Submillisekunden Konformationsänderungen in Proteinen durch Photothermische Ablenkein Gelöst
Summary
Eine Anwendung der photothermischen Strahlablenkung Technik in Kombination mit einem Käfig Calciumverbindung, DM-Nitrophen zu Mikrosekunde und Millisekunde Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen mit dem Calcium-Verband zu einer neuronalen Kalziumsensor, Downstream Regulatory Element Antagonist Modulator verbunden überwachen Hier berichten wir .
Abstract
Photothermische Strahlablenkung zusammen mit photoakustischen Kalorimetrie und thermische Gitter gehört zu der Familie der photothermischen Methoden, die die Zeit-Profil Volumen und Enthalpie Veränderungen von Licht induzierten Konformationsänderungen in Proteinen auf Mikrosekunde bis zu Zeitskalen, die nicht zugänglich sind Millisekunden mit traditionellen Stop überwachen Flussinstrumenten. Da außerdem Gesamtänderungen und / oder die Enthalpie sondiert werden, diese Techniken zu Proteinen und anderen Biomakromolekülen, die einen Fluorophor oder ein Chromophor Markierung fehlen angewendet werden. Um Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen verbunden mit Ca 2 +-Bindung zu überwachen, um Kalzium Wandler, wie neuronale Calcium-Sensoren, einem Käfig Calciumverbindung, DM-Nitrophen ist auf Foto-Abzug eine schnelle (τ <20 us) Anstieg der freien Kalzium beschäftigt Konzentration und das zugehörige Volumen und Enthalpie Änderungen werden mit photothermischen Strahlablenkung Technik sondiert.
Introduction
Foto-thermischen Methoden wie photoakustische Kalorimetrie, photothermischen Strahlablenkung (PDB) und transiente Gitter verbunden mit Nanosekunden-Laseranregung stellen eine leistungsstarke Alternative zu optischen Spektroskopie für die zeitaufgelöste Untersuchungen von kurzlebigen Zwischenprodukte 1,2 vorübergehend. Im Gegensatz zu optischen Techniken, wie transiente Absorption und IR-Spektroskopie, daß der zeitliche Verlauf der Absorptionsänderungen in dem Chromophor Umgebung zu überwachen; photothermische Techniken erfassen die Zeitabhängigkeit der Wärme-/ Volumenänderungen und sind daher wertvolle Werkzeuge für die Untersuchung von Zeitverläufen von optisch "stille" Prozesse. Bisher hat photoakustische Kalorimetrie und vorübergehende Gitter erfolgreich angewendet, um Konformationsdynamik der photoinduzierten Prozesse, einschließlich zweiatomigen Liganden Migration in Globinen 3,4, Liganden-Interaktionen mit Sauerstoff-Sensor-Protein studieren FixL 5, Elektronen-und Protonentransport in Häm-Kupfer-Oxidasen 6 einnd Photosystem II sowie Foto-Isomerisierung in Rhodopsin 7 und Konformationsdynamik von Cryptochrom 8.
Die Anwendung der photothermischen Verfahren auf biologische Systeme, fehlt eine interne Chromophor und / oder Fluorophor zu erweitern wurde der PBD-Technik unter Verwendung der photoaktivierbaren Verbindung zur Photo zu einem Anstieg der Ligand / Substrat-Konzentration innerhalb von wenigen Mikrosekunden oder schneller kombiniert, je auf dem Käfig Verbindung. Dieser Ansatz ermöglicht die Überwachung von Dynamik und Energetik von strukturellen Veränderungen mit der Ligand / Substrat-Bindung an Proteine, die fehlt, ist eine interne Fluorophor oder Chromophor sind und auf Zeitskala, die nicht von kommerziellen Stop-Flow-Instrumente zugänglich sind verbunden. Hier ist ein Einsatz von PBD die Thermodynamik der Käfigverbindung, Ca 2 + DM-Nitrophen Photospaltung sowie die Kinetik der Ca 2 +-Assoziation mit dem C-terminalen Domäne des neuronalen Kalziumsensor überwachen untenStrom Regulatory Element Antagonist Modulator (DREAM) wird vorgestellt. Die Ca 2 +-Foto veröffentlicht von Ca 2 + DM-Nitrophen innerhalb von 10 Mikrosekunden und erneuten Bindungen zu einer unphotolysed Käfig mit einer Zeitkonstante von ~ 300 us. Auf der anderen Seite, in Gegenwart apoDREAM eine zusätzliche kinetische auf der Millisekunden-Zeitskala auftritt, beobachtet und reflektiert die Ligandenbindung an das Protein. Die Anwendung von PBD zu Konformationsänderungen in biologischen Systemen zu untersuchen wurde irgendwie durch den instrumentalen Schwierigkeiten beschränkt, zB beschwerliche Ausrichtung der Sonde und Pumpstrahl, eine starke und reproduzierbare PBD-Signal zu erreichen. , Eine sorgfältige Gestaltung eines Instrumentenaufbau, eine präzise Steuerung der Temperatur und eine sorgfältige Ausrichtung der Sonde und Pumpstrahl bieten jedoch eine konsistente und robuste PBD-Signal, das die Überwachung der zeitaufgelösten Volumen-und Enthalpie-Änderungen können auf eine breite Zeitskala von 10 Mikrosekunden auf etwa 200 msec. Außerdem modificErwartungen über die experimentellen Verfahren, um die Detektion von Proben-und Referenzspuren unter identischen Temperatur, Pufferzusammensetzung, optische Zelle Orientierung, Laserleistung, usw. gewährleisten die experimentellen Fehler in der gemessenen Reaktionsvolumina und Enthalpien reduziert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das physikalische Prinzip hinter photothermischen Verfahren ist, dass ein Foto-angeregten Molekül leitet überschüssige Energie über Schwingungsrelaxation in den Grundzustand, was zu einer thermischen Erwärmung des umgebenden Lösungsmittel 1,12. Für Lösungsmittel, wie Wasser, ergibt sich eine schnelle Volumenexpansion (&Dgr; V th). Excited-State-Moleküle können auch photochemische Prozesse, die in nicht-thermische Volumenänderungen (AV nonth) führen durch Bindungsspaltung …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (MCB 1021831, JM) und J. & E. Biomedical Research Program (Florida Department of Health, JM) unterstützt.
Materials
| 1-(4,5-Dimethoxy-2-Nitrophenyl)-1,2-Diaminoethane-N,N,N',N'-Tetraacetic Acid | Life Technologies | D-6814 | DM-nitrophen, cage calcium compound, keep stock solutions in dark to prevent photodissociation, |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) | Sigma Adrich | 0909C | HEPES buffer |
| Potassium ferricyanide(III) | Sigma Aldrich | 702587 | reference compound for PBD measurments |
| Sodium chromate | Sigma Aldrich | 307831 | reference compound for PBD measurments |
| He-Ne Laser Diode 5mW 635nm | Edmund Optics | 54-179 | use as a probe beam for PBD measurments |
| Oscilloscope, | LeCroy | Wave Surfer 42Xs | 400 MHz bandwith |
| Nd:YAG laser | Continuum | ML II | pump beam for PBD measurments |
| M355; Nd:YAG laser mirror | Edmund Optics | 47-324 | laser mirror for 355 nm laser line |
| M1 and M2; Laser diode mirror | Edmund Optics | 43-532 | visilbe laser flat mirror, wavelength range 300-700 nm |
| P1 and P2; Iris Diaphragm | Edmind Optics | 62-649 | pin hole to shape the probe and pum beams |
| L1; bi-convex lens | Thorlabs | LB1844 | a lens to focus the probe beam at the detector, EFL 50 mm, wavelength range 350 – 2000 nm |
| DM, dichroic mirror | Thorlab | DMLP505 | a longpass dichroic mirror with a cutoff wavelength of 505 nm |
| F1; Edge filter | Andower | 500FH90-25 | a long pass filter with a cutoff wavelength of 500 nm |
| Temperature-controlled cuvette holder | Quantum Northwest | FLASH 300 |
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