Un procedimiento para la implantación de matrices Organizados de Microhilos para grabaciones de una sola unidad en Awake, Comportarse Animales

Summary

La implantación de arreglos organizados de microhilos para su uso en una sola unidad los registros electrofisiológicos se presenta una serie de desafíos técnicos. Se describen los métodos para llevar a cabo esta técnica y el equipo necesario. Además, se discute el uso beneficioso de arrays microhilo organizados para grabar desde subregiones neuronales distintas con alta selectividad espacial.

Abstract

En vivo registros electrofisiológicos en el despierto, comportándose animales proporcionan un poderoso método para comprender la señalización neuronal a nivel de una sola célula. La técnica permite que los experimentadores para examinar temporal y regionalmente patrones de descarga específicos con el fin de correlacionar los potenciales de acción grabado con el comportamiento en curso. Además, las grabaciones de una sola unidad se pueden combinar con una plétora de otras técnicas con el fin de producir explicaciones completas de la función neural. En este artículo se describe la anestesia y la preparación para la implantación de micro-hilo. Posteriormente, enumeramos los equipos necesarios y los pasos quirúrgicos para insertar correctamente una matriz micro-hilo en una estructura de destino. Por último, se describe brevemente el equipo utilizado para grabar desde cada electrodo individual en la matriz. Las matrices Microwire fijos descritos son muy adecuadas para la implantación crónica-y permiten grabaciones longitudinales de datos neurales en casi cualquier preparati del comportamientoen. Se discute el rastreo pistas de electrodos para triangular posiciones microhilo, así como maneras de combinar la implantación de micro-hilo con técnicas inmunohistoquímicas con el fin de aumentar la especificidad anatómica de los resultados registrados.

Introduction

Los registros electrofisiológicos permiten a los científicos para examinar las propiedades eléctricas de las células biológicas. En el sistema nervioso central, donde los impulsos eléctricos sirven como un mecanismo de señalización, estas grabaciones son de particular importancia para la comprensión de la función neural ^1-2. Durante las grabaciones de una sola unidad de comportarse animales, un microelectrodo que se ha insertado en el cerebro es capaz de registrar los cambios en la generación de una neurona de potenciales de acción en el tiempo.

Mientras que muchas técnicas permiten una para registrar la actividad cerebral, de una sola unidad de electrofisiología es uno de los métodos más precisos, permitiendo la resolución a nivel de la neurona individual. Cuando se desea un alto grado de especificidad espacial, microhilos se pueden utilizar para apuntar a los sub-conjuntos de núcleos o células dentro de la Brain3 discretas. Grabaciones de una sola unidad también se benefician de una alta resolución temporal como grabaciones son exactas a nivel de microsegundos. Y, in vivo unagrabaciones vigilia permiten interacciones circuitos intactos, con el medio natural de aferentes y eferentes proyecciones, química sistémica y las influencias hormonales, y los parámetros fisiológicos. Las señales nerviosas se derivan de la entrada sensorial, comportamientos motores, el procesamiento cognitivo, la neuroquímica / farmacología, o alguna combinación. En consecuencia, la segregación de los motores, cognitivos, sensoriales y químicas influencias requiere experimentos bien diseñados con riesgos y controles efectivos que permitan la evaluación de cada una de las influencias mencionadas. Con todo, las grabaciones en comportarse animales permiten experimentadores para observar la integración de múltiples fuentes de información dentro de un circuito de funcionamiento y para derivar un modelo más completo de la función del circuito.

Grabaciones de una sola unidad también sufren de un número de desventajas de las cuales cualquier experimentador debe ser consciente. En primer lugar, las grabaciones pueden ser difíciles de llevar a cabo. De hecho, las propiedades de thamplificadores headstage e y los microhilos implantados que permiten la especificidad espacial y temporal en estas grabaciones también hace grabaciones susceptibles a la influencia de las señales eléctricas extraños (es decir, "de ruido" eléctrica). En consecuencia, la capacidad de solucionar problemas en un sistema electrofisiológico requiere una comprensión técnica bien desarrollada de principios y aparatos electrofisiológicos. También es importante tener en cuenta que, bajo ciertas circunstancias, las señales eléctricas registradas en grabaciones extracelulares pueden representar la suma de múltiples señales neuronales. Además, la generalización de la actividad de una sola unidad de actividad de la población dentro de una región objetivo a menudo puede ser limitado por el grado de heterogeneidad celular dentro de la región de destino (pero ver Cardin ^4). Por ejemplo, los electrodos pueden estar sesgados hacia la grabación de las neuronas de salida de alta amplitud en lugar de otras células. La interpretación de las grabaciones de una sola unidad se incrementamediante la combinación de grabaciones con otras técnicas, incluyendo, pero no limitado a, eléctrica (ortodrómica o antidrómica), estimulación química (por ejemplo, iontoforética o receptor de diseñador) o optogenético ^4, inactivaciones neuronales temporales, exámenes sensoriomotoras ^5, procedimientos de desconexión, o inmunohistoquímica ^3.

En el protocolo que sigue vamos a enumerar los materiales y los pasos necesarios para implantar una matriz microhilo organizada en la rata (aunque el protocolo puede ser adaptado para su uso en otras especies). El procedimiento y el estilo de arreglos fijos utilizados en nuestro laboratorio han demostrado ser fiable para grabaciones longitudinal y pueden sostener grabaciones de la misma neurona durante más tiempo con un mes de ^6-8. Esto hace que este procedimiento ideal para examinar las respuestas fásicas a los estímulos experimentales, cambios plásticos en las respuestas neuronales o mecanismos de aprendizaje y motivación.

Protocol

El mayor cuidado se debe tomar para mantener las condiciones de asepsia (como se describe en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio ^9), mientras que la preparación y la realización del procedimiento siguiente. El siguiente protocolo se encuentra en cumplimiento de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, y ha sido aprobado por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional de la Universidad de Rutgers. Se estima que los procedimientos subsiguientes requerirán 3-6 horas para completar.

La implantación de la matriz Microwire:

1. Coloque los animales bajo anestesia utilizando 50 mg / kg de pentobarbital de sodio (IP) y administrar 10 mg / kg de nitrato de atropina de metilo (IP; glicopirrolato puede estar sustituido) y 0,25 mg de penicilina (300.000 U / ml IM) para mantener la función respiratoria y prevenir la infección , respectivamente.
   Nota: Con la longitud 06.03 horas de esta cirugía de implantación, pentobarbital de sodio se utiliza, ya que es rentable y limita la exposición humana aanestésicos (como podría ocurrir con el uso prolongado de los anestésicos de gas) sin dejar de ofrecer la anestesia de larga duración. La sustitución de otros anestésicos es aceptable.
2. Verifique que la anestesia ha hecho efecto mediante la prueba de presión de la cola antes de proceder.
3. Según sea necesario, dar alterna inyecciones de clorhidrato de ketamina (60 mg / kg ip) y pentobarbital sódico (5-10 mg / kg IP) para mantener la anestesia durante la cirugía.
4. Afeitar el cuero cabelludo con una hoja de bisturí # 22.
5. Desinfectar el cuero cabelludo rapado con povidona yodada.
6. Dar inyecciones subcutáneas de bupivacaína (~ 1 mg / kg SC, repartidas en 4 puntos de inyección) para anestesiar localmente el cuero cabelludo. Permitir 5-10 minutos para que el anestésico local para entrar en vigor.
7. Coloque un lubricante oftálmico sobre los ojos para mantener la humedad durante la anestesia.
8. Asegure el animal en las barras de oído y pinza nariz de un aparato estereotáxico.
9. Use puntos de referencia visuales (por ejemplo, una barra horizontal en la stermarco eotaxic) para nivelar aproximadamente la cabeza del animal. Este paso sólo es para aproximadamente a nivel del cráneo.
10. Hacer una incisión a lo largo de la línea media del cuero cabelludo usando un hoja de bisturí # 11 montado en un soporte de escalpelo. La incisión debe extenderse desde justo detrás de las orejas a la parte posterior del hueso nasal.
11. Usando una espátula de disección, desactive el cráneo de todo el tejido restante hasta que se hayan alcanzado los dos cantos laterales del cráneo y el cráneo cresta posterior.
12. Tire hacia atrás de la piel alrededor de la incisión utilizando una serie de pinzas hemostáticas (6x).
13. Limpie el cráneo de sangre y deje que se seque. Si se produce un sangrado restante, terminar el sangrado residual con una pequeña herramienta de cauterización. Asegurar que el cráneo se mantiene limpio y seco permite que el acrílico dental utilizado en las etapas posteriores para unirse al cráneo de forma permanente.
14. Marcar bregma y lambda (Figura 2D) mediante la interpolación de la intersección de las suturas del cráneo. Un micrófono de disecciónroscope es necesario marcar con exactitud estas posiciones.
15. Coloque un pequeño objeto puntiagudo (por ejemplo, un alfiler o broca dental) a un brazo estereotáxica y bajarla para determinar el dorsal / ventral (DV) de coordenadas de bregma y lambda.
16. Ajustar la pinza de nariz hasta que el DV coordenadas de bregma y lambda se encuentran dentro de 100 micras (0,1 mm) de cada otra.
17. Una vez estabilizado, registre la anterior / posterior (AP), medial / lateral (ML) y DV Coordenadas bregma junto con la posición de la pinza de nariz. Doble Vea las coordenadas de precisión, como el resto de la cirugía depende de la precisión de estas coordenadas.
18. Utilice las coordenadas medidas para calcular el ML y AP coordenadas de las cuatro esquinas de la "ventana de cráneo" en relación a bregma (es decir, la craneotomía, Figura 1). La ventana de cráneo es un rectángulo situado precisamente a través del cual pasará la matriz micro-hilo.
19. Utilice las coordenadas calculadas para marcar elventana cráneo coordina en el cráneo usando un accesorio estereotáxica en punta y la tinta de la pluma estilográfica. Para obtener marcas precisas, aplicar sólo una pequeña cantidad de tinta a la punta de la herramienta de marcado usando un aplicador de algodón.
20. Taladrar la ventana cráneo mediante la eliminación de la médula en una serie de pequeñas capas.
    1. Comience por la perforación de los marcados esquinas de la ventana donde se han colocado las marcas.
    2. A continuación, conecte las esquinas y delinear la ventana.
    3. Finalmente, limpiar el área dentro de la línea abajo a la profundidad de la duramadre. El orificio debe ser más ancha (es decir, biselado) por debajo de las capas superficiales del cráneo para asegurarse de que la ventana mantiene una anchura apropiada de arriba a abajo.
21. Utilice microforceps para quitar cuidadosamente las virutas cualquier hueso restante, escombros, o duramadre dentro de la ventana de cráneo. Este paso es muy importante, ya que estos trozos de material pueden comprometer la integridad de la matriz durante el descenso. Una vez aprobado, se debe tener the ventana húmeda con solución salina bacteriostática para el resto de la cirugía.
22. Coloque las marcas en el cráneo durante 5 tornillos de cráneo y 1 cable de tierra (Figura 1). Estas posiciones pueden variar dependiendo de la región del cerebro específica. El headstage será más segura si un tornillo se coloca en cada uno de los 5 huesos del cráneo. Coloque los dos tornillos de cráneo y el cable de tierra en lugares que no interfieran con la colocación de matriz micro-hilo.
23. Perforar agujeros para los tornillos del cráneo y asegurar los tornillos en su lugar. Los tornillos deben reducirse hasta sólo 3-4 hilos están mostrando (o, si se utiliza tornillos que no sean los recomendados, lo suficientemente profundo como para atravesar el grosor del cráneo para promover la estabilidad matriz, pero no muy profundo con el fin de dañar la corteza). Limpie las roscas de los tornillos después de la colocación.
24. Haga un agujero para el cable de tierra. Baje el hilo lentamente (durante 1-2 minutos) a la toma DV objetivo coordinar y fijar el cable en su lugar usando el acrílico dental.
25. Añadir acrílico alrededor de las roscasde los tornillos del cráneo. Antes de que se seque el acrílico, eliminar el exceso de cemento que fluye lejos del cable de tierra o los tornillos del cráneo. Permita 15 minutos para el acrílico dental para secar / endurecen.
26. Fije el conjunto al brazo estereotáxica. Nivel la matriz y orientarla de modo que será en ángulo recto pasar a través de los límites de la ventana de cráneo.
27. Coloque la solución salina en la ventana del cráneo para que esté al nivel del cráneo. Baje la matriz hasta que se crea un hoyuelo en la solución salina. Esta cota se utiliza como nivel de cráneo para la matriz. Utilice este valor para calcular el DV última coordenada de la matriz.
28. Baje el conjunto lentamente hasta que alcanza su DV cota final. Parar cada 1 mm de bajada y esperar varios minutos con el fin de permitir que el tejido cerebral se recupere de formación de hoyuelos y para disolver la parte inferior del glicol de polietileno (PEG) en la matriz (PEG se utiliza para mantener temporalmente los cables en su conformación al tiempo que reduce , y se disuelve lentamente en solución salina).
29. Cuando la matriz es de 1 mmlejos de la meta, lo baja más lentamente hasta que se alcance el objetivo final. La reducción en 0,1 hasta 0,2 mm a la vez antes de permitir que el tejido para descansar por un período de 5 min se destina a preservar el tejido en el lugar de destino, así como las conexiones sinápticas proximales. Si el equipo está disponible, precisión descenso de la matriz puede ser asistido mediante un manipulador motorizado.
30. Disolver el resto PEG y utilizar acrílico dental para cimentar los microhilos en su lugar. Añadir múltiples capas de cemento para asegurar que los cables son seguras y luego permitir 15-20 minutos para que el cemento se endurece antes de continuar. Esto asegura que los cables no se empujaban de su colocación final.
31. Construir el resto de headstage del animal usando el acrílico dental. Utilice el acrílico para envolver los tornillos cráneo, cable de tierra, y un conector para los microhilos. Deje que el sombrero de acrílico se endurezca lo suficiente antes de continuar.
32. La sutura de la incisión del cuero cabelludo usando suturas absorbibles y administrar 2 ml of salina bacteriostática (sc) para restaurar la hidratación de la cirugía.
33. Retire el animal de los bares del oído y coloque el objeto en un lugar limpio. Observar el animal con frecuencia durante la recuperación post-operatoria hasta la termorregulación y la locomoción se han recuperado. Después de la recuperación de la anestesia, mover al animal en el alojamiento individual por el resto de la recuperación post-quirúrgica.
34. Ofrecer a los animales monitoreo postoperatorio diaria y el cuidado en los días posteriores al procedimiento. La recuperación de este procedimiento es óptimo cuando siete o más días son permitidos.
35. Ofrecer a los animales inyecciones de Carprofeno (5mg/kg) y enrofloxacina (5-10 mg / kg) o sus equivalentes durante la recuperación por el programa recomendado por el veterinario a cargo.

Representative Results

Una lista de los equipos utilizados por este laboratorio para la grabación de señales electrofisiológicas se puede encontrar en la Tabla 3. Tras la recuperación de la cirugía, unidades únicas son registradas por el taponamiento de headstage de ganancia unitaria en el conector implantado. Este headstage está conectado a través de un cable a un conmutador, que es capaz de rotación libre sin roturas en el registro electrofisiológico a través del uso de anillos deslizantes eléctricos. El conmutador permite a los sujetos se muevan libremente durante la grabación durante la conducta, que es una de las ventajas principales de esta preparación. Las señales se alimentan entonces a través de un preamplificador (10x ganancia) que se utiliza para amplificar diferencialmente la señal en cada electrodo contra el ruido ambiental en un electrodo seleccionado, ya que no exhibe una señal de unidad. Grabaciones diferenciales se utilizan para amplificar la diferencia instantánea entre las dos tensiones. Debido a que ambos cables de grabar el ruido ambiente aproximadamente por igual, su oposiciónpolaridades del te permiten efectivamente la sustracción del ruido ambiente de las grabaciones de los nervios (Figura 2). Por último, las señales son de paso de banda filtrada (450 Hz a 10 kHz; rodar -1,5 dB / octava a 1 kHz y -6 dB / octava a 11 kHz) y 700x amplificada antes de ser digitalizada utilizando un ordenador con una tarjeta A / D (50 kHz de frecuencia de muestreo / alambre) y almacenados para análisis fuera de línea.

En el software, las formas de onda a menudo se muestrearon mediante un método de detección de umbral. Por lo tanto, las señales que pasan a un umbral de tensión dado son digitalizados y almacenados. Sin embargo, existe una tasa de inherente de falsos positivos, en el que los artefactos eléctricos pasan a través del umbral, el filtrado y la amplificación diferencial, y se muestrean. Estas formas de onda no neurales se restan post-hoc utilizando el software pico de clasificación que permite a las descargas de la muestra que se ordenan en función de sus parámetros (por ejemplo, la amplitud, de pico y valle tensiones, etc.) Y, posteriormente, permite la eliminación de el"ruido" ectrical y la selección de la señal neuronal (Figura 3). Las formas de onda se incluyen para el análisis de si 1) Formas de onda presentes con patrones canónicos de la actividad neuronal, incluyendo un potencial de acción claramente definido y después de hiperpolarización (Figura 3, panel derecho); 2) la amplitud de una forma de onda putativo exposiciones neuronales al menos una señal de 2:01 : ruido (es decir, es claramente separable de banda de ruido del canal, de amplitud de banda de ruido = aprox .. 50 mV), 3) Los parámetros se mantienen estables a lo largo de toda la sesión, y 4) un intervalo interspike (ISI) histograma muestra que no se han producido vertidos durante el período refractario natural de la neurona (es decir, ~ 2 ms; Figura 3 panel izquierdo).

Las descargas neuronales pueden ser correlacionados con eventos de comportamiento (por ejemplo, palanca de responder) que se registran como marcas de tiempo a través del uso de una entrada-salida digital (E / S) de la tarjeta. Estos tiempos-sellos se pueden utilizar para crear histogramas de tiempo peri-evento (PETHs; Figura 4A), que se utilizan para mostrar las descargas neuronales que se producen en un intervalo de tiempo especificado en torno a un evento de comportamiento en particular. Nuestro laboratorio ha examinado típicamente actividad neuronal en el orden de horas (tónicos), ¹⁰ minutos (Slow-fásicos ¹¹⁾ y segundos / milisegundos (Rapid-fásica ^12). Despido Tonic se utiliza normalmente para examinar los acontecimientos más globales en una sesión. Por ejemplo, a menudo utilizamos esto para comparar las tasas de disparo de las neuronas cuando los animales son auto-administración de drogas, es decir, predrug frente a las tasas de disparo en las drogas. Análisis fásicas lenta se utilizan a menudo para examinar la cocción lenta durante la evolución de los acontecimientos, como la decadencia farmacológica de un fármaco durante minutos. Finalmente, los análisis fásicos rápidos se utilizan para los eventos más instantáneos como una respuesta operante o la aparición de una señal experimental.

La figura 4 muestra un histograma de cocción tónicocon un recuento de los vertidos en contenedores de 30 segundos a través de una sesión de grabación durante toda la autoadministración de cocaína. La célula de ejemplo que se muestra es sensible a los cambios en los niveles corporales de la cocaína y se convierte en inhibida (Figura 4A) como el nivel del cuerpo del animal de la cocaína aumenta (Figura 4B), pero vuelve a su tasa de disparo original como el nivel de la cocaína cae después de la auto- contingencias de la administración han terminado. Dependiendo de la región diana, las neuronas pueden ser sensibles a los efectos farmacológicos, o cualquier número de eventos de comportamiento incluyendo recompensa asociada a las señales ^6, entrada sensoriomotor ^13, o enfoque motivado ^3.

En las condiciones correctas, es posible grabar la misma neurona para muchas sesiones. En el cuerpo estriado, las neuronas se distribuyen homogéneamente (80% de cables dió sólo una sola unidad y las células no son capas o bien agrupados) y producen señales relativamente pequeñas que OVE se desintegran rápidamentedistancia r. En estas condiciones, nuestro laboratorio ha sido capaz de grabar la misma neurona en el cuerpo estriado para múltiples semanas. Es importante destacar que no todas las neuronas se pueden verificar a través de sesiones y no todas las neuronas se mantienen en el tiempo. La determinación de la capacidad de uno para obtener este tipo de grabaciones longitudinales requiere de cuidadosas pruebas del sistema electrofisiológico. Por ejemplo, es posible estimar la distancia de grabación de microhilos mediante el uso de electrodos accionables. En conjunto, con las propiedades físicas de los cables, la anatomía regional, y los parámetros de forma de onda de la neurona a través de sesiones, se puede determinar con razonable certeza de que una forma de onda se ha mantenido a través de sesiones ^7,8,13.

Figura 1. Representative colocaciones para la "ventana del cráneo" (es decir, la craneotomía), los tornillos del cráneo, y el cable de tierra. A) Una vista dorsal del cráneo que muestra la colocación de un tornillo de calavera en cada placa del cráneo (rojo), una ventana de cráneo (cuadrado), y un agujero contralateral para el cable de tierra (verde). Cuando la planificación de la ventana cráneo, las coordenadas deben ser definidos por la determinación de la B) anterior y C) medial posterior y laterales coordenadas para la región diana (por ejemplo, cuerpo estriado dorsolateral). D) Estas coordenadas se pueden utilizar para determinar la colocación de la ventana en la superficie dorsal del cráneo. Tenga en cuenta que la ventana del cráneo corresponde a los objetivos de medio y lateral identificados en B y C y también se extiende a las indicadas en el plano anteroposterior entre B y C. Estas coordenadas serán específicos para cada región objetivo individual. Loca Representanteciones de los microhilos en una matriz 2 x 8 se muestran utilizando pequeños puntos dentro de la ventana de cráneo muestra en D. El dorsoventral cota final de los cables dependerá de la profundidad a la que se bajan. Las cifras modificadas de Paxinos y Watson ^14. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. Una ilustración del proceso de amplificación diferencial. El panel superior representa una señal neural antes de la amplificación diferencial (señal + ruido). Después de la amplificación diferencial, las señales eléctricas extrañas que se encuentran en todos los canales (ruido; panel central) se pueden restar eficacia desde wi grabaciónres a través de la utilización de un electrodo diferencial especificada con el fin de mejorar el aislamiento de la forma de onda neuronal (señal; panel inferior).

Figura 3. Un ejemplo de forma de onda neural (derecha) grabado desde un cable de una matriz de micro-hilo. El histograma (izquierda) muestra el número de potenciales de acción en los milisegundos que preceden a cada observaron la descarga neuronal en la sesión. Cada contenedor representa un período de 1 milisegundo. El histograma demuestra que no hay potenciales de acción se produjo en período refractario natural de la neurona (2 mseg).

Figura4. Un ejemplo de una neurona que se inhibe tónicamente durante la autoadministración de cocaína. A) La tasa de disparo (Spikes/30 seg) de una neurona a través de una cocaína sesión de auto-administración de acceso larga en 30 segundos contenedores. B) El correspondiente nivel calculado de drogas a través de la misma sesión. En combinación, los aumentos en el nivel de drogas están relacionados con una depresión en actividad neuronal. De acuerdo con ello, cuando la sesión termina a ~ 425 min, se recupera de disparo neuronal como los niveles corporales de caída de cocaína.

Figura 5. Cortes histológicos de dos animales con implantes microhilo. A) Una sección Nissl teñidas utilizando rojo neutro combinado con un contador mancha ferrocianuro potásico revelando consejos microhilo lesioned (azul).Un micro-hilo se puede remontar desde la corteza hasta las puntas de alambre (Azules) siguiendo las pistas de alambre en el tejido. Pistas pueden ser rastreados en una sola rebanada o una serie de cortes adyacentes. B) Una sección manchada por la sustancia P, que revela el pallidum ventral, junto con un contador mancha ferrocianuro potásico. Utilizando técnicas inmunohistoquímico, microhilos individuales pueden estar localizados en regiones específicas del cerebro, o incluso dentro de las sub-regiones específicas de un núcleo particular. La figura muestra una punta de micro-hilo (azul) localizada en el pallidum ventral utilizando el P mancha de sustancias.

Discussion

Registros extracelulares representan una técnica experimental de gran alcance que puede incorporarse en casi cualquier preparación experimental en la neurociencia. Cables que han sido implantados en matrices organizados pueden ser rastreados como sus ejes pasan a través del cerebro y en su región diana (Figura 5A). Cuando se crea una lesión pequeña, post-experimental en la punta no aislada microhilo para crear un pequeño depósito de hierro del alambre de acero inoxidable, se puede marcar con precisión la ubicación de la punta no aislada microhilo (donde se registró la de una sola unidad) utilizando una solución de 5% ferrocianuro de potasio y 10% de HCl (Figuras 5A y 5B; puntos azules). Por lo tanto, se puede utilizar fácilmente una serie de cortes de cerebro posteriores para recrear la posición de toda la matriz dentro del cerebro. Por último, las técnicas antes mencionadas se pueden combinar fácilmente con técnicas de inmunohistoquímica con el fin de aumentar la especificidad espacial de grabaciones, con el finpara verificar ubicaciones de orientación, e incluso con el fin de estudiar las diferencias subregionales dentro de un solo objetivo núcleo ³ (Figura 5B).

Para lograr la especificidad espacial deseada, arrays microhilo deben ser diseñados e implantados con cuidado. En primer lugar, la separación de las filas y columnas dentro de la matriz debe estar diseñado específicamente para la región de interés. Las matrices que son demasiado largos o anchos para el objetivo deseado pueden reducir la precisión o producir un gran número de cables que se encuentran en la frontera entre dos núcleos adyacentes. Al mismo tiempo, microhilos espaciados muy cerca entre sí pueden prohibir una demarcación independiente de cada electrodo. En segundo lugar, las matrices microhilo deben ser manipulados con cuidado a fin de mantener la integridad de la matriz. Matrices individuales de electrodos se producen utilizando alambres finos, similares a pelos que pueden ser fácilmente dañados o empujaban desde su configuración al ser contactados. Las cualidades de estos cables son ideales para reducir el daño to tejido en el camino de acercamiento a uno de destino y también permiten que los cables se desplacen en concierto con pequeños movimientos del cerebro. Por lo tanto, normalmente es aconsejable almacenar las matrices en un lugar seguro y evitar la eliminación de las matrices de sus cajas de protección hasta justo antes de la implantación. Además, se debe tener cuidado cuando se esterilizan arrays microhilo. En algunos casos, la esterilización en autoclave de electrodos puede ser aceptable. Sin embargo, óxido de etileno o UV de desinfección puede ser preferible proteger matrices frágiles. Por último, el metal del electrodo y el aislamiento, y el diámetro de cada uno, se deben considerar cuidadosamente. Por ejemplo, sólo los electrodos que contienen hierro (por ejemplo, acero inoxidable) serán capaces de producir reacciones azul de Prusia para la demarcación individual de cada micro-hilo de la matriz.

En ocasiones, los microhilos de la matriz se apartan de su configuración durante el descenso debido a las obstrucciones inadvertidos (por ejemplo, fragmentos de cráneo en la ventana del cráneo) o pobres handling. En estos casos, un micro-hilo de este tipo puede a menudo todavía ser rastreado hasta su extremo (aunque es probable que sea fuera de la región de destino). En caso de surgir una instancia donde cualquier microhilo numerada en la matriz no se puede verificar, es importante para la integridad de la experiencia que este animal se retira del conjunto de datos. La mala interpretación de la posición de un micro-hilo individual puede permitir que sus señales neuronales para complicar o la interpretación de los datos corruptos.

Durante la implantación, la precisión de la ventana de cráneo y la alineación matriz también son críticos para apuntar exactitud. Ventanas del cráneo deben hacerse lo suficientemente amplia como para permitir que el conjunto que pase sin que se doble o cables perjudiciales. Por otro lado, la ventana también se utiliza para guiar con precisión la matriz a la posición de destino y por lo tanto debe ser perforado con precisión en cada dimensión. Cuando esté listo para su implantación, también hay que estar seguro de que la matriz esté a plomo con la ventana de cráneo en todas las dimensiones. Es decir,una ligera inclinación de la matriz en cualquier dimensión puede causar la matriz, ya sea parcial o pierda el núcleo blanco totalmente. Por último, se debe tener especial cuidado al bajar la primera 1-3 mm. Es durante el descenso inicial que los trozos de escombros que se han pasado desapercibidos en la ventana de cráneo pueden comprometer la integridad de la matriz y alterar el camino de microhilos. Si la ruta de los microhilos se obstruye mientras se bajan lentamente, uno puede ver microhilos curva o arco con una ligera ampliación antes de la matriz incurre cualquier daño (por ejemplo, utilizando una lupa). En este punto, microhilos se pueden retraer y escombros se pueden borrar de la ventana antes de continuar con la implantación.

Por último, pero no menos importante, implantación exitosa de arrays microhilo requiere especial atención al mantenimiento de un quirófano aséptico y proporcionando cuidados post-operatorios a fondo. Cuando se combina con las precauciones antes mencionadas, grabaciones viables pueden obtenerse a partirregiones de interés por más de un mes, hemos verificado grabaciones hasta 40 días después de la cirugía ^6. Quizás lo más importante, la longevidad de estas grabaciones ofrece la oportunidad de estudiar los circuitos funcionales diferenciadas dentro del complejo entorno de los equipos eléctricos, químicos, y las influencias hormonales y responder a preguntas vitales sobre el papel de estos circuitos en el aprendizaje y la motivación.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. List of Surgical Materials.
Gauze	Fisher (MooreBrand)	19-898-144
Cotton Swabs	Fisher (Puritan)	S304659
Nembutal (Pentobarbital)	Sigma Aldrich	P3761
Atropine Methyl Nitrate	Sigma Aldrich	A0382
Baytril (Enrofloxacin)	Butler Shein (Bayer)	1040007
Ketamine Hydrochloride	Butler Shein	SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine)	Fisher (Perdue)	19-066452
Stereotax	Kopf	Model 900
Cauterizing Tool	Stoelting	59017
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ445
Dental Drill	Buffalo	37800
Bacteriostatic Saline	Bulter Schein	8973
Jewlers Screws	Stoelting	51457
Microwire Array	Microprobes	Custom (Flexible)
Ground Wire	Omnetics	Custom Plug
Dental Acrylic	Fisher (BAS)	50-854-402
Absorbable Sutures	Fisher (Ethicon)	NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant)	Fisher (Henry Schein)	008897
Table 2. List of Surgical Instruments.
2x Microforceps	George Tiemann Co.	#160-57	Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps	George Tiemann Co.	#160-93	Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats	George Tiemann Co.	#105-1125	Clamp and open incision
1x Small scissors	George Tiemann Co.	#105-411	Cut sutures after tying
1x Tissue forceps	George Tiemann Co.	#105-222	Holding tissue while suturing
1x Needle holder	George Tiemann Co.	#105-1259	Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade)	George Tiemann Co.	#105-80 (w/ #105-71 blade)	Making skull incision
1x #22 Scalpel blade	George Tiemann Co.	#160-381	Shaving scalp
1x Surgical Spatula	George Tiemann Co.	#160-718	Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws	Various	N/A	0/80 x 1/8”
Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals.
Microwire Array & Connector	Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)	N/A (Part No. based on array characteristics)	Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc.
Unity-Gain Harness/Headstage	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1200	Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (and Optional Fluid Swivel)	Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)	SL18C	Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-amplifier	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1198	Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter and Amplifier	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1199	Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer	EnGen (Phoenix, AZ)	N/A (Custom Build)	Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card	Data Translation (Marlboro, MA)	DT-3010	Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card	Measurement Computing (Norton, MA)	PCI CTR-05	Acquires behavioral inputs and outputs