שינויי קונפורמציה Submillisecond בחלבונים נפתר על ידי photothermal Beam הסטה

Summary

כאן אנו מדווחים יישום של טכניקת הסטת קרן photothermal בשילוב עם תרכובת בכלוב סידן, DM-nitrophen, לעקוב אחר דינמיקת המיקרו והאלפית שנייה והאנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים לעמותת סידן לחיישן סידן עצבי, אלמנט רגולטורים במורד אנטגוניסט מודולטור .

Abstract

סטיה קרן photothermal יחד עם calorimetry תמונה אקוסטי ותרמי צורמת שייכת למשפחה של שיטות photothermal שלפקח בזמן פרופיל הנפח ואנתלפיה שינויי אור הנגרמים שינויי קונפורמציה בחלבונים במייקרו לאלפית שני בזמן קשקשים שאינם נגישים באמצעות מסורתית תחנה תזרים מכשירים. בנוסף, מאז שינויים הכוללים בנפח ו / או אנתלפיה הם חקרו, ניתן ליישם את הטכניקות הללו לחלבונים וBiomacromolecules האחרים שחסרים fluorophore ואו תווית chromophore. כדי לעקוב אחר דינמיקה ואנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים Ca ^{2 +} מחייב מתמרים סידן, סידן חיישנים עצביים כגון, תרכובת סידן בכלוב, DM-nitrophen, הוא מועסק צילום הדק עלייה מהיר (τ <20 μsec) בסידן חופשי שינויי ריכוז והנפח הקשורים ואנתלפיה הם חקרו באמצעות טכניקת סטיה קרן photothermal.

Introduction

שיטות צילום תרמי כגון calorimetry photoacoustic, סטיה קרן photothermal (PDB), וצורם חולפים בשילוב עם עירור לייזר שבריר שנייה מייצגות חלופה רבת עוצמה ל חולפת spectroscopies האופטי ללימודים של ביניים קצרים ^1,2 זמן נפתר. בניגוד לשיטות אופטיות, כגון קליטה חולפת וספקטרוסקופיה IR, העוקב אחר הפרופיל של שינויי קליטה בכרומופור שמסביב הזמן; טכניקות photothermal לזהות בזמן התלות של שינויי חום / נפח ולכן הם כלים רבי ערך לחקר פרופילים של אופטי זמן תהליכים "שקטים". עד כה, calorimetry photoacoustic והצורם חולפים כבר מיושמים בהצלחה ללמוד דינמיקה קונפורמציה של תהליכים הנגרם תמונה כוללים הגירת יגנד דו אטומית בglobins ^3,4, אינטראקציות יגנד עם חלבון חיישן חמצן FixL ^5, אלקטרון ופרוטון בתחבורת heme-נחושת oxidases ⁶nd photosystem השני, כמו גם צילום isomerization ברודופסין ⁷ ודינמיקת קונפורמציה בCryptochrome ^8.

כדי להרחיב את היישום של טכניקות photothermal למערכות ביולוגיות שחסרות chromophore ו / או fluorophore פנימי, טכניקת PBD הייתה בשילוב עם השימוש במתחם בכלוב לצילום הדק עלייה בריכוז ליגנד / מצע בתוך כמה מיקרו או מהיר יותר, בהתאם במתחם בכלוב. גישה זו מאפשרת ניטור של דינמיקה ואנרגטיקה של שינויים מבניים הקשורים ליגנד / המצע מחייב את חלבונים שחסרים fluorophore או כרומופור פנימי ובזמן בקנה מידה שאינם נגישים על ידי עצירת זרימת מכשירים מסחריים. הנה יישום של PBD כדי לפקח על התרמודינאמיקה של מתחם הכלוב, Ca ^{2 +} DM-nitrophen, צילום מחשוף כמו גם קינטיקה לCa ^{2 +} עמותה לתחום בטרמינל C-של חיישן סידן העצבי דאוןזרם התקינה האלמנט אנטגוניסט מודולטור (חלום) מוצג. Ca ^{2 +} הוא מCa-שוחררה תמונה ^{2 +} DM-nitrophen בתוך 10 μsec וrebinds לכלוב unphotolysed עם קבוע של ~ 300 μsec זמן. מצד השני, בנוכחות apoDREAM הקינטית נוספת המתרחש בזמן בקנה המידה אלפית השנייה הוא ציין ומשקף את יגנד מחייב את החלבון. היישום של PBD לחקור מעברי קונפורמציה במערכות ביולוגיות היה מוגבל בדרך כלשהי בשל קשיי אינסטרומנטלי; יישור למשל מפרך של החללית וקרן משאבה כדי להשיג אות PBD חזקה ושחזור. עם זאת, עיצוב מוקפד של הגדרת מכשור, שליטה מדויקת של הטמפרטורה, ויישור זהיר של קרן הבדיקה ומשאבה מספקים אות PBD עקבית ויציבה, המאפשרת ניטור של זמן נפתר שינויי אנתלפיה ועוצמת קול ברחב זמן בקנה מידה מ10 μsec כ 200 לאלפיות שניים. בנוסף, modifications של ההליך ניסיוני כדי להבטיח זיהוי של עקבות מדגם והתייחסות בטמפרטורה זהה, הרכב חיץ, אורינטצית תא אופטי, כוח הלייזר, וכו 'מפחית באופן משמעותי את השגיאה הניסיונית בכמויות תגובה נמדדו וenthalpies.

Protocol

1. הכנות לדוגמא

1. לבצע את הכנת מדגם וכל מניפולציות המדגם בחדר חשוך כדי למנוע משחררות רפרוף לא רצוי.
2. Solubilize DM-nitrophen ((1 - (2-ניטרו-4 ,5-dimethoxyphenyl) - N, N, N ', N'-tetrakis [מתיל (Oxy-קרבוניל)] -1,2-ethanediamine) ב50 HEPES מ"מ חיץ, 100 מ"מ KCl, pH 7.0 לריכוז סופי של 400 מיקרומטר (ε _350nm = 4330 M ^-1 cm ^{-1 9).}
3. להוסיף CaCl ₂ מפתרון מניות 0.1 M כדי להשיג יחס רצוי של [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen]. לחלבונים עם _ד K עבור Ca ^{2 +} עמותה גדולה מ10 מיקרומטר, היחס של [Ca ^{2 +]:} [DM-nitrophen] של 1:1 עדיף למנוע מחייב של ^{2 +} Ca-שוחרר תמונה לDM-nitrophen שברחה מכלוב . ואכן, שוקל את ערך _ד K עבור DM-nitrophen להיות 10 ננומטר והריכוז הכולל של DM-nitrophen וCa ^{2 +} להיות 400 מ"מ, ~ 90% סידן חלבון מחייביםעם _ד K = 10 מיקרומטר יהיה בapoform. מצד השני, למחקר של Ca ^{2 +} מחייב את חלבונים עם _ד K <10 מיקרומטר, עדיף להקטין את [Ca ^{2 +]:} היחס [DM-nitrophen] ל0.95 למנוע Ca ^{2 +} complexation עם APO- חלבון לפני צילום דיסוציאציה הכלוב.
4. Solubilize מתחם ההתייחסות, K ₃ [Fe (III) (CN) _6] או Na _{2 4} CRO, באותו חיץ כלמדגם.

2. הגדרת הניסוי

1. התצורה הניסיונית הבסיסית מוצגת באיור 2.
2. השתמש חור סיכה (P ₂₎ כדי להתאים את הקוטר של קרן הבדיקה (פלט 632 ננומטר של לייזר הוא Ne-, כוח לייזר 5 mW ~) 1 מ"מ ולהפיץ את קרן הבדיקה דרך מרכז תא יוצב בטמפרטורה בשליטת בעל תא באמצעות מראה M _1.
3. להשתמש במראה (ז ₂₎ מאחורי המדגם כדי למרכז את קרן הבדיקהבמרכזו של גלאי רגיש עמדה.
4. תתמקד קרן הבדיקה במרכז של הגלאי בצורה כזאת, כי ההבדל במתח בין שתי דיודות העליונה ושתי דיודות תחתונה, כמו גם ההבדל במתח בין שתי דיודות בצד השמאל וימין של הגלאי הוא אפס.
5. בהמשך לכך, לעצב את קוטר של קרן המשאבה, פלט 355 ננומטר של ממותג Q Nd: YAG לייזר, FWHM 5 NSEC) באמצעות חריר 3 מ"מ (P ₁₎ ממוקם בין שתי מראות לייזר 355 ננומטר.
6. Copropagate קרן המשאבה דרך מרכז קובט כפי שמודגם באיור 2. חשוב ששני קרני הלייזר מופצות דרך מרכז התא האופטי באופן כמעט colinear להשיג זווית סטיה מדידה ובכך גבוהה המשרעת של אות PBD. תחת תנאי ניסוי, את הזווית של צומת האלומות ובדיקת המשאבה היא פחות מ 15 °.
7. השתמש במתחם התייחסות ליישר את החללית ומשאבהקרן להשגת אות PBD משביעה רצון, כלומר יחס טוב S / N ומשרעת PBD יציב על סקלות זמן ארוכים יותר (~ 100 אלפיות שנייה).
8. להתאים את המיקום של קרן המשאבה ביחס לקרן הבדיקה על ידי התאמה הדרגתית של 355 מראות לייזר ננומטר.
9. מדוד את המשרעת של אות ייחוס PBD כהבדל בין שתי דיודות העליונה והתחתונה על הגלאי רגיש העמדה. אות PBD צריכה להפגין גידול מהיר במשרעת בזמן בקנה מידה מהירה (<10 μsec) ולהישאר יציבה ב100 זמנים אלפיות שניים כפי שמודגמת באיור 3. הזריקה לשונות נורו של משרעת PDB היא בתוך 5% של משרעת האות ושחזור האות מושפע בעיקר מתנודות.
10. בדוק את הליניאריות במשרעת אות PBD ביחס לאנרגיית החום המשתחררת על ידי מדידת התלות ליניארית של אות PBD על כוח לייזר עירור ועל מספר אינשטיין נספגה, E= ^(1-10-), שבו תואם את ספיגת ההתייחסות בגל העירור.
11. שמור את כוח הלייזר מתחת כ -1,000 μJ וספיגה של מתחם מדגם / התייחסות בגל העירור פחות מ 0.5 כדי למנוע ספיגת multiphoton וירידה של כוח קרן משאבה, בהתאמה, ולהבטיח ליניאריות של אות PBD.

3. מדידות PBD

1. התחל עם המדידה של עקבות PBD להתייחסות. מניחים את הפתרון של מתחם ההתייחסות בתא קוורץ x 0.5 סנטימטר 1.0 סנטימטר x 1.0 סנטימטר או 1.0 סנטימטר ולמקם את התא בבעל הטמפרטורה מבוקרת. שני אורכי הנתיב לספק משרעת PBD דומה.
2. לזהות את אות PBD ההתייחסות כפונקציה של טמפרטורה בטווח הטמפרטורות 16-35 ° C עם תוספת הטמפרטורה של 3 מעלות צלזיוס
3. על כל שינוי בטמפרטורה, לבדוק את המיקום של קרן הבדיקה בגלאי רגיש העמדה מחדשלהתאים את המיקום למרכז של הגלאי במידת צורך.
4. בדוק את הליניאריות של אות PBD כפונקציה של טווח [(dn / dt) ρ _{P /} C] לפי משוואה 2.
5. מניחים את פתרון המדגם באותו התא אופטי כמו למתחם התייחסות שמירה על אותו הכיוון של התא האופטי כמו למדידת ההתייחסות.
6. זיהוי מדגם עקבות PBD באותו טווח הטמפרטורות כמו להתייחסות ולבדוק את הליניאריות של משרעת PBD המדגם ביחס ל[ (dn / dt) ρ _{P /} C] הטווח.

4. ניתוח נתונים

סדר הגודל של הסטייה הוא ביחס ישר לשינוי הנפח עקב חימום המדגם (ΔV _ה) ושינוי nonthermal נפח _(nonth ΔV) לפי משוואת 1:

המשרעת של המדגם _(S) והתייחסות _(r) אות PBD ניתן לתאר באמצעות משוואות 2 ו -3, בהתאמה.

אות PBD עומד ביחס ישר לפרמטר תגובת מכשיר (K) ומספר אינשטיין נספג (E). הקדנציה הראשונה במשוואה 2, (dn / dt) _{(עמ '1/ρC)} Q, תואמת את שינוי האות עקב החום המשתחרר לממס. Dn / dt הטווח מייצג את שינוי הטמפרטורה תלויה באינדקס שבירה, ρ הוא הצפיפות של הממס, _{עמ 'C} הוא קיבול החום. כל הפרמטרים ידועים למים מזוקקים וניתן לקבוע לפתרון חיץ על ידי השוואת אותות PBD למתחם ההתייחסות במים מזוקקים ובמאגר מתאים. Q הוא כמות returne החוםד לממס. טווח ρ (DN / ד ρ) הוא יחידה קבועה פחות שהוא טמפרטורה עצמאית בטווח טמפרטורות 10-40 ° C ^10. טווח _{רירי בטן} Δn מתאים לשינוי באינדקס השבירה בשל נוכחותם של מיני קליטה בפתרון וזה זניח אם אורך הגל של קרן הבדיקה מוסט ביחס לספקטרום הספיגה של מינים כלשהו בפתרון. האות הנובעת ממתחם ההתייחסות _(r) באה לידי ביטוי על ידי משוואה 3 בי _{ν h} E הוא אנרגיית הפוטון באורך גל העירור, _{ν h} E = 80.5 קלוריות / mol ל355 עירור ננומטר.

1. קח את המשרעת של אות PBD ההתייחסות כהפרש בין pretrigger ואות PBD הודעה הדק כפי שמודגם באיור 3. באופן דומה, לקבוע את המשרעת של הצום _(s ^מהירה) ושלב איטי _(s ^איטית) של אות PBD המדגם.
2. לחסל את פרמטר תגובת המכשיר, K, בהיקף של המשרעת של אות PBD המדגם על ידי משרעת של אות PBD להתייחסות. היחס של אות הדגימה לאות ההתייחסות נותן משוואה 4 ויכול להיות כפי שנכתב:
   
   
3. שימוש במשוואה זו, לקבוע את החום המשתחרר לפתרון (Q) והשינוי בנפח nonthermal _(nonth ΔV) הקשורים לתגובה ביוזמת תמונה מהמדרון וליירט, בהתאמה, של חלקה _[(s / _R) E _{ν h]} טווח לעומת [טווח תלוי טמפרטורה (dn / dt) (1/ρCp)].
4. כדי לקבוע את עוצמת תגובה ושינוי באנתלפיה למהירה ותהליך האיטי, קנה מידה של הנפח שנצפה ושינוי באנתלפיה לתשואת הקוונטים המתאים בהתאם למשוואות 5-7.
   
   
   
   
   
   לתהליך רב שלבי עם קינטיקה המתרחשת בזמן בקנה המידה בין 10 μsec ~ 200 אלפיות שני, ניתן לקבוע את עוצמת הקול ושינויי אנתלפיה הקשורים לשלביה השונים של התגובה. אמפליטודות והגלגולים לצעדים הבודדים מנותחים על ידי התאמת הנתונים לפונקצית F (t) שמתאר את הפרופיל של הנפח ושינויי אנתלפיה הזמן.
   
   שבו α ₀ מתאים _לים ^מהיר וα _i מתאימה _לים ^איטי לכל תהליך אישי וτ _אני נמצא בחיים של צעדי תגובה הבודדים. מטמפרטורת התלות של קבוע קצב עבורr תהליכים בודדים (k _i = 1 / τ) _i הפרמטרים אנתלפיה ההפעלה ואנטרופיה ניתן בקלות לקבוע באמצעות עלילות איירינג.

Representative Results

דוגמא מייצגת של PBD עקבות לCa ^{2 +} תמונה שחרור מCa ^{2 +} DM-nitrophen מוצגת באיור 3. השלב המהיר מתאים לצילום המחשוף של Ca ^{2 +} DM-nitrophen וCa ^{2 +} שחרור, ואילו השלב האיטי משקף Ca ^{2 +} מחייבים לכלוב nonphotolysed. העלילה של המדגם משרעת PBD לשלב המהיר ואיטי בקנה מידה למשרעת של מתחם ההתייחסות כפונקציה של גורם הטמפרטורה תלוי [ρ _p C / (dn / dt)] גורם בהתאם למשוואת 4 ומדרוג את הסכום שנצפה חום שמשתחרר הפתרון ושינוי נפח nonthermal לתשואת הקוונטים לצילום דיסוציאציה DM-nitrophen (Φ = 0.18) ¹¹ פי משוואות 5-7 סיפקו את הערכים של אנתלפיית תגובה ונפח לשלב המהיר (ΔV _מהיר = - 12 ± 5 מיליליטר / mol וΔH _המהיר = -50 ± 20 קלוריות / mol) ובשלב האיטי _(איטי = 9 ± 5 מיליליטר / mol ΔV ו= -23 ± קלוריות 12 / mol _האיטי ΔH). עקבות PBD לCa ^{2 +} העמותה לתחום בטרמינל C-של עצבי חיישן סידן במורד התקינה אלמנט אנטגוניסט רגולטור (חלום) (שאריות חומצת אמינו 161-256) מוצגות באיור 4. על Ca ^{2 +} צילום דיסוציאציה, מקורבים ליגנד שפורסם תמונה לתחום בטרמינל C-של חלום עם קבוע הזמן של 1.3 ± 0.3 אלפיות שניים ב20 ° C. מהתלות בטמפרטורה של השיעור שנצפה קבועה, מכשול ההפעלה לCa ^{2 +} מחייב לתחום בטרמינל C-של חלום היה נחוש בדעתו להיות 9.2 ± 0.4 קלוריות / mol.

איור 1. תכנית תגובה לCa ^{2 +} DM-nitRohen משחררות רפרוף וCa ^{2 +} מחייב Ca ^{2 +} חיישן מצגת. סכמטי של צילום חניכה של Ca ^{2 +} מופעל על מעבר קונפורמציה בCa ^{2 +} מתמרים. צילום ומחשוף של Ca ^{2 +} DM-nitrophen מוביל לעלייה בריכוז Ca ^{2 +} ללא תשלום (פרוטוקול 1), Ca ^{2 +} עמותה לCa ² ומתמר ⁺ המעבר מבני נלווה (פרוטוקול 2). לחץ כאן לצפייה גדולה יותר תמונה.

איור 2. סטיה קרן photothermal ההגדרה. ניסויי ההגדרה למדידות סטיה קרן צילום תרמי בתצורת קוליניאריות. M ₁ ו-M 355 מייצג Nd אנרגיה גבוה: מראות YAG לייזר, L ₁ מייצג עדשה קמורה הממוקמת מול גלאי, P ₁ ו-P ₂ מייצג נקבים לעצב את המשאבה ובדיקה בקוטר אלומה, בהתאמה, וDM הוא מראה dichroic. ₁ F מייצג מסנן מסירה ארוכה 500 ננומטר. הבלעה: הסטייה Beam בשל השפעת photothermal. קרן הבדיקה שנוסעת דרך שיפוע מקדם שבירה שנוצר עקב מפל טמפרטורה במדיום היא מוסח על ידי θ זווית וזווית הסטייה נמדדת באמצעות גלאי רגישים עמדה. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. PBD נציג עקבות למשחררות רפרוף ^{2 +} DM-nitrophen Ca. עקבות PBD לשחרור Ca ^{2 +} תמונה השחרור מCa ^{2 +} DM-nitrophen (מוצג באדום) ומתחם ההתייחסות (מוצג בכחול). התנאים: 1 מ"מ DM-nitrophen ב20 חיץ HEPES מ"מ, 100 מ"מ KCl pH 7.0 ו0.8 מ"מ Ca ^{+ 2.} K ₃ [Fe (CN) _6] שימש כמתחם התייחסות. הקליטה של המדגם ב355 ננומטר מתאים לזה של מתחם ההתייחסות _(355nm = 0.4). הצפיפות האופטית של 0.4 נבחרה שכן הוא בטווח של הליניאריות של אות PBD כפונקציה של מספר אינשטיין נספג . עקבות PBD מייצגות ממוצעת של 20 עקבות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

תוכן-width = "5in" עבור: רוחב src = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50969/50969fig4.jpg" = /> "600px"
איור 4. PBD נציג עקבות למשחררות רפרוף ^{2 +} DM-nitrophen Ca בנוכחות תחום בטרמינל C-של חלום. עקבות PBD לCa ^{2 +} תמונה שחרור מCa ^{2 +} DM-nitrophen בנוכחות תחום בטרמינל C-חלבון חלום של ( מוצג באדום) ולמתחם ההתייחסות (המוצג בשחור). הבלעה: עלילת איירינג באמצעות קינטיקה התאוששה מדעיכה מעריכית לדוגמא עקבות PBD בטמפרטורות שונות. תנאי 400 DM-nitrophen מיקרומטר, 390 מיקרומטר CaCl _2, DREAM בטרמינל C-100 מיקרומטר ב20 pH חיץ HEPES מ"מ 7.4, 100 מ"מ KCl ו500 TCEP מיקרומטר ואת עקבות להתייחסות באותם תנאים. עקבות PBD להתייחסות מייצגות ממוצעת של 20 עקבות וכי למדגם הוא ממוצע של שלוש עקבות.hres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

העיקרון הפיזי מאחורי שיטות photothermal הוא שמולקולת צילום מתרגש מתפוגגת אנרגיה עודפת באמצעות הרפיה רטט למצב הקרקע, וכתוצאה מחימום תרמית של ^1,12 ממס שמסביב. לממסים, כגון מים, זה מייצר התרחבות מהירה נפח (ΔV _ה). מולקולות נרגשת מדינה עשויות גם לעבור תהליכי פוטו כי תוצאת שינויי nonthermal נפח _(nonth ΔV) בשל אג"ח מחשוף / היווצרות ו / או שינויים במבנה מולקולרי שיכול לשנות את הממדים המולקולריים של המולקולה (ים) (כלומר שינויים באן דר ואלס נפח), כמו גם לשנות את חלוקת תשלום של המולקולה (ים) וכתוצאה מכך electrostriction אפקטים. התוצאה היא התרחבות מהירה של הנפח המואר שיוצר שבירת שינוי במדד שיכול להיות נחקר על ידי מגוון של שיטות אופטיות. PBD מנצל את העובדה ששיפוע מקדם שבירה הוקם בד המדגםUE לדופק לייזר גאוס בצורה, גורם לסטייה של קרן בדיקה מופץ באמצעות המדגם כפי שמודגם באיור 2.

טכניקת הסטייה קרן צילום תרמי מאפשרת קביעת זמן נפתר שינויי אנתלפיה ונפח עבור מגוון רחב של תהליכים ביוזמת תמונה כוללים מנגנון התגובה של צילום מחשוף של מתחמי יגנד-heme ¹³ ושחרורו של מולקולה ביו מהכלוב מורכב מתחם ¹⁴ כמו גם חיטוט בחיים מדינת שלישיית fluorophore. גישה זו מציעה מספר יתרונות בהשוואה לטכניקות מסורתיות משמשות בדרך כלל כדי לעקוב אחר שינויים מבניים בBiomacromolecules, כגון ספקטרוסקופיה קליטה חולפת וקרינה. לא מהותי כרומופור / fluorophore או תיוג חלבון נוסף נדרש שכן מעברים מבניים נחקרו על ידי ניטור שינויים בנפח ו / או באנתלפיה, למרות נוכחותם של chromophore במדגם כל כךlution יש צורך ליצור אות PBD. בנוסף, פרמטרים הקינטית (קבועי קצב, אנתלפיה ההפעלה ואנטרופיה) לתהליכים המתרחשים בזמני submicrosecond, אשר לא נפתרו בהפסקת ניסויי זרימה, נגישים בקלות במדידות PBD. לאחרונה, מערכות אחרות ללא תווית זיהוי שבדיקת שינוי באינדקס שבירה או שינוי באורך גל כגון תהודה plasmon פני השטח ואינטרפרומטריה biolayer, בהתאמה, פותחו ויושמו ללמוד יגנד / חלבון ואינטראקציות חלבון / חלבון. עם זאת, בניגוד לPBD, גישות אלה כרוכים חוסר תנועה של מולקולות מטרה ביולוגיות על גבי המשטח ושינויים ביו מקרומולקולה נוספים נדרשו, אפוא, שמעלולים להפריע לתהליך שנצפה.

אימצנו כמה שינויי המכשור שלנו ההגדרה שהביאו לשחזור טוב יותר נתונים ושגיאות קטנות יותר בפרמטרים תרמודינמיים התאוששו. באופן ספציפי, את היישום שלצילום דיודה המרובעת כגלאי PBD אפשרה יישור מדויק של קרן הבדיקה בגלאי המיקום ושחזור אות ובכך טוב יותר ואילו בידוד רטט נוסף של שניהם קרן הבדיקה וגלאי PBD באמצעות דיכאו הודעות הרכבה ירד הרעש של אות PBD ו הרחיב את זמן הקשקשים נגישים במדידות PBD. ברצוננו להדגיש כי הרגישות של הניסוי תלוי בלוח זמנים של האירוע (ים) וניטור של תהליכים איטיים יותר (τ> 10 אלפיות השני) היא רגיש מאוד להתקנת המכשור ותנאי ניסוי. כמו כן, הצבת מראה dichroic מול התא המדגם מפשטת יישור קוליניאריות של קרן הבדיקה ומשאבה, הגדלת יחס S / N של אות PBD.

השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללים אימות קבועה של הליניאריות של אות PBD כפונקציה של i) גורם תלוי בטמפרטורה, [(dn / dt) / ρ _{עמ 'ג],} ii) פו לייזרwer, ו-III) ספיגת מדגם / התייחסות בגל העירור. בנוסף, שליטה מדויקת של הטמפרטורה ותנאי ניסוי זהים למדידות מדגם והתייחסות היא קריטית למדידות PBD חזקות ורכישת נתונים מוצלחת.

המגבלה העיקרית של טכניקת PBD מזכירה את הדרישה שביו מקרומולקולה למד נושאת קבוצת צילום תווית. חסרון זה ניתן להתגבר על ידי יישום של תרכובות בכלוב שונות. ואכן, ההתפתחות האחרונה של אסטרטגיות כליאה חדשות, כוללים פפטידים בכלוב, בכלוב חלבון ו-DNA בכלוב מאפשרת ליישום רחב של PBD כדי לפקח על מערכות מורכבות ותהליכים ביולוגיים הכוללים חלבון - פפטיד, חלבון - אינטראקציות חלבון כמו גם קינטיקה מהירה קשורה עם DNA מתקפל על זמן קשקשים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. האסטרטגיה שהוצגה כאן מראה בבירור כי בשילוב עם מערכת מתחם כלוב מתאימה, יכולות להיות מועסקות טכניקות PBD בקלותלאפיין המיקרו לאלפית שני מעברים מבניים הקשורים Ca ^{2 +} מחייבים לחיישני סידן, כמו גם לעקוב אחר אינטראקציות ligands קטנות עם מתמרים חלבון או קשירה של מולקולות מצע לאנזימים וכו '

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid	Life Technologies	D-6814	DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)	Sigma Adrich	0909C	HEPES buffer
Potassium ferricyanide (III)	Sigma Aldrich	702587	reference compound for PBD measurements
Sodium chromate	Sigma Aldrich	307831	reference compound for PBD measurements
He-Ne Laser Diode 5 mW 635 nm	Edmund Optics	54-179	use as a probe beam for PBD measurements
Oscilloscope,	LeCroy	Wave Surfer 42Xs	400 MHz bandwith
Nd:YAG laser	Continuum	ML II	pump beam for PBD measurements
M355; Nd:YAG laser mirror	Edmund Optics	47-324	laser mirror for 355 nm laser line
M1 and M2; Laser diode mirror	Edmund Optics	43-532	visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm
P1 and P2; Iris Diaphragm	Edmund Optics	62-649	pin hole to shape the probe and pum beams
L1; bi-convex lens	Thorlabs	LB1844	a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350-2,000 nm
DM, dichroic mirror	Thorlabs	DMLP505	a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm
F1; Edge filter	Andower	500FH90-25	a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm
Temperature-controlled cuvette holder	Quantum Northwest	FLASH 300