de déflexion de faisceau photothermique en combinaison avec un composé de calcium mis en cage, DM-nitrophen, pour surveiller microsecondes et une milliseconde dynamique et énergétique des changements structurels associés à l'association de calcium à une sonde calcique neuronal, Regulatory Element aval Antagoniste Modulator .
Abstract
déviation du faisceau photothermique avec photo-acoustique de la calorimétrie et réseau thermique appartient à la famille des méthodes photothermiques qui surveillent les temps un profil de volume et d'enthalpie changements de lumière induit des changements conformationnels de protéines sur microseconde à la milliseconde des échelles de temps qui ne sont pas accessibles à l'aide traditionnelle d'arrêt -flux instruments. En outre, étant donné que les changements globaux dans le volume et / ou l'enthalpie sont sondés, ces techniques peuvent être appliquées à des protéines et d'autres macromolécules biologiques qui n'ont pas un fluorophore et une étiquette ou d'un chromophore. Pour suivre la dynamique et de l'énergétique de changements structurels associés à Ca 2 + se lier à des transducteurs de calcium, de tels capteurs calciques neuronaux, un composé de calcium en cage, DM-nitrophen, est utilisé pour la photo-déclenchement d'une augmentation rapide (τ <20 ps) en calcium libre concentration et le volume associé et enthalpie changements sont sondés en utilisant une technique de déviation du faisceau photothermique.
Introduction
méthodes de photo-thermique tels que la calorimétrie photoacoustique, déviation du faisceau photothermique (APB), et des réseaux transitoires couplé avec une excitation laser nanoseconde représentent une alternative puissante aux transitoires spectroscopies optiques pour les études résolues en temps de courte durée intermédiaires 1,2. Contrairement aux techniques optiques, tels que l'absorption transitoire et la spectroscopie IR, qui contrôlent le profil temporel des changements d'absorption dans le chromophore environnante; techniques photothermiques détecter la dépendance temporelle de l'évolution de la chaleur / volume et donc sont des outils précieux pour l'étude des profils de temps de optiquement processus «silencieux». Jusqu'à présent, la calorimétrie photoacoustique et réseau transitoire a été appliquée avec succès pour étudier la dynamique de conformation des processus photo-induites, y compris la migration de ligand diatomique dans globines 3,4, interactions ligand avec la protéine du capteur d'oxygène FixL 5, électronique et le transport des protons dans l'hème-cuivre oxydases 6 une photosystème II ainsi que photo-isomérisation dans la rhodopsine 7 et dynamique conformationnelle de cryptochromes 8.
Pour étendre l'application des techniques photothermiques de systèmes biologiques qui manquent un chromophore interne et / ou fluorophore, la technique PBD a été combiné avec l'utilisation du composé en cage à photo-déclenchement d'une augmentation de la concentration de ligand / substrat à l'intérieur de quelques microsecondes ou plus rapide, en fonction de sur le composé encagé. Cette approche permet la surveillance de la dynamique et de l'énergétique de changements structurels associés à la liaison ligand / substrat de protéines qui manquent un fluorophore interne ou chromophore et sur l'échelle de temps qui ne sont pas accessibles par des instruments arrêt flux commerciaux. Ici, une demande de PBD pour surveiller la thermodynamique du composé de cage, Ca 2 + DM-nitrophen, photo-clivage, ainsi que la cinétique de liaison de Ca 2 + pour le domaine C-terminal de la sonde calcique neuronal vers le basflux réglementation élément antagoniste Modulator (DREAM) est présenté. Le Ca2 + est libéré par photo-Ca 2 + DM-nitrophen à moins de 10 microsecondes et lie de nouveau à une cage unphotolysed avec une constante de temps d'environ 300 microsecondes. D'autre part, en présence d'un apoDREAM cinétique supplémentaire se produisant sur l'échelle de temps d'une milliseconde est observée et reflète la liaison à la protéine ligand. L'application de PBD pour sonder les transitions conformationnelles dans les systèmes biologiques a été quelque peu limitée en raison des difficultés instrumentales; alignement par exemple difficile de la sonde et du faisceau pompe pour obtenir un signal fort PBD et reproductible. Cependant, une conception minutieuse d'une instrumentation mise en place, un contrôle précis de la température, et un alignement précis de la sonde et la pompe faisceau fournissent un signal cohérent et robuste PBD qui permet de contrôler le volume en temps résolu et changements d'enthalpie sur un large échelle de temps de 10 microsecondes à environ 200 ms. En outre, modifications de la procédure expérimentale pour assurer la détection d'échantillon et de référence traces sous température identique, la composition du tampon, de l'orientation de la cellule optique, la puissance du laser, etc réduit sensiblement l'erreur expérimentale dans les volumes et les enthalpies de réaction mesurés.
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Protocol
Une. Préparatifs exemples
- Effectuer la préparation des échantillons et toutes les manipulations échantillon dans une pièce sombre pour prévenir une uncaging indésirables.
- Solubiliser nitrophen DM-((1 - (2-nitro-4 ,5-diméthoxyphényl) - N, N, N ', N'-tétrakis [(oxy-carbonyl)-méthyl] -1,2-éthanediamine) dans 50 mM d'HEPES tampon, mM KCl, pH 7,0 à une concentration finale de 400 pM (100 350 nm ε = 4330 M -1 cm -1 9).
- Ajouter CaCl2 partir de la solution 0,1 M d'atteindre un ratio souhaitable de [Ca 2 +]: [DM-nitrophen]. Pour les protéines ayant une valeur de Kd pour la liaison du Ca 2 + supérieure à 10 uM, le rapport de [Ca 2 +]: [DM-nitrophen] de 1:1 est préférable d'empêcher la liaison de photo-libéré de Ca 2 + à uncaged DM-nitrophen . En effet, compte tenu de la valeur de K d de DM-nitrophen être 10 nM et la concentration totale de DM-nitrophen et Ca 2 + à 400 mM, ~ 90% d'une protéine de liaison de calciumavec K d = 10 uM seront dans la apoform. D'autre part, pour l'étude de Ca 2 + se lier à des protéines avec des Kd <10 uM, il est préférable de diminuer la [Ca 2 +]: rapport [DM-nitrophen] de 0,95 à empêcher Ca 2 + complexation avec l'apo- protéine avant la cage photo-dissociation.
- Solubiliser le composé de référence, K 3 [Fe (III) (CN) 6] ou Na 2 CrO 4, dans le même tampon que pour l'échantillon.
2. Mise en place de l'Expérience
- La configuration expérimentale de base est représentée sur la figure 2.
- Utiliser un trou de broche (P 2) pour ajuster le diamètre du faisceau de sonde (632 de sortie de nm d'un laser He-Ne, ~ puissance laser de 5 mW) à 1 mm et de propager le faisceau sonde à travers le centre d'une cellule placée dans une température contrôlée support de cellule à l'aide d'un miroir M 1.
- Utiliser un miroir (M 2) en arrière de l'échantillon pour centrer le faisceau de sondesur un centre du détecteur sensible à la position.
- Focaliser le faisceau sonde sur le centre du détecteur de telle manière que la différence de tension entre les deux premières diodes et de fond de deux diodes ainsi que la différence de tension entre les deux diodes sur le côté gauche et droit du détecteur est zéro.
- Par la suite, la forme d'un diamètre du faisceau de pompage, une sortie de 355 nm de Q-switched laser Nd: YAG, 5 ns FWHM) en utilisant un trou d'épingle de 3 mm (P 1) placé entre deux miroirs de laser de 355 nm.
- Copropagate le faisceau de pompage à travers le centre de la cuve comme l'illustre la figure 2. Il est important que les deux faisceaux laser se propagent à travers le centre de la cellule optique de manière à peu près colinéaires afin d'obtenir un angle de déviation mesurable et donc une grande amplitude du signal de PBD. Dans des conditions expérimentales, l'angle de l'intersection des faisceaux sonde et pompe est inférieur à 15 °.
- Utilisez un composé de référence pour aligner la sonde et la pompefaisceau pour obtenir un signal PBD satisfaisante, c'est à dire un bon rapport S / N et stable amplitude PBD sur des échelles de temps plus longues (~ 100 ms).
- Ajuster la position du faisceau de pompage par rapport au faisceau sonde par un ajustement incrémentiel de miroirs laser 355 nm.
- Mesurer l'amplitude du signal de référence PBD comme une différence entre les deux photodiodes en haut et en bas sur le détecteur sensible à la position. Le signal PBD doit présenter une augmentation rapide de l'amplitude sur une échelle de temps rapide (<10 ps) et reste stable sur 100 calendrier ms comme le montre la figure 3. Le tir à la variabilité tiré de l'amplitude APB est à moins de 5% de l'amplitude du signal et la reproductibilité du signal est principalement affectée par les vibrations.
- Vérifier la linéarité de l'amplitude du signal PBD par rapport à l'énergie thermique dégagée par la mesure de la dépendance linéaire du signal PBD sur la puissance du laser d'excitation et le nombre de Einstein absorbé, E un= (10.01-A), où A correspond à l'absorbance de référence à la longueur d'onde d'excitation.
- Maintenir la puissance laser inférieure à environ 1 000 pJ et l'absorbance du composé échantillon / de référence à la longueur d'onde d'excitation inférieur à 0,5 pour éviter une absorption multiphotonique et une diminution de la puissance du faisceau de pompage, respectivement, et d'assurer la linéarité du signal PBD.
3. Mesures PBD
- Commencez par la mesure des traces PBD pour la référence. Placer la solution du composé de référence dans une cellule de quartz de 0,5 cm x 1,0 cm x 1,0 cm ou 1,0 cm et la position de la cellule dans le support à température contrôlée. Les deux longueurs de trajet fournissent amplitude PBD comparable.
- Détecter le signal de PBD de référence en fonction de la température dans la plage de températures 16-35 ° C avec l'augmentation de température de 3 ° C.
- A chaque changement de température, vérifier la position du faisceau de la sonde sur le détecteur sensible à la position et à nouveauajuster la position du centre du détecteur, si nécessaire.
- Vérifier la linéarité du signal PBD en fonction de la [(dn / dt) / ρ p C] terme conformément à l'équation 2.
- Placer la solution d'échantillon dans la même cellule optique que pour le composé de référence en conservant la même orientation de la cellule optique pour la mesure de référence.
- Détecter les traces de PBD de l'échantillon dans la même gamme de température que pour la référence et vérifier la linéarité de l'amplitude de l'échantillon PBD à l'égard de la [(dn / dt) / C p ρ] terme.
4. Analyse des données
L'amplitude de la déviation est directement proportionnelle à la variation de volume due à l'échauffement de l'échantillon (AV th) et de changement de volume non thermique (AV de nonth) selon l'équation 1: 
L'amplitude de l'échantillon (A S) Et de référence (A r) signal de PBD peut être décrit en utilisant les équations 2 et 3, respectivement. 
Le signal PBD est directement proportionnelle au paramètre de réponse de l'instrument (K) et le nombre d'Einstein absorbée (E a). Le premier terme de l'équation 2, (dn / dt) (1/ρC p) Q, correspond à la variation du signal due à la chaleur dégagée dans le solvant. Le dn / dt terme représente la variation dépendant de la température de l'indice de réfraction, ρ est la masse volumique du solvant, C p est la capacité calorifique. Tous les paramètres sont connus de l'eau distillée et peut être déterminée pour une solution de tampon en comparant un signal de PBD pour le composé de référence dans de l'eau distillée et dans un tampon approprié. Q est la quantité de returne de chaleurd pour le solvant. Le ρ (dn / d ρ) est un terme constant en unités de moins que est indépendante de la température dans la plage de température de 10-40 ° C 10. Terme abs An correspond à la variation de l'indice de réfraction due à la présence d'espèces absorbantes dans la solution et il est négligeable si la longueur d'onde du faisceau de sonde est déplacé par rapport au spectre d'absorption d'une espèce dans la solution. Le signal issu du composé de référence (A r) est exprimée par l'équation 3 h ν où E est l'énergie des photons à la longueur d'onde d'excitation, E h ν = 80,5 kcal / mol pour 355 nm excitation.
- Prendre l'amplitude du signal de PBD de référence comme la différence entre la pré-déclenchement et le signal de PBD poste de déclenchement comme illustré dans la figure 3. De la même manière, déterminer l'amplitude de la vitesse (A s rapide) et la phase lente (A s lent) Du signal échantillon de PBD.
- Pour éliminer le paramètre de réponse de l'instrument, K, l'échelle de l'amplitude du signal échantillon de PBD par l'amplitude du signal pour le PBD référence. Le rapport entre le signal d'échantillonnage au signal de référence et donne l'équation 4 peut être écrite comme:
- En utilisant cette équation, déterminer la chaleur libérée dans la solution (Q) et le changement de volume non thermique (AV de nonth) associée à une réaction de photo-initiée à partir de la pente et l'interception, respectivement, d'un terrain de [(A s / A r) E h ν] terme fonction de la température terme dépendant [(dn / dt) (1/ρCp)].
- Pour déterminer le volume de réaction et changement d'enthalpie pour le rapide et le lent processus, à l'échelle du volume observé et changement d'enthalpie pour le rendement quantique appropriée selon les équations 5-7.
Pour un procédé en plusieurs étapes avec une cinétique se produisant sur l'échelle de temps comprise entre 10 ps ~ 200 ms, le volume et les variations d'enthalpie associées aux différentes étapes de la réaction peuvent être déterminées. Les amplitudes et les durées de vie pour les étapes individuelles sont analysées par ajustement des données à la fonction F (t), qui décrit l'évolution temporelle du volume et de changements d'enthalpie.
où α 0 correspond à la Une s rapide et α i correspond à une lente s pour chaque processus individuel et τ i sont la durée de vie des différentes étapes de réaction. De la dépendance en température de la constante de vitesse de for processus individuels (k i = 1 / τ i) les paramètres d'enthalpie d'activation et d'entropie peut être facilement déterminée en utilisant des parcelles Eyring.
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Representative Results
Un exemple représentatif de PBD retrace pour Ca 2 + photo-libération de Ca 2 + DM-nitrophen est représenté dans la figure 3. La phase rapide correspond à la photo-clivage de Ca 2 + DM-nitrophen et la libération de Ca 2 +, tandis que la phase lente reflète la liaison du Ca 2 + à la cage nonphotolysed. Le tracé de l'échantillon PBD amplitude pour la phase rapide et lente à l'échelle de l'amplitude du composé de référence en fonction du facteur de température dépendait [C p ρ / (dn / dt)] Facteur selon l'équation 4 et la normalisation de la quantité observée de chaleur libérée dans la solution et de changement de volume non thermique pour le rendement quantique de DM-nitrophen photo-dissociation (Φ = 0,18) 11 selon les équations 5-7 à condition que les valeurs de l'enthalpie et le volume réactionnel pour la phase rapide (fast AV = - 12 ± 5 ml / mol et AH rapide = -50 ± 20 kcal / mol) etpour la phase lente (AV lente = 9 ± 5 ml / mol et AH lente = -23 ± 12 kcal / mol). La trace PBD pour le Ca 2 + association pour le domaine C-terminal de la sonde de calcium neuronal aval Regulatory Element Antagoniste régulateur (REVE) (résidus d'acides aminés 161 à 256) sont présentées sur la figure 4. Sur Ca 2 + photo-dissociation, associés ligand photo-publié dans le domaine C-terminal de rêve avec la constante de temps de 1,3 ± 0,3 ms à 20 ° C. De la dépendance en température de la constante de vitesse observée, la barrière d'activation de Ca 2 + se lier au domaine C-terminal de REVE a été déterminée comme étant de 9,2 ± 0,4 kcal / mol.
Figure 1. Le schéma de réaction pour le Ca 2 + DM-nitRohen liaison uncaging et Ca 2 + à un capteur de Ca 2 +. Représentation schématique d'une photo-initiation de la Ca 2 + déclenché transition conformationnelle en Ca 2 + transducteurs. Photo-clivage de Ca 2 + DM-nitrophen conduit à une augmentation de la concentration de Ca2 + libre (Protocole 1), Ca 2 + à l'association + transducteur Ca 2 et la transition structurelle concomitante (protocole n ° 2). Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Photothermique déviation du faisceau mis en place. Expérimental mis en place pour les mesures de déflexion du faisceau photo-thermique dans la configuration colinéaires. M 1 et M
Figure 3. PBD représentant retrace pour Ca 2 + DM-nitrophen uncaging. PBD trace pour le Ca 2 + photo à libération libération de Ca 2 + DM-nitrophen (en rouge) et le composé de référence (en bleu). Les conditions: 1 mM DM-nitrophen dans du tampon HEPES 20 mM, KCl 100 mM pH 7,0 et 0,8 mM de Ca 2 +. K 3 [Fe (CN) 6] a été utilisé comme composé de référence. L'absorption de l'échantillon à 355 nm correspondait à celui du composé de référence (A à 355nm = 0,4). La densité optique de 0,4 est choisie car elle est dans la gamme de linéarité du signal PBD en fonction du nombre d'Einstein absorbé . Les traces PBD représentent une moyenne de 20 traces. Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Figure 4. PBD représentant retrace pour Ca 2 + DM-nitrophen uncaging en présence du domaine C-terminal de DREAM. Trace PBD pour Ca 2 + photo-libération de Ca 2 + DM-nitrophen en présence du domaine C-terminal de la protéine DREAM ( représenté en rouge) et le composé de référence (en noir). Encart: terrain de Eyring utilisant la cinétique de récupération d'une décroissance exponentielle de la PBD trace de l'échantillon à des températures différentes. Conditions de 400 uM DM-nitrophen, 390 uM CaCl 2, 100 uM C-terminal DREAM tampon HEPES 20 mM pH 7,4, KCl 100 mM et 500 uM PTCE et tracer pour la référence dans les mêmes conditions. La trace de la PBD référence représentent une moyenne de 20 traces, et que pour l'échantillon est une moyenne de trois traces.hres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.
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Discussion
Le principe physique derrière procédés photothermiques qui est une molécule de photo-excité dissipe de l'énergie en excès par relaxation vibrationnelle à l'état de base, ce qui entraîne un chauffage thermique de la 1,12 solvant environnant. Pour les solvants tels que l'eau, ce qui produit une expansion de volume rapide (AV th). Molécules à l'état excité peuvent également subir des processus photochimiques qui entraînent des changements de volume non thermiques (AV de nonth) en raison de clivage de la liaison / formation et / ou des changements dans la structure moléculaire qui peuvent modifier les dimensions moléculaires de la molécule (s) (ie changements de van der le volume Waals), ainsi que de modifier la répartition de la charge de la molécule (s) conduisant à des effets d'électrostriction. Il en résulte une expansion rapide du volume éclairé qui génère le changement d'indice de réfraction qui peut être sondé par une variété de méthodes optiques. PBD prend avantage du fait qu'un gradient d'indice de réfraction établie dans l'échantillon due de l'impulsion laser en forme de gaussienne, provoque la déflexion d'un faisceau de sonde se propageant à travers l'échantillon comme le montre la figure 2.
La technique de déflexion de faisceau de photo-thermique permet la détermination du volume résolue dans le temps et les changements d'enthalpie pour une large gamme de procédés de photo-initiée, y compris le mécanisme de la réaction de photo-clivage de complexes ligand-hème 13 et la libération d'une molécule bio-active à partir de la cage complexe composé 14 ainsi que sonder l'état triplet vie fluorophore. Cette approche offre plusieurs avantages par rapport aux techniques traditionnelles couramment utilisés pour surveiller les changements structurels dans biomacromolécules, telles que la spectroscopie d'absorption transitoire et la fluorescence. Aucune intrinsèque chromophore / fluorophore ou le marquage de protéines supplémentaires sont nécessaires étant donné que les transitions structurelles sont sondés par la surveillance des changements dans le volume et / ou de l'enthalpie, bien que la présence d'un chromophore dans l'échantillon de telle sortetion est nécessaire pour générer le signal PBD. En outre, les paramètres cinétiques (constantes de vitesse, enthalpie d'activation et de l'entropie) pour les processus qui se produisent sur l'échelle de temps inférieure à la microseconde, qui ne sont pas résolus dans les expériences arrêt d'écoulement, sont facilement accessibles dans les mesures PBD. Récemment, d'autres systèmes de détection libres d'étiquettes qui permettent d'analyser un changement dans l'indice de réfraction ou d'un changement de longueur d'onde telle que la résonance de plasmon de surface et couche biologique interférométrie, respectivement, ont été développées et appliquées pour étudier ligand / protéine et des interactions protéine / protéine. Cependant, contrairement à PBD, ces approches impliquent l'immobilisation de molécules cibles biologiques sur la surface et les modifications bio-macromolécules supplémentaires nécessaires ainsi que de peuvent interférer avec le processus observé.
Nous avons adopté plusieurs modifications de notre instrumentation mise en place qui ont abouti à une meilleure reproductibilité des données et les petites erreurs dans les paramètres thermodynamiques récupérés. Plus précisément, l'application d'unequadruple photo-diode en tant que détecteur PBD a permis un alignement précis du faisceau de sonde sur le détecteur de position, et donc une meilleure reproductibilité du signal alors que l'isolation vibratoire supplémentaire à la fois du faisceau de sonde et le détecteur PBD aide de broches de montage à amortissement diminue le bruit du signal PBD et élargi les échelles de temps accessibles dans les mesures PBD. Nous tenons à souligner que la sensibilité de l'expérience dépend de l'échelle de temps de l'événement (s) et le suivi des processus plus lents (τ> 10 ms) est très sensible à la configuration de l'instrumentation et des conditions expérimentales. En outre, en plaçant un miroir dichroïque en face de la cellule d'échantillonnage simplifie un alignement colinéaire de la sonde et la pompe faisceau, augmentant ainsi le rapport signal / bruit du signal PBD.
Les étapes critiques du protocole comprennent la vérification régulière de la linéarité du signal PBD en fonction de i), le facteur dépendant de la température, [(dn / dt) / ρ p C], ii) de laser power, et iii) l'absorbance d'échantillonnage / de référence à la longueur d'onde d'excitation. En outre, un contrôle précis de la température et des conditions expérimentales identiques pour échantillon et de référence des mesures est indispensable pour des mesures fiables PBD et l'acquisition de données réussi.
La principale limitation de la technique PBD rappelle l'exigence d'un bio-macromolécule étudié comporte une photo de groupe du label. Cet inconvénient peut être surmonté par l'application de divers composés en cage. En effet, le développement récent de nouvelles stratégies de mise en cage, y compris des peptides en cage, les protéines en cage et l'ADN cage permet d'élargir l'application de PBD pour surveiller les systèmes et les processus biologiques complexes, y compris protéine - peptide, et les interactions protéine - protéine ainsi que cinétique rapide associés à l'ADN de pliage sur échelles de temps physiologiquement pertinents. La stratégie présentée ici montre clairement que, en combinaison avec un système composé de cage appropriée, les techniques PBD peuvent être facilement utilisés pourmicroseconde à la milliseconde caractériser les transitions structurelles associées à la liaison du Ca 2 + à des capteurs de calcium ainsi que pour surveiller les interactions avec les ligands de petits transducteurs de protéines de liaison ou des molécules de substrat d'enzymes, etc
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation (MCB 1021831, JM) et J. & E. Programme de recherche biomédicale (Floride ministère de la Santé, JM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide (III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurements |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurements |
| He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurements |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurements |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmund Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlabs | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
References
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