Summary
زرع صفائف نظمت من microwires للاستخدام في وحدة واحدة التسجيلات الكهربية يقدم عددا من التحديات التقنية. وصفت وسائل لأداء هذه التقنية والمعدات اللازمة. أيضا، يتم مناقشتها الاستخدام المفيد صفائف ميكروسلك المنظمة لتسجيل من المناطق الفرعية العصبية متميزة مع الانتقائية مكانية عالية.
Abstract
في التسجيلات الكهربية في الجسم الحي مستيقظا، يتصرف الحيوان توفير وسيلة قوية لفهم الإشارات العصبية على مستوى خلية واحدة. تقنية تسمح المجربون لدراسة زمنيا وإقليميا أنماط اطلاق محددة من أجل ربط امكانات العمل المسجلة مع السلوك الجارية. وعلاوة على ذلك، والتسجيلات وحدة واحدة يمكن أن تكون مجتمعة مع مجموعة كبيرة من التقنيات الأخرى من أجل إنتاج تفسيرات شاملة من وظيفة العصبية. في هذه المقالة، ونحن تصف التخدير والتحضير للميكروسلك زرع. في وقت لاحق، ونحن نعدد ما يلزم من المعدات والخطوات الجراحية بدقة لإدراج مجموعة ميكروسلك إلى بنية الهدف. أخيرا، نحن تصف بإيجاز المعدات المستخدمة لتسجيل كل من القطب الفردية في صفيف. صفائف ميكروسلك الثابتة وصفها ومناسبة تماما لزرع المزمنة والسماح للتسجيلات طولية من البيانات العصبية في أي تقريبا preparati السلوكيةعلى. نناقش تتبع مسارات الكهربائي لثلث المناصب ميكروسلك فضلا عن سبل الجمع بين زرع ميكروسلك مع تقنيات المناعى من أجل زيادة خصوصية التشريحية للنتائج المسجلة.
Introduction
التسجيلات الكهربية تسمح للعلماء لدراسة الخصائص الكهربائية للخلايا البيولوجية. في النظام العصبي المركزي، حيث تخدم نبضات كهربائية كآلية الإشارات، هذه التسجيلات ذات أهمية خاصة لفهم وظيفة العصبية 1-2. خلال تسجيلات وحدة واحدة في التصرف الحيوانات، ومسرى مكروي التي تم إدراجها في الدماغ قادر على تسجيل التغيرات في توليد الخلايا العصبية من إمكانات العمل مع مرور الوقت.
بينما العديد من التقنيات تسمح لأحد لتسجيل نشاط الدماغ، وحدة واحدة الكهربية هي واحدة من أكثر الوسائل دقة من خلال السماح القرار على مستوى الخلايا العصبية واحدة. عندما يتم المطلوب على درجة عالية من الدقة المكانية، ويمكن استخدامها لاستهداف microwires منفصلة نوى فرعية أو مجموعات من الخلايا داخل brain3. الاستفادة التسجيلات واحد وحدة أيضا من القرار الزماني يصل تسجيلات دقيقة على مستوى ميكروثانية. و، في الجسم الحي وتسجيلات أعقاب سماح سليمة التفاعلات الدائرة، مع الوسط الطبيعي من وارد وصادر التوقعات والكيميائية والتأثيرات الهرمونية الجهازية، والمعلمات الفسيولوجية. وتستمد الإشارات العصبية من المدخلات الحسية، والسلوكيات الحركية، وتجهيز المعرفية، الكيمياء العصبية / الصيدلة، أو الجمع بين بعض. وفقا لذلك، والفصل بين الحسية والحركية والمعرفية، والتأثيرات الكيميائية يتطلب تجارب مدروسة مع الحالات الطارئة والضوابط الفعالة التي قد تسمح لتقييم كل من التأثيرات المذكورة آنفا. الكل في الكل، والتسجيلات في التصرف الحيوانات تسمح المجربون لمراقبة التكامل بين مصادر متعددة للمعلومات داخل الدائرة تعمل واشتقاق نموذج أكثر شمولا وظيفة الدائرة.
يعاني واحد وحدة تسجيلات أيضا من عدد من المساوئ التي يجب أن تكون على علم أي مجرب. أولا وقبل كل شيء، يمكن أن يكون من الصعب التسجيلات لإجراء. في الواقع، خصائص اله مكبرات الصوت headstage وmicrowires مزروع التي تسمح للخصوصية المكانية والزمانية في هذه التسجيلات أيضا يجعل التسجيلات عرضة لتأثير الإشارات الكهربائية دخيلة (أي الكهربائية "الضوضاء"). وفقا لذلك، والقدرة على استكشاف مشكلات في نظام الكهربية يستلزم فهم التقنية متطورة من المبادئ الكهربية والأجهزة. من المهم أيضا أن نلاحظ أنه في ظل ظروف معينة، الإشارات الكهربائية المسجلة في التسجيلات خارج الخلية يمكن أن تمثل الجمع للإشارات العصبية متعددة. وعلاوة على ذلك، وتعميم النشاط وحدة واحدة إلى النشاط السكاني ضمن المنطقة المستهدفة في كثير من الأحيان يمكن أن تقتصر من قبل على درجة من التجانس الخلوية داخل المنطقة المستهدفة (ولكن انظر كاردان 4). على سبيل المثال، قد يكون متحيزا نحو أقطاب تسجيل الخلايا العصبية الناتج السعة العالية بدلا من الخلايا الأخرى. يتم زيادة تفسيرها من تسجيلات وحدة واحدةمن خلال الجمع بين التسجيلات مع غيرها من التقنيات بما في ذلك، ولكن ليس على سبيل الحصر، الكهربائية (سوي المسار أو معاكس للمسيرة) والكيميائية (مثل iontophoretic أو مصمم مستقبلات) أو optogenetic التحفيز 4، inactivations العصبية المؤقتة، والفحوص الحسية 5، إجراءات الانفصال، أو المناعية 3.
في البروتوكول الذي يلي سنقوم تعداد المواد والخطوات اللازمة لزرع مجموعة ميكروسلك نظمت في الفئران (على الرغم من أن البروتوكول يمكن تكييفها للاستخدام في الأنواع الأخرى). وقد أثبتت الإجراء وأسلوب المصفوفات الثابتة المستخدمة في المختبر لدينا موثوق بها للحصول على تسجيلات طولية ويمكن الحفاظ على تسجيلات من نفس الخلايا العصبية لأكثر من شهر واحد الساعة 6-8. هذا يجعل هذا الإجراء المثالي لدراسة الاستجابات للمؤثرات طوري التجريبية، والتغييرات في الاستجابات العصبية البلاستيك أو آليات التعلم والتحفيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يجب أن تؤخذ بعناية فائقة للحفاظ على ظروف معقمة (كما هو موضح في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية 9)، في حين تستعد لوإجراء الإجراء التالي. بروتوكول التالية هي في الامتثال للدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام المؤسسية، جامعة روتجرز. وتشير التقديرات إلى أن الإجراءات اللاحقة سوف يتطلب 3-6 ساعة لإكمال.
زرع صفيف الميكروسلك:
- المكان حيوانات تحت التخدير باستخدام 50 ملغم / كغم بنتوباربيتال الصوديوم (IP) وإدارة 10 ملغ / كغ من نترات الأتروبين الميثيل (IP؛ غليكوبيرولات قد تكون بديلا) و 0.25 ملغ البنسلين (300،000 U / مل ايم) للحفاظ على وظيفة الجهاز التنفسي ومنع العدوى ، على التوالي.
ملاحظة: مع طول 3-6 ساعة من هذه الجراحة زرع، يتم استخدام بنتوباربيتال الصوديوم لأنها فعالة من حيث التكلفة ويحد من تعرض الإنسان للالتخدير (كما قد يحدث مع الاستعمال لفترة طويلة من التخدير الغاز)، في حين لا يزال توفير التخدير طويلة الأمد. استبدال التخدير أخرى غير مقبولة. - تحقق من أن التخدير قد اتخذت باستخدام اختبار تأثير ذيل قرصة قبل المتابعة.
- عند الضرورة، وإعطاء الحقن بالتناوب من هيدروكلوريد الكيتامين (60 ملغ / كغ IP) وبنتوباربيتال الصوديوم (5-10 ملغم / كغم IP) للحفاظ على التخدير في جميع أنحاء الجراحة.
- يحلق فروة الرأس باستخدام مشرط شفرة # 22.
- تطهير فروة الرأس حلق مع بوفيدون اليود.
- إعطاء الحقن تحت الجلد من بوبيفاكايين (~ 1 ملغ كجم SC انتشار / على مواقع الحقن 4) لتخدير محليا فروة الرأس. تسمح 5-10 دقيقة لمخدر موضعي حتى تصبح نافذة المفعول.
- وضع مواد التشحيم العيون في العيون للحفاظ على رطوبة أثناء التخدير.
- تأمين الحيوان في الحانات الأذن والأنف المشبك من جهاز التجسيمي.
- استخدام المعالم البصرية (مثل شريط أفقي على ستيرالإطار eotaxic) إلى ما يقرب من مستوى رأس الحيوان. وتهدف هذه الخطوة فقط إلى ما يقرب من مستوى الجمجمة.
- إجراء شق على طول خط الوسط من فروة الرأس باستخدام مشرط رقم 11 شفرة تركيبه على حامل مشرط. شق يجب أن تمتد من خلف الأذنين إلى الجزء الخلفي من عظم الأنف.
- باستخدام ملعقة تشريح، مسح الجمجمة من جميع الأنسجة المتبقية حتى تم التوصل إلى كل من التلال الجمجمة الجانبي والخلفي الجمجمة التلال.
- سحب الجلد حول الجرح باستخدام عدد من المرقأة (6X).
- تنظيف الجمجمة من أي دم واتركه حتى يجف. في حالة حدوث أي نزيف المتبقية، إنهاء نزيف المتبقية مع أداة الكي الصغيرة. ضمان أن الجمجمة لا يزال نظيف وجاف يسمح الاكريليك الأسنان المستخدمة في الخطوات اللاحقة لربط الجمجمة بشكل دائم.
- علامة bregma وامدا (الشكل 2D) من خلال التحريف تقاطع الغرز الجمجمة. وهيئة التصنيع العسكري تشريحroscope ضروري للاحتفال بدقة هذه المواقف.
- إرفاق البند مدببة صغيرة (مثل دبوس أو مثقاب الأسنان) إلى ذراع التجسيمي وخفضه لتحديد ظهري / بطني (DV) تنسيق من bregma وامدا.
- ضبط المشبك الأنف حتى ينسق DV لbregma وامدا ضمن 100 ميكرومتر (0.1 ملم) من بعضهما البعض.
- مرة واحدة وتعادل، سجل الأمامي / الخلفي (AP)، وسطي / الوحشي (ML) وينسق DV من bregma جنبا إلى جنب مع موقف المشبك الأنف. مضاعفة التحقق من الإحداثيات للتأكد من دقتها، والباقي من الجراحة يعتمد على دقة هذه الإحداثيات.
- استخدام الإحداثيات قياس لحساب ML وينسق AP للالأركان الأربعة لل"نافذة الجمجمة" نسبة إلى bregma (أي حج القحف؛ الشكل 1). نافذة الجمجمة عبارة عن مستطيل وضعه على وجه التحديد من خلالها مجموعة ميكروسلك سوف تمر.
- استخدام الإحداثيات المحسوبة للاحتفالإحداثيات الجمجمة نافذة على الجمجمة باستخدام مرفق التجسيمي وأشار الحبر وقلم حبر. للحصول على علامات دقيقة، لا تنطبق إلا على كمية صغيرة من الحبر إلى غيض من أداة الوسم باستخدام قضيب من القطن.
- حفر خارج النافذة الجمجمة عن طريق إزالة العظام في سلسلة من طبقات صغيرة.
- تبدأ من خلال حفر زوايا ملحوظ من النافذة حيث وضعت علامات.
- المقبل، وربط الزوايا والخطوط العريضة للإطار.
- أخيرا، واضحة للخروج من منطقة داخل المخطط وصولا الى عمق الأم الجافية. يجب أن يكون الثقب أوسع (أي مشطوف) تحت الطبقات السطحية من الجمجمة لضمان أن يحافظ على نافذة لعرض المناسب من أعلى إلى أسفل.
- استخدام microforceps لإزالة أي رقائق العظام المتبقية، والحطام، أو الأم الجافية بعناية داخل نافذة الجمجمة. هذه الخطوة مهمة للغاية، وهذه القطع من المواد يمكن أن تعرض للخطر سلامة مجموعة خلال خفض. مرة واحدة تطهيرها، لا بد من الحفاظ على اله النافذة رطبة مع المياه المالحة للجراثيم للفترة المتبقية من عملية جراحية.
- وضع علامات على الجمجمة لمدة 5 مسامير الجمجمة و1 سلك الأرض (الشكل 1). سوف تختلف هذه المواقف تبعا للمنطقة في الدماغ المستهدفة. سوف headstage يكون الأكثر أمانا إذا ما وضعت المسمار واحدة على كل من عظام الجمجمة 5. وضع كل من المسامير الجمجمة وسلك الأرض في المواقع التي لن تتداخل مع وضع مجموعة ميكروسلك.
- حفر ثقوب للمسامير الجمجمة وتأمين مسامير في المكان. يجب خفض مسامير حتى المواضيع فقط 3-4 تظهر (أو، في حالة استخدام مسامير غير تلك الموصى بها، عميقة بما يكفي لاجتياز سمك الجمجمة لتعزيز الاستقرار مجموعة لكن ليست عميقة جدا وذلك لتلف القشرة). تنظيف المواضيع من مسامير بعد التنسيب.
- حفر حفرة لسلك الأرض. خفض السلك ببطء (أكثر من 1-2 دقيقة) إلى DV هدف تنسيق وإصلاح الأسلاك في مكانها باستخدام الاكريليك الأسنان.
- إضافة الاكريليك حول المواضيعمن مسامير الجمجمة. قبل أن يجف الاكريليك، وإزالة أي فائض الأسمنت الذي يتدفق بعيدا عن سلك الأرض أو مسامير الجمجمة. سماح 15 دقيقة لالاكريليك الأسنان لتجف / تتصلب.
- إرفاق الصفيف إلى الذراع التجسيمي. مستوى مجموعة وتوجيهه بحيث سيمر مباشرة من خلال حدود إطار الجمجمة.
- وضع المالحة في إطار الجمجمة بحيث يكون مستوى الجمجمة. خفض مجموعة حتى أنه يخلق الدمل في المياه المالحة. هذا التنسيق يتم استخدام مستوى الجمجمة للمجموعة. استخدام هذه القيمة لحساب DV تنسيق النهائية للمجموعة.
- خفض مجموعة ببطء حتى يصل DV النهائية تنسيق. وقف كل 1MM خفض وانتظر عدة دقائق من أجل السماح للأنسجة المخ للتعافي من التنقير وحل الجزء السفلي من البولي ايثيلين جلايكول (PEG) على مجموعة (PEG يستخدم للحفاظ مؤقتا الأسلاك في التشكل في حين خفض ، ويذوب ببطء في المياه المالحة).
- عندما الصفيف هو 1MMبعيدا عن الهدف، خفضه أكثر ببطء حتى يتم الوصول إلى الهدف النهائي. تخفيض في 0.1-0.2 ملم في وقت قبل السماح للأنسجة للراحة لمدة 5 دقائق يهدف إلى الحفاظ على الأنسجة في موقع الهدف وكذلك اتصالات متشابك الداني. إذا كانت المعدات المتاحة، والدقة خفض صفيف يمكن مساعدتهم باستخدام مناور الآلية.
- حل PEG المتبقية واستخدام الاكريليك الأسنان لتدعيم microwires في المكان. إضافة طبقات متعددة من الاسمنت للتأكد من أن الأسلاك هي آمنة وثم السماح 15-20 دقيقة للأسمنت لتتصلب قبل المتابعة. وهذا يضمن أن الأسلاك لن تزاحم من وضع النهائي.
- بناء ما تبقى من headstage الحيوان باستخدام الاكريليك الأسنان. استخدام الاكريليك ليغلف المسامير الجمجمة، الأسلاك الأرضية، وموصل للmicrowires. السماح للقبعة الاكريليك الى التشدد بما فيه الكفاية قبل الشروع.
- خياطة شق فروة الرأس باستخدام الخيوط الجراحية القابلة للامتصاص وإدارة 2 مل سو المالحة للجراثيم (الشوري) لاستعادة الترطيب من الجراحة.
- إزالة الحيوان من القضبان الأذن ووضع الموضوع في منطقة نظيفة. مراقبة الحيوان في كثير من الأحيان خلال الانتعاش بعد العملية حتى تعافى الحراري والحركة. بعد التعافي من التخدير، ونقل الحيوانات في السكن واحد للفترة المتبقية من الانتعاش بعد الجراحة.
- إعطاء الحيوانات الرصد اليومي بعد العملية الجراحية والرعاية في الأيام التالية الإجراء. الشفاء من هذا الإجراء هو الأمثل عندما يسمح سبعة أيام أو أكثر.
- إعطاء الحيوانات حقن كاربروفين (5mg/kg) وانروفلوكساسين (5-10 ملغ / كلغ) أو ما يعادلها خلال الانتعاش في الجدول الزمني الموصى بها من قبل الطبيب البيطري الحضور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويمكن الاطلاع على قائمة المعدات التي تستخدمها هذه المختبرات لتسجيل الإشارات الكهربية في الجدول 3. بعد الشفاء من الجراحة، وتسجل وحدات واحد عن طريق توصيل وحدة مكسب headstage في موصل مزروع. يتم توصيل هذا headstage عن طريق كابل إلى العاكس، وهو قادر على دوران حر دون فواصل في تسجيل الكهربية من خلال استخدام حلقات الانزلاق الكهربائية. العاكس يسمح الموضوعات التي تتحرك بحرية في حين تم تسجيل خلال السلوك، التي تعد واحدة من مزايا مبدأ هذا المستحضر. ثم يتم تغذية الإشارات من خلال المضخم (10X مكسب) التي يتم استخدامها لتضخيم إشارة تفاضلي على كل قطب كهربائي ضد الضوضاء المحيطة على القطب اختيارها لأنه لا يحمل إشارة وحدة. وتستخدم تسجيلات الفرق لتضخيم الفرق بين اثنين من لحظية الفولتية. لأن كلا من أسلاك تسجيل الضوضاء المحيطة بالتساوي تقريبا، opposi بهمأقطاب الشركة المصرية للاتصالات بشكل فعال تمكين الطرح من الضوضاء المحيطة من التسجيلات العصبية (الشكل 2). أخيرا، وإشارات هي الفرقة تمرير تصفيتها (450 هرتز إلى 10 كيلو هرتز؛ لفة قبالة -1.5 ديسيبل / اوكتاف في 1 كيلو هرتز و-6 ديسيبل / اوكتاف في 11 كيلو هرتز) و700X تضخيم قبل رقمية باستخدام جهاز كمبيوتر مع بطاقة A / D (50 كيلو هرتز تردد أخذ العينات / الأسلاك) وتخزينها لتحليل غير متصل.
في مجال البرمجيات، وغالبا ما يتم أخذ عينات الطول الموجي باستخدام طريقة الكشف العتبة. وبالتالي، وإشارات التي تمر عتبة الجهد المعطاة هي رقمية وتخزينها. ومع ذلك، هناك معدل المتأصلة-المغلوطة، التي التحف الكهربائية تمر عبر عتبة، والترشيح والفرق التضخيم، ويتم أخذ عينات. يتم طرح هذه الموجات غير العصبية بعد مخصصة باستخدام البرمجيات التي تسمح الفرز ارتفاع التصريف عينات ليتم فرزها على أساس المعلمات الخاصة بهم (مثل السعة، الذروة وادي الفولتية، الخ.) وبعد ذلك يسمح للقضاء على شectrical "الضوضاء" واختيار للإشارة العصبية (الشكل 3). يتم تضمين الطول الموجي للتحليل إذا 1) الطول الموجي الحالية مع أنماط الكنسي من النشاط العصبي بما في ذلك إمكانات العمل محددة بوضوح وبعد فرط الاستقطاب (الشكل 3؛ اللوحة اليمنى)، 2) السعة المفترضة من المعروضات الموجي العصبية على الأقل إشارة 02:01 : نسبة الضوضاء (أي هو واضح للانفصال من الفرقة الضوضاء القناة؛ اتساع نطاق الضوضاء = تقريبا .. 50 μV)؛ 3) معلمات تظل مستقرة طوال الدورة بأكملها و 4) فاصل interspike (ISI) ويبين الرسم البياني أن أي تصريف حدث خلال فترة الحرارية الطبيعية الخلايا العصبية (أي ~ 2 ميللي ثانية؛ الشكل 3 ترك وحة).
ومن ثم يمكن تصريف العصبية المترابطة مع الأحداث السلوكية (مثل ذراع الاستجابة) التي يتم تسجيلها كما الطوابع الزمنية عن طريق استخدام المدخلات والمخرجات الرقمية (I / O) بطاقة. هذه المرةالطوابع يمكن استخدامها لإنشاء رسوم بيانية الوقت شبه الحدث (PETHs؛ الشكل 4A)، والتي تستخدم لعرض عمليات التصريف العصبية التي تحدث في نطاق زمني محدد حول الحدث السلوكية معينة. درست مختبرنا عادة اطلاق العصبية بناء على أمر من ساعة (تونيك 10)، دقيقة (بطيئة طوري 11)، وثانية / ميلي ثانية (السريع لطوري 12). وعادة ما تستخدم اطلاق منشط للنظر في معظم الأحداث العالمية في الدورة. على سبيل المثال، ونحن غالبا ما تستخدم هذه لمقارنة معدلات إطلاق الخلايا العصبية عند الحيوانات هي ذات الإدارة الذاتية المخدرات، أي predrug مقابل معدلات إطلاق النار على المخدرات. وغالبا ما تستخدم التحليلات طوري بطيئة لدراسة اطلاق النار خلال تغيير بطيء الأحداث مثل تسوس الدوائية للدواء أكثر من دقيقة. أخيرا، تستخدم التحليلات طوري السريع للأحداث أكثر حظية مثل استجابة فعال أو بداية حالة جديلة التجريبية.
ويبين الشكل 4 رسم بياني لاطلاق النار منشطمع عدد من التصريف في 30 صناديق الثانية عبر جلسة تسجيل كامل خلال الكوكايين الإدارة الذاتية. الخلية المثال المعروض هو حساسية للتغيرات في مستويات الجسم من الكوكايين ويصبح الكبت (الشكل 4A) عن مستوى جسم الحيوان من الزيادات الكوكايين (الشكل 4B)، ولكن العودة إلى معدل اطلاق الأصلي كمستوى من الكوكايين يسقط بعد تقرير المصير، قد انتهت الطوارئ الإدارة. اعتمادا على المنطقة المستهدفة، قد تكون الخلايا العصبية الحساسة للتأثيرات الدوائية، أو أي عدد من الأحداث السلوكية بما في ذلك المرتبطة مكافأة العظة 6، الحسية إدخال 13، أو نهج دوافع 3.
في ظل الظروف الصحيحة، فمن الممكن أن يسجل نفس الخلايا العصبية لعدة دورات. في المخطط، يتم توزيع متجانس الخلايا العصبية (80٪ من الأسلاك تسفر سوى وحدة واحدة والخلايا ليست الطبقات أو تجميعها بإحكام) وتنتج إشارات صغيرة نسبيا والتي اوفه الاضمحلال بسرعةص المسافة. في ظل هذه الظروف، كان لدينا مختبر قادرة على تسجيل نفس الخلايا العصبية في الجسم المخطط لأسابيع عدة. الأهم من ذلك، لا يمكن التحقق من كل الخلايا العصبية عبر جلسات ويتم الاحتفاظ ليس كل الخلايا العصبية مع مرور الوقت. تحديد قدرة الفرد على الحصول على هذه الأنواع من التسجيلات طولية يتطلب اختبار دقيق للنظام الكهربية. على سبيل المثال، فمن الممكن لتقدير المسافة تسجيل microwires باستخدام أقطاب كهربائية قابلة للقيادة. عند النظر إلى جانب الخصائص الفيزيائية للأسلاك، وعلم التشريح الإقليمية، والمعلمات الموجي من الخلايا العصبية عبر جلسات، يمكن للمرء تحديد بدرجة معقولة من الثقة أن الموجي وقد تم الحفاظ عبر جلسات 7،8،13.
الشكل 1. Representatإيف مواضع ل"نافذة الجمجمة" (أي حج القحف)، ومسامير الجمجمة، والأسلاك الأرضية. A) وجهة نظر الظهرية من الجمجمة تبين وضع المسمار في الجمجمة على كل لوحة من الجمجمة (الحمراء)، نافذة الجمجمة (مربع)، وثقب المقابل للسلك الأرض (الأخضر). عند التخطيط نافذة الجمجمة، ينبغي تحديد إحداثيات عن طريق تحديد B) الأمامي وC) وسطي الخلفي والجانبي الإحداثيات للمنطقة المستهدفة (مثل ظهراني المخطط). D) هذه الإحداثيات ومن ثم يمكن استخدامها لتحديد موضع النافذة على السطح الظهري للجمجمة. لاحظ أن نافذة الجمجمة يتوافق مع أهداف الإنسي والجانبية المحددة في B و C ويمتد النطاق المحدد في الطائرة الأمامي الخلفي بين B و C أيضا. وسوف تكون هذه الإحداثيات الخاصة بكل منطقة المستهدفة الفردية. المحلى ممثلوترد ستعقد من microwires في 2 × 8 مجموعة باستخدام النقاط الصغيرة ضمن إطار الجمجمة هو مبين في D. سوف ظهري بطني النهائية تنسيق من الأسلاك تعتمد على العمق الذي يتم خفض فيها. أرقام معدلة من Paxinos واتسون 14. اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.
الشكل 2. مثال على عملية التضخيم التفاضلية. يمثل أعلى لوحة إشارة العصبية قبل التفاضلية التضخيم (اشارة + الضوضاء). بعد التضخيم الفرق، الإشارات الكهربائية الغريبة التي توجد على جميع القنوات (الضوضاء؛ وحة المتوسطة) يمكن أن تطرح على نحو فعال من تسجيل وايالدقة من خلال استخدام القطب التفاضلي المحدد من أجل تحسين عزل الموجي العصبية (الإشارة؛ وحة أسفل).
الرقم 3. أحد الموجي العصبية سبيل المثال (يمين) سجلت من سلك واحد من مجموعة ميكروسلك. ويبين الرسم البياني (يسار) وعدد من إمكانات العمل في ميلي ثانية التي تسبق كل وحظ التفريغ العصبي في الدورة. يمثل كل فترة بن 1 ميلي ثانية واحدة. يوضح الرسم البياني أنه لا يوجد إمكانات العمل وقعت في الفترة صهر الطبيعية العصبون (2 ميللي ثانية).
شخصية4. مثال على الخلايا العصبية التي تحول دون tonically خلال الكوكايين الإدارة الذاتية. أ) معدل اطلاق النار (Spikes/30 ثانية) من الخلايا العصبية عبر الكوكايين دورة الإدارة الذاتية وصول طويلة في 30 صناديق الثانية. ب) المقابلة المستوى المخدرات يحسب عبر الدورة نفسها. في الجمع، وترتبط الزيادات في مستوى المخدرات مع الاكتئاب في اطلاق العصبية. وفقا لذلك، عندما تنتهي الدورة في ~ 425 دقيقة، اطلاق العصبية كما يسترد مستويات الجسم من سقوط الكوكايين.
الرقم 5. شرائح نسيجية من حيوانين مع يزرع ميكروسلك. A) وهناك قسم نيسل الملون باستخدام محايدة جنبا إلى جنب مع مكافحة فيروسيانيد البوتاسيوم وصمة عار يكشف نصائح ميكروسلك lesioned (الأزرق) الحمراء.A ميكروسلك يمكن ارجاعه من القشرة وصولا الى نصائح الأسلاك (الازرق) باتباع مسارات الأسلاك في الأنسجة. يمكن إرجاع المسارات في شريحة واحدة أو سلسلة من شرائح المجاورة. B) A القسم الملون للمادة P، الذي يكشف عن الشاحبة بطني، إلى جانب عداد فيروسيانيد البوتاسيوم وصمة عار. باستخدام تقنيات immunohistological، يمكن أن تكون مترجمة الفردية أسلاك متناهية الصغر داخل مناطق الدماغ محددة، أو حتى داخل مناطق فرعية محددة من نواة معينة. ويبين الشكل تلميح ميكروسلك (الازرق) المترجمة ضمن الشاحبة بطني باستخدام P المخدرات وصمة عار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تمثل التسجيلات خارج الخلية تقنية التجريبية القوية التي يمكن إدراجها في إعداد التجريبية تقريبا أي في علم الأعصاب. يمكن تتبع الأسلاك التي تم زرعها في صفائف منظم، كما مهاوي لهم بالمرور عبر الدماغ وإلى المنطقة المستهدفة (الشكل 5A). عندما يتم إنشاء، الآفة آخر تجريبية صغيرة في طرف ميكروسلك noninsulated لخلق وديعة صغيرة من الحديد والأسلاك الفولاذ المقاوم للصدأ، يمكن للمرء بمناسبة بالضبط موقع من طرف ميكروسلك غير معزول (حيث تم تسجيل وحدة واحدة) باستخدام محلول من 5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم و 10٪ حمض الهيدروكلوريك (أرقام 5A و 5B؛ النقاط الزرقاء). وبالتالي، يمكن للمرء بسهولة استخدام سلسلة من شرائح الدماغ لاحقة لإعادة موقف مجموعة كاملة داخل الدماغ. وأخيرا، فإن التقنيات المذكورة أعلاه يمكن الجمع بسهولة مع المناعية من أجل زيادة خصوصية المكاني للتسجيلات، من أجلللتحقق من المواضع المستهدفة، وحتى من أجل دراسة الاختلافات دون الإقليمية داخل نواة هدف واحد 3 (الشكل 5B).
لتحقيق خصوصية المكانية المطلوب، تحتاج صفائف ميكروسلك يجب أن تصمم ومزروع بعناية. أولا وقبل كل شيء، يجب أن تكون مصممة التباعد من الصفوف والأعمدة ضمن مجموعة خصيصا لمنطقة الفائدة. يمكن المصفوفات التي تكون طويلة جدا أو واسعة لتقليل دقة الهدف المنشود أو إنتاج عدد كبير من الأسلاك التي تقع على الحدود بين نواتين المجاورة. في الوقت نفسه، يمكن microwires متباعدة جدا معا بشكل وثيق تحظر ترسيم منفصلة من كل قطب كهربائي. الثانية، يجب التعامل مع صفائف ميكروسلك الرعاية من أجل الحفاظ على سلامة صفيف. ويتم إنتاج صفائف الكهربائي واحد باستخدام رقيقة، الأسلاك يشبه الشعر التي يمكن بسهولة أن تتلف أو تزاحم من التكوين الخاص بها عندما اتصلت. صفات هذه الأسلاك هي مثالية للحد من الضرر رس الأنسجة على طريق النهج لهدف واحد، وكذلك السماح للأسلاك لتحويل بالتنسيق مع الحركات الصغيرة من الدماغ. وبالتالي، فإنه من المستحسن عادة لتخزين صفائف في مكان آمن وتجنب إزالة صفائف من قضاياهم واقية حتى قبيل التوطين. أيضا، يجب توخي الحذر عند تعقيم صفائف ميكروسلك. في بعض الحالات، التعقيم من الأقطاب الكهربائية قد يكون مقبولا. ومع ذلك، قد يكون أكسيد الإيثيلين أو الأشعة فوق البنفسجية الإبراء الأفضل لحماية صفائف الهشة. أخيرا، المعدن القطب والعزل، وقطر كل منهما، وينبغي النظر بعناية. على سبيل المثال، سوف أقطاب الوحيدة التي تحتوي على الحديد (مثل الفولاذ المقاوم للصدأ) تكون قادرة على إنتاج ردود فعل الأزرق البروسي لترسيم الفردية لكل ميكروسلك في الصفيف.
في بعض الأحيان، وسوف microwires في مجموعة تبتعد عن التكوين الخاص بها خلال خفض بسبب العوائق دون أن يلاحظها أحد (مثل شظايا الجمجمة في إطار الجمجمة) أو الفقراء هكتارndling. في هذه الحالات، يمكن في كثير من الأحيان لا يزال يتم تعقب مثل هذا ميكروسلك إلى طرفها (على الرغم من أنه من المرجح أن تكون خارج المنطقة المستهدفة). يجب أن تنشأ مثيل حيث لا يمكن التحقق من أي ميكروسلك مرقمة في مجموعة، فمن المهم لسلامة التجربة أن تتم إزالة هذا الحيوان من مجموعة البيانات. سوء فهم للموقف وميكروسلك الفرد يمكن تمكين إشاراته العصبية إلى تعقيد أو تفسير الفاسدة من البيانات.
خلال زرع، ودقة من النافذة الجمجمة والمواءمة مجموعة حاسمة لاستهداف الدقة أيضا. يجب أن يتم نوافذ الجمجمة واسعة بما يكفي للسماح للمجموعة لتمرير دون الانحناء أو أسلاك الضارة. من ناحية أخرى، يتم استخدام نافذة أيضا لتوجيه بدقة مجموعة لموقف الهدف، وبالتالي يجب أن يتم حفر مع الدقة في كل البعد. عندما تصبح جاهزة للزرع، يجب على المرء أيضا أن تكون على يقين من أن مجموعة غير راسيا مع نافذة الجمجمة في جميع الأبعاد. وهذا هو،ميل طفيف للمجموعة في أي البعد يمكن أن يسبب مجموعة إما جزئيا أو يغيب نواة الهدف تماما. وأخيرا، ينبغي إيلاء عناية خاصة عندما خفض مم 1-3 أولا. فمن خلال خفض الأولية أن قطعة من الحطام التي ذهبت دون أن يلاحظها أحد ضمن إطار الجمجمة يمكن أن تعرض للخطر سلامة مجموعة وقلب مسار microwires. إذا تم عرقلة مسار microwires بينما خفضت أنهم ببطء، يمكن للمرء أن يرى microwires ينحني أو الرضوخ تحت التكبير طفيف قبل مجموعة يتكبد أي ضرر (على سبيل المثال باستخدام العدسة المكبرة). عند هذه النقطة، microwires يمكن سحب والحطام يمكن أن يتم مسح من النافذة قبل المتابعة مع زرع.
أخيرا وليس آخرا، زرع ناجحة من صفائف ميكروسلك يتطلب عناية خاصة للحفاظ على غرفة العمليات العقيم وتوفير الرعاية اللاحقة للعمليات الجراحية شامل. عندما يقترن الاحتياطات المذكورة أعلاه، ويمكن الحصول على التسجيلات قابلة للتنفيذ منالمناطق ذات الاهتمام لتصل إلى أكثر من شهر واحد، ونحن قد تحققت من التسجيلات تصل إلى 40 يوما بعد الجراحة 6. ربما الأهم من ذلك، طول العمر من هذه التسجيلات يتيح الفرصة لدراسة الدوائر وظيفية منفصلة داخل الوسط معقدة الكهربائية والكيميائية، والتأثيرات الهرمونية والإجابة على الأسئلة الحيوية حول دور هذه الدوائر في التعلم والتحفيز.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
والكتاب ليس لديهم مصالح مالية تتنافس في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل المعهد الوطني لتعاطي المخدرات يمنح DA 006886 (MOW) وDA 032270 (DJB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. List of Surgical Materials. | |||
| Gauze | Fisher (MooreBrand) | 19-898-144 | |
| Cotton Swabs | Fisher (Puritan) | S304659 | |
| Nembutal (Pentobarbital) | Sigma Aldrich | P3761 | |
| Atropine Methyl Nitrate | Sigma Aldrich | A0382 | |
| Baytril (Enrofloxacin) | Butler Shein (Bayer) | 1040007 | |
| Ketamine Hydrochloride | Butler Shein | SKU# 023061 | |
| Betadine (Povidone-Iodine) | Fisher (Perdue) | 19-066452 | |
| Stereotax | Kopf | Model 900 | |
| Cauterizing Tool | Stoelting | 59017 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ445 | |
| Dental Drill | Buffalo | 37800 | |
| Bacteriostatic Saline | Bulter Schein | 8973 | |
| Jewlers Screws | Stoelting | 51457 | |
| Microwire Array | Microprobes | Custom (Flexible) | |
| Ground Wire | Omnetics | Custom Plug | |
| Dental Acrylic | Fisher (BAS) | 50-854-402 | |
| Absorbable Sutures | Fisher (Ethicon) | NC0258473 | |
| Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) | Fisher (Henry Schein) | 008897 | |
| Table 2. List of Surgical Instruments. | |||
| 2x Microforceps | George Tiemann Co. | #160-57 | Multi-use (e.g. clearing debris in skull window) |
| 2x Forceps | George Tiemann Co. | #160-93 | Multi-use (e.g. tying sutures) |
| 6x Hemostats | George Tiemann Co. | #105-1125 | Clamp and open incision |
| 1x Small scissors | George Tiemann Co. | #105-411 | Cut sutures after tying |
| 1x Tissue forceps | George Tiemann Co. | #105-222 | Holding tissue while suturing |
| 1x Needle holder | George Tiemann Co. | #105-1259 | Holding suture needle |
| 1x Scalpel holder (with #11 blade) | George Tiemann Co. | #105-80 (w/ #105-71 blade) | Making skull incision |
| 1x #22 Scalpel blade | George Tiemann Co. | #160-381 | Shaving scalp |
| 1x Surgical Spatula | George Tiemann Co. | #160-718 | Scraping skull to clear tissue on skull |
| Machine/Jewelers Screws | Various | N/A | 0/80 x 1/8” |
| Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals. | |||
| Microwire Array & Connector | Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) | N/A (Part No. based on array characteristics) | Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc. |
| Unity-Gain Harness/Headstage | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1200 | Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals. |
| Commutator (and Optional Fluid Swivel) | Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) | SL18C | Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp |
| Pre-amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1198 | Differentially amplifies neural signals against a reference electrode. |
| Filter and Amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1199 | Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal. |
| Acquisition Computer | EnGen (Phoenix, AZ) | N/A (Custom Build) | Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition. |
| A/D Card | Data Translation (Marlboro, MA) | DT-3010 | Digitizes neural signals for computer sampling. |
| Digital I/O Card | Measurement Computing (Norton, MA) | PCI CTR-05 | Acquires behavioral inputs and outputs |
References
- Carter, M., Shieh, J. C. Electrophysiology In: Guide to research techniques in neuroscience. , Academic Press. (2009).
- Aston-Jones, G., Siggins, G. R. Electrophysiology. In: Psychopharmacology: The Fourth Generation of Progress. Kupfer, D., Bloom, F. E. , Raven Press. (1995).
- Root, D. H., et al. Differential roles of ventral pallidum subregions during cocaine self-administration behaviors. J. Comp. Neurol. 521 (3), 558-588 (2013).
- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
- Ma, S., et al. Amphetamine's dose-dependent effects on dorsolateral striatum sensorimotor neuron firing. Behav. Brain Res. , (2013).
- Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).
- Tang, C., et al. Changes in activity of the striatum during formation of a motor habit. Eur. J. Neurosci. 25 (4), 1212-1227 (2007).
- Tang, C., et al. Dose and rate-dependent effects of cocaine on striatal firing related to licking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324 (2), 701-713 (2008).
- Fabbricatore, A. T., et al. Electrophysiological evidence of mediolateral functional dichotomy in the rat accumbens during cocaine self-administration: tonic firing patterns. Eur. J. Neurosci. 30 (12), 2387-2400 (2009).
- Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66 (2), 106-127 (2012).
- Root, D. H., et al. Rapid-phasic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 64 (9), 704-713 (2010).
- Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29 (44), 12952-12961 Forthcoming.
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (1997).
