Summary
एकल इकाई electrophysiological रिकॉर्डिंग में इस्तेमाल के लिए microwires का आयोजन सरणियों दाखिल तकनीकी चुनौतियों का एक संख्या प्रस्तुत करता है. इस तकनीक और आवश्यक उपकरणों के प्रदर्शन के लिए तरीके से वर्णित हैं. इसके अलावा, उच्च स्थानिक चयनात्मकता के साथ अलग तंत्रिका उपक्षेत्र से रिकॉर्ड करने के लिए संगठित microwire सरणियों के लाभकारी उपयोग पर चर्चा की है.
Abstract
जाग vivo में electrophysiological रिकॉर्डिंग में, बर्ताव जानवर एकल कोशिका के स्तर पर तंत्रिका संकेत समझने के लिए एक शक्तिशाली तरीका प्रदान करते हैं. तकनीक प्रयोगकर्ताओं चल रहे व्यवहार के साथ दर्ज कार्रवाई क्षमता सहसंबंधी क्रम में अस्थायी और क्षेत्रीय विशिष्ट फायरिंग पैटर्न की जांच करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, एकल इकाई रिकॉर्डिंग तंत्रिका समारोह की व्यापक स्पष्टीकरण का निर्माण करने के क्रम में अन्य तकनीकों की अधिकता के साथ जोड़ा जा सकता है. इस अनुच्छेद में, हम microwire आरोपण के लिए संज्ञाहरण और तैयारी का वर्णन है. बाद में, हम आवश्यक उपकरण और सही ढंग से एक लक्ष्य संरचना में एक microwire सरणी सम्मिलित करने के लिए शल्य कदम की गणना करें. अन्त में, हम संक्षेप में सरणी में प्रत्येक व्यक्ति इलेक्ट्रोड से रिकॉर्ड करने के लिए उपकरणों का इस्तेमाल किया वर्णन. वर्णित तय microwire सरणियों पुरानी आरोपण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है और लगभग किसी भी व्यवहार preparati में तंत्रिका डेटा के अनुदैर्ध्य रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देते हैंपर. हम microwire पदों के रूप में अच्छी तरह के रूप में दर्ज परिणामों की संरचनात्मक विशिष्टता को बढ़ाने के लिए immunohistochemical तकनीक के साथ microwire आरोपण गठबंधन करने के तरीके त्रिकोण इलेक्ट्रोड पटरियों अनुरेखण पर चर्चा की.
Introduction
Electrophysiological रिकॉर्डिंग वैज्ञानिकों जैविक कोशिकाओं के बिजली के गुणों की जांच करने की अनुमति देते हैं. बिजली के उद्यमी एक संकेतन तंत्र के रूप में काम जहां केंद्रीय तंत्रिका तंत्र, में, ये रिकॉर्डिंग तंत्रिका समारोह 1-2 समझने के लिए विशेष महत्व के हैं. जानवरों के बर्ताव में एकल इकाई रिकॉर्डिंग के दौरान मस्तिष्क में डाला गया है कि एक microelectrode समय के साथ कार्रवाई की क्षमता का एक न्यूरॉन की पीढ़ी में परिवर्तन रिकॉर्ड करने में सक्षम है.
कई तकनीक एक मस्तिष्क गतिविधि को रिकॉर्ड करने की अनुमति है, जबकि एकल इकाई इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी एकल न्यूरॉन स्तर पर संकल्प की अनुमति से सबसे सटीक तरीकों में से एक है. स्थानिक विशिष्टता के एक उच्च डिग्री वांछित है, जब microwires असतत उप नाभिक या brain3 भीतर कोशिकाओं की टुकड़ियों को लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. रिकॉर्डिंग microsecond स्तर पर सही कर रहे हैं के रूप में एकल इकाई रिकॉर्डिंग भी उच्च अस्थायी समाधान से लाभ. और, vivo में एकजाग रिकॉर्डिंग अभिवाही और अपवाही अनुमानों, प्रणालीगत रासायनिक और हार्मोनल प्रभावों, और शारीरिक मापदंड के प्राकृतिक परिवेश के साथ बरकरार सर्किट बातचीत अनुमति देते हैं. तंत्रिका संकेतों संवेदी इनपुट, मोटर व्यवहार, संज्ञानात्मक प्रसंस्करण, neurochemistry / औषधि, या कुछ संयोजन से निकाली गई है. तदनुसार, संवेदी, मोटर, संज्ञानात्मक, और रासायनिक प्रभावों से अलगाव aforementioned प्रभावों में से प्रत्येक के आकलन के लिए अनुमति दे सकता है कि प्रभावी आकस्मिकताओं और नियंत्रण के साथ अच्छी तरह से कल्पना प्रयोगों जरूरी है. सब सब में, जानवरों के बर्ताव में रिकॉर्डिंग प्रयोगकर्ताओं एक कार्य सर्किट के भीतर सूचना के कई स्रोतों के एकीकरण का निरीक्षण करने और सर्किट समारोह के एक अधिक व्यापक मॉडल प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं.
एकल इकाई रिकॉर्डिंग भी किसी भी प्रयोगकर्ता के बारे में पता होना चाहिए जो की नुकसान के एक नंबर से पीड़ित हैं. और सबसे पहले, रिकॉर्डिंग का संचालन करने के लिए मुश्किल हो सकता है. दरअसल, वीं के गुणई headstage एम्पलीफायरों और इन रिकॉर्डिंग में स्थानिक और लौकिक विशिष्टता के लिए अनुमति देते हैं कि प्रत्यारोपित microwires भी बाहरी विद्युत संकेतों (यानी बिजली "शोर") के प्रभाव को रिकॉर्डिंग अतिसंवेदनशील बनाता है. तदनुसार, एक electrophysiological प्रणाली में समस्याओं का निवारण करने की क्षमता electrophysiological सिद्धांतों और तंत्र की एक अच्छी तरह से विकसित तकनीकी समझ जरूरी है. यह कुछ निश्चित परिस्थितियों में, कोशिकी रिकॉर्डिंग में दर्ज विद्युत संकेतों को कई तंत्रिका संकेतों के संकलन का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं, ध्यान रखें कि यह भी महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, एक लक्ष्य क्षेत्र के भीतर आबादी गतिविधि को एकल इकाई गतिविधि की generalizability अक्सर लक्ष्य क्षेत्र के भीतर सेलुलर विविधता की डिग्री द्वारा सीमित है (लेकिन कार्डिन 4 देखें) किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोड अन्य कोशिकाओं के एवज में उच्च आयाम उत्पादन न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग के प्रति पक्षपाती किया जा सकता है. एकल इकाई रिकॉर्डिंग की विवेचनीयता बढ़ जाती हैसहित अन्य तकनीकों के साथ रिकॉर्डिंग के संयोजन है, लेकिन सीमित नहीं द्वारा, बिजली (orthodromic या तंत्रिका आवेगों को सामान्य से विपरीत दिशा में संचालित करने वाला, प्रतिदिक), रासायनिक (जैसे iontophoretic या डिजाइनर रिसेप्टर) या optogenetic उत्तेजना 4, अस्थायी तंत्रिका inactivations, ज्ञानेन्द्रिय परीक्षाओं 5, वियोग प्रक्रियाओं, या immunohistochemistry 3.
(प्रोटोकॉल अन्य प्रजातियों में इस्तेमाल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है) हम चूहे में एक संगठित microwire सरणी प्रत्यारोपण करने के लिए आवश्यक सामग्री और कदम करके बताना होगा कि इस प्रकार प्रोटोकॉल में. हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता तय सरणियों की प्रक्रिया और शैली अनुदैर्ध्य रिकॉर्डिंग के लिए विश्वसनीय सिद्ध कर दिया है और एक महीने का समय 6-8 से अधिक के लिए एक ही न्यूरॉन की रिकॉर्डिंग बनाए रख सकते हैं. इस प्रयोगात्मक उत्तेजनाओं, तंत्रिका प्रतिक्रियाओं में प्लास्टिक परिवर्तन, या सीखने और प्रेरणा के तंत्र को phasic प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए इस प्रक्रिया को आदर्श बनाता है.
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Protocol
के लिए तैयारी और निम्न प्रक्रिया का आयोजन करते हुए (9 प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में वर्णित है) अत्यंत सावधानी सड़न रोकनेवाला स्थिति बनाए रखने के लिए लिया जाना चाहिए. निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुपालन में है और संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति, रुटगर्स विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है. यह बाद की प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए 3-6 घंटे की आवश्यकता होगी कि अनुमान है.
Microwire ऐरे दाखिल:
- जगह संज्ञाहरण के तहत जानवरों के 50 मिलीग्राम / किग्रा सोडियम pentobarbital (आईपी) का उपयोग और atropine मिथाइल नाइट्रेट की 10 मिलीग्राम / किग्रा प्रशासन (आईपी; Glycopyrrolate प्रतिस्थापित किया जा सकता है) और 0.25 मिलीग्राम पेनिसिलिन (300,000 यू / मिलीलीटर आईएम) श्वसन समारोह को बनाए रखने और संक्रमण को रोकने के लिए , क्रमशः.
नोट: यह लागत प्रभावी है और करने के लिए मानव जोखिम सीमा क्योंकि इस आरोपण सर्जरी के 3-6 घंटा लंबाई के साथ, सोडियम pentobarbital प्रयोग किया जाता हैनिश्चेतक (गैस anesthetics के लंबे समय तक इस्तेमाल के साथ हो सकता है के रूप में) अभी भी लंबे समय से स्थायी संज्ञाहरण प्रदान करते हुए. अन्य निश्चेतक का प्रतिस्थापन स्वीकार्य है. - संज्ञाहरण आगे बढ़ने से पहले पूंछ चुटकी परीक्षण का उपयोग प्रभाव लिया गया है सत्यापित.
- आवश्यक के रूप में, सर्जरी के दौरान संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए ketamine हाइड्रोक्लोराइड (60 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) और सोडियम pentobarbital (5-10 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) के इंजेक्शन बारी दे.
- एक # 22 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग खोपड़ी दाढ़ी.
- Povidone आयोडीन के साथ मुंडा खोपड़ी कीटाणुरहित.
- Bupivacaine के चमड़े के नीचे इंजेक्शन दे (~ 4 इंजेक्शन साइटों पर 1 मिलीग्राम / किग्रा अनुसूचित जाति प्रसार) के लिए स्थानीय स्तर पर खोपड़ी anesthetize. प्रभावी करने के लिए स्थानीय संवेदनाहारी के लिए 5-10 मिनट की अनुमति दें.
- संज्ञाहरण के दौरान नमी बनाए रखने के लिए आंखों पर एक नेत्र स्नेहक रखें.
- कान सलाखों और एक stereotaxic तंत्र की नाक दबाना में जानवर सुरक्षित.
- STER पर दृश्य स्थलों का प्रयोग करें (जैसे एक क्षैतिज पट्टीलगभग पशु के सिर के स्तर के लिए eotaxic फ्रेम). यह कदम केवल लगभग स्तर खोपड़ी के लिए होती है.
- एक छुरी धारक पर घुड़सवार # 11 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग खोपड़ी के midline के साथ एक चीरा बनाओ. चीरा नाक की हड्डी के पीछे भाग को सिर्फ कान के पीछे से विस्तार करना चाहिए.
- पार्श्व खोपड़ी लकीरें और पीछे खोपड़ी रिज दोनों पर पहुंच गया है जब तक एक विच्छेदन रंग का उपयोग करना, शेष सभी ऊतक की खोपड़ी को साफ़ करें.
- Hemostats की एक संख्या (6x) का उपयोग चीरा के आसपास त्वचा वापस खींच.
- किसी भी रक्त की खोपड़ी को साफ और सूखे के लिए अनुमति देते हैं. किसी भी शेष खून बह रहा होता है, तो एक छोटा सा cauterizing उपकरण के साथ अवशिष्ट खून बह रहा है समाप्त. खोपड़ी को साफ और शुष्क बना हुआ है कि यह सुनिश्चित करने के बाद के चरणों में प्रयोग किया जाता दंत ऐक्रेलिक स्थायी रूप से खोपड़ी के लिए बाध्य करने की अनुमति देता है.
- मार्क पर्वबिन्दु और खोपड़ी टांके के चौराहे interpolating द्वारा लैम्ब्डा (चित्रा 2 डी). एक विदारक microscope सही इन पदों को चिह्नित करने के लिए आवश्यक है.
- एक stereotaxic हाथ करने के लिए एक छोटा सा उठाई आइटम (जैसे एक पिन या दंत ड्रिल बिट) देते हैं और पृष्ठीय / वेंट्रल (डीवी) निर्धारित करने के लिए यह कम शीर्षस्थान और लैम्ब्डा के समन्वय.
- DV एक दूसरे की 100 मीटर (0.1 मिमी) के भीतर हैं शीर्षस्थान और लैम्ब्डा के लिए निर्देशांक तक नाक दबाना समायोजित करें.
- एक बार लगाए, पूर्वकाल / पीछे (एपी) रिकॉर्ड पार्श्व / औसत दर्जे का (माले) और डीवी नाक दबाना की स्थिति के साथ पर्वबिन्दु का समन्वय करता है. सर्जरी के शेष इन निर्देशांक की शुद्धता पर निर्भर करता है, के रूप में सटीकता के लिए निर्देशांक की दोबारा जांच.
- एमएल और एपी पर्वबिन्दु को "खोपड़ी खिड़की" रिश्तेदार (चित्रा 1 यानी कपाल - उच्छेदन) के चारों कोनों के लिए निर्देशांक की गणना करने के लिए मापा निर्देशांक प्रयोग करें. खोपड़ी खिड़की microwire सरणी के पास जाएगा जिसके माध्यम से एक निश्चित स्थान पर आयत है.
- चिह्नित करने के लिए गणना की निर्देशांक का उपयोगखोपड़ी खिड़की एक उठाई stereotaxic लगाव और फाउंटेन पेन की स्याही का उपयोग कर खोपड़ी पर निर्देशांक. सटीक अंक प्राप्त करने के लिए, एक कपास applicator का उपयोग अंकन उपकरण की टिप करने के लिए स्याही की केवल एक छोटी राशि लागू होते हैं.
- छोटे परतों की एक श्रृंखला में हड्डी निकाल कर खोपड़ी खिड़की से बाहर ड्रिल.
- निशान रखा गया है जहां खिड़की के रूप में चिह्नित कोनों ड्रिलिंग के द्वारा शुरू करो.
- अगला, कोनों को जोड़ने और खिड़की रूपरेखा.
- अंत में, स्पष्ट ड्यूरा मेटर की गहराई तक नीचे रूपरेखा के भीतर क्षेत्र से बाहर. छेद खिड़की ऊपर से नीचे तक एक उचित चौड़ाई का कहना है कि यह सुनिश्चित करने के लिए खोपड़ी की ऊपरी परत नीचे (यानी beveled) व्यापक होना चाहिए.
- ध्यान से खोपड़ी खिड़की के अंदर किसी भी शेष अस्थि चिप्स, मलबे, या ड्यूरा मेटर को दूर करने के microforceps का प्रयोग करें. सामग्री की इन बिट्स को कम करने के दौरान सरणी की अखंडता से समझौता कर सकते हैं यह कदम बेहद महत्वपूर्ण है. एक बार मंजूरी दे दी, एक वें रखना चाहिएसर्जरी के शेष के लिए बैक्टीरियोस्टेटिक नमक के साथ नम ई खिड़की.
- 5 खोपड़ी शिकंजा और 1 जमीन तार के लिए खोपड़ी (चित्रा 1) पर निशान रखें. इन पदों पर लक्षित मस्तिष्क क्षेत्र के आधार पर अलग अलग होंगे. एक पेंच 5 खोपड़ी की हड्डियों में से प्रत्येक पर रखा गया है अगर headstage सबसे सुरक्षित हो जाएगा. Microwire सरणी नियुक्ति के मामले में हस्तक्षेप नहीं करेगा स्थानों में खोपड़ी शिकंजा और जमीन तार दोनों रखें.
- खोपड़ी शिकंजा के लिए छेद ड्रिल और जगह में शिकंजा सुरक्षित. शिकंजा केवल 3-4 धागे (प्रांतस्था नुकसान नहीं भी गहरी के रूप में या तो, सिफारिश की तुलना में अन्य शिकंजा का उपयोग करते हैं, तो गहरी पर्याप्त सरणी स्थिरता को बढ़ावा देने के लिए खोपड़ी की मोटाई पार करने के लिए लेकिन) दिखा रहे हैं, जब तक कम किया जाना चाहिए. नियुक्ति के बाद शिकंजा के धागे से साफ करें.
- जमीन तार के लिए एक छेद ड्रिल. लक्ष्य DV समन्वय और दंत ऐक्रेलिक का उपयोग जगह में तार ठीक करने के लिए (1-2 मिनट से अधिक) धीरे धीरे तार कम करें.
- धागे के आसपास ऐक्रेलिक जोड़ेंखोपड़ी शिकंजा की. ऐक्रेलिक dries पहले, दूर जमीन तार या खोपड़ी शिकंजा से बहती है कि किसी भी अतिरिक्त सीमेंट हटा दें. / कठोर सुखाने के लिए दंत ऐक्रेलिक के लिए 15 मिनट की अनुमति दें.
- Stereotaxic हाथ करने के लिए सरणी देते हैं. सरणी स्तर और यह squarely खोपड़ी खिड़की के दायरे से गुजरना होगा कि इसलिए यह पूरबी.
- यह खोपड़ी के साथ स्तर इतना है कि खोपड़ी खिड़की में खारा रखें. यह खारा में एक हिलकोरे बनाता है जब तक सरणी कम करें. इस समन्वय सरणी के लिए खोपड़ी स्तर के रूप में प्रयोग किया जाता है. अंतिम DV सरणी के समन्वय की गणना करने के लिए इस मान का उपयोग करें.
- यह अपने अंतिम DV समन्वय पहुंचता है जब तक धीरे धीरे सरणी कम करें. कम करने के लिए हर 1mm बंद करो और मस्तिष्क के ऊतकों (खूंटी को कम करते हुए अस्थायी रूप से उनकी रचना में तारों रखने के लिए प्रयोग किया जाता है प्रगर्तन से उबरने के लिए और सरणी पर पॉलीथीन glycol (खूंटी) के नीचे के हिस्से को भंग करने की अनुमति देने के लिए कई मिनट के लिए इंतजार , और) खारा में धीरे - धीरे घुल.
- सरणी 1mm है जबअंतिम लक्ष्य तक पहुँच जाता है जब तक लक्ष्य से दूर, और धीरे धीरे यह कम है. ऊतक 5 मिनट की अवधि के लिए आराम करने के लिए अनुमति देने से पहले एक बार में 0.1-0.2 मिमी कम लक्ष्य साइट के साथ ही समीपस्थ synaptic कनेक्शन पर ऊतक की रक्षा करने का इरादा है. उपकरण उपलब्ध है, तो सरणी के कम परिशुद्धता एक मोटर चालित जोड़तोड़ का उपयोग कर सहायता प्रदान की जा सकती है.
- शेष खूंटी भंग और जगह में microwires सीमेंट दंत ऐक्रेलिक का उपयोग करें. तारों सुरक्षित हैं सुनिश्चित करने और फिर आगे बढ़ने से पहले कड़ा करने के लिए सीमेंट के लिए 15-20 मिनट की अनुमति के लिए सीमेंट की कई परतों जोड़ें. यह तार उनके अंतिम प्लेसमेंट से jostled नहीं होगा कि यह सुनिश्चित करता है.
- दंत ऐक्रेलिक का उपयोग कर पशु के headstage के शेष बनाएँ. Microwires के लिए खोपड़ी शिकंजा, जमीन तार, और संबंधक डिब्बे में बंद ऐक्रेलिक का प्रयोग करें. ऐक्रेलिक टोपी आगे बढ़ने से पहले पर्याप्त कड़ा करने की अनुमति दें.
- Absorbable sutures का उपयोग खोपड़ी चीरा सिवनी और प्रशासन 2 मिलीलीटर ओएफ सर्जरी से जलयोजन बहाल करने के लिए बैक्टीरियोस्टेटिक खारा (अनुसूचित जाति).
- कान सलाखों से पशु निकालें और एक साफ क्षेत्र में विषय जगह है. तापमान और हरकत बरामद किया है जब तक पोस्ट ऑपरेटिव वसूली के दौरान अक्सर जानवर को ध्यान से देखें. संज्ञाहरण से वसूली के बाद, शल्य चिकित्सा के बाद वसूली के शेष के लिए एकल आवास में पशु चाल है.
- जानवरों दैनिक पश्चात निगरानी दे दो और प्रक्रिया के बाद के दिनों में परवाह है. सात या अधिक दिनों की अनुमति दी जाती है जब इस प्रक्रिया से वसूली इष्टतम है.
- जानवरों Carprofen (5mg/kg) और Enrofloxacin में भाग लेने के पशु चिकित्सक द्वारा सिफारिश की अनुसूची के अनुसार वसूली के दौरान (5-10 मिलीग्राम / किग्रा) या उनके समकक्ष के इंजेक्शन दे.
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Representative Results
Electrophysiological संकेतों की रिकॉर्डिंग के लिए इस प्रयोगशाला द्वारा इस्तेमाल किया उपकरणों की एक सूची तालिका 3 में पाया जा सकता है. सर्जरी से वसूली के बाद, एकल इकाइयों प्रत्यारोपित कनेक्टर में एक एकता लाभ headstage plugging द्वारा दर्ज की गई हैं. इस headstage बिजली पर्ची के छल्ले के उपयोग के माध्यम से electrophysiological रिकॉर्डिंग में टूट के बिना मुक्त रोटेशन में सक्षम है जो एक कम्यूटेटर, करने के लिए एक केबल के माध्यम से जुड़ा हुआ है. कम्यूटेटर इस तैयारी के सिद्धांत लाभ में से एक है जो व्यवहार के दौरान, जबकि रिकॉर्डिंग विषयों आसानी से ले जाने के लिए अनुमति देता है. संकेत तो यह एक इकाई संकेत प्रदर्शन नहीं करता, क्योंकि विभिन्न चयनित एक इलेक्ट्रोड पर परिवेश शोर के खिलाफ प्रत्येक इलेक्ट्रोड पर संकेत बढ़ाना करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है कि एक preamplifier (10x लाभ) के माध्यम से तंग आ चुके हैं. अंतर रिकॉर्डिंग दो voltages के बीच तात्कालिक अंतर बढ़ाना इस्तेमाल कर रहे हैं. दोनों तारों, लगभग उतना ही उनके विरोध परिवेश शोर रिकॉर्ड क्योंकिते छोर प्रभावी रूप से तंत्रिका रिकॉर्डिंग से परिवेश शोर के घटाव (चित्रा 2) सक्षम. अंत में, संकेत फ़िल्टर्ड बैंड पास हैं (450 हर्ट्ज 10 kHz, 1 kHz और -6 DB / सप्टक 11 kHz पर पर -1.5 डीबी / सप्तक से रोल) एक ए / डी कार्ड के साथ एक कंप्यूटर का उपयोग कर डिजीटल किया जा रहा से पहले और प्रवर्धित 700x (50 kHz नमूना आवृत्ति / तार) और ऑफ़लाइन विश्लेषण के लिए भंडारित किया.
सॉफ्टवेयर में, waveforms अक्सर एक सीमा का पता लगाने पद्धति का उपयोग जांचा जाता है. इस प्रकार, एक दिया वोल्टेज सीमा से गुजरना जो संकेत डिजीटल और संग्रहीत हैं. फिर भी, बिजली कलाकृतियों सीमा, फ़िल्टरिंग और अंतर प्रवर्धन के माध्यम से गुजरती हैं, और नमूना हैं जिसमें झूठी सकारात्मक का एक अंतर्निहित दर, वहाँ है. इन गैर तंत्रिका waveforms (. आदि जैसे आयाम, शिखर और घाटी voltages,) नमूना निर्वहन उनके मापदंडों के आधार पर हल किया जा करने की अनुमति देता है जो कील छँटाई सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के बाद अस्थायी घटाया और बाद में एल के उन्मूलन के लिए अनुमति देता हैectrical 'शोर' और neuronal संकेत का चयन (चित्रा 3). Waveforms विश्लेषण के लिए शामिल किए गए हैं अगर एक स्पष्ट रूप से परिभाषित संभावित कार्रवाई और hyperpolarization के बाद (3 चित्र सहित तंत्रिका गतिविधि के विहित पैटर्न के साथ मौजूद 1) Waveforms, सही पैनल), कम से कम एक 2:1 संकेत एक ख्यात तंत्रिका तरंग प्रदर्शन के 2) आयाम : शोर अनुपात (यानी स्पष्ट रूप से चैनल के शोर बैंड से वियोज्य है, शोर बैंड के आयाम = लगभग .. 50 μV); हिस्टोग्राम कोई निर्वहन हुई पता चलता है कि 3) पैरामीटर पूरे सत्र के दौरान स्थिर रहने और 4) एक interspike अंतराल (आईएसआई) न्यूरॉन की प्राकृतिक आग रोक की अवधि के दौरान (यानी ~ 2 मिसे, चित्रा 3 पैनल छोड़ दिया).
तंत्रिका निर्वहन तो एक डिजिटल इनपुट, आउटपुट (आई / ओ) कार्ड के उपयोग के माध्यम से timestamps के रूप में दर्ज कर रहे हैं कि व्यवहार की घटनाओं (जैसे लीवर जवाब) के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है. ये समय, एक विशेष व्यवहार घटना के चारों ओर एक निर्धारित समय सीमा में होते हैं कि neuronal निर्वहन प्रदर्शित करने के लिए उपयोग किया जाता है, जो टिकटों पेरी घटना समय histograms (चित्रा -4 ए PETHs) बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमारी प्रयोगशाला आमतौर पर घंटे (टॉनिक 10), मिनट (धीमी गति से Phasic 11) के आदेश पर तंत्रिका फायरिंग की जांच की, और सेकंड / मिलीसेकंड (रैपिड Phasic 12) है. टॉनिक गोलीबारी आम तौर पर एक सत्र में सबसे अधिक वैश्विक घटनाओं की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है. जानवरों के आत्म - प्रशासन दवा, यानी predrug बनाम पर दवा फायरिंग दरों रहे हैं जब उदाहरण के लिए, हम अक्सर न्यूरॉन्स की फायरिंग दर में तुलना करने के लिए इस का उपयोग करें. धीरे phasic विश्लेषण अक्सर मिनट पर एक दवा के औषधीय क्षय की तरह धीमी गति से बदलते घटनाक्रम के दौरान फायरिंग की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है. अंत में, तेजी से phasic विश्लेषण एक स्फूर्त प्रतिक्रिया या एक प्रयोगात्मक क्यू की शुरुआत की तरह अधिक तात्कालिक घटनाओं के लिए उपयोग किया जाता है.
चित्रा 4 टॉनिक गोलीबारी की एक हिस्टोग्राम से पता चलता हैकोकीन आत्म - प्रशासन के दौरान एक पूरी रिकॉर्डिंग सत्र भर में 30 दूसरे डिब्बे में निर्वहन की गिनती के साथ. दिखाए गए उदाहरण सेल कोकीन के शरीर के स्तर में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है और कोकीन बढ़ जाती है (चित्रा 4 बी) के पशु के शरीर के स्तर के रूप में (चित्रा -4 ए) हिचकते हो जाता है, लेकिन कोकीन के स्तर के रूप में अपनी मूल फायरिंग दर के लिए रिटर्न के बाद गिर जाता है आत्म - प्रशासन आकस्मिकताओं समाप्त हो गया है. लक्ष्य क्षेत्र पर निर्भर करता है, न्यूरॉन्स औषधीय प्रभाव, या इनाम जुड़े cues 6, ज्ञानेन्द्रिय इनपुट 13, या प्रेरित दृष्टिकोण 3 सहित व्यवहार की घटनाओं के किसी भी संख्या के प्रति संवेदनशील हो सकता है.
सही शर्तों के तहत, यह कई सत्रों के लिए एक ही न्यूरॉन रिकॉर्ड करने के लिए संभव है. Striatum में, न्यूरॉन्स एक ही ढंग से वितरित (तारों का 80% केवल एक ही इकाई उपज और कोशिकाओं स्तरित या कसकर समूहीकृत नहीं कर रहे हैं) और कहा कि जल्दी क्षय ove अपेक्षाकृत छोटे संकेतों का उत्पादन कर रहे हैंआर दूरी. इन शर्तों के तहत, हमारी प्रयोगशाला कई हफ्तों के लिए striatum में ही न्यूरॉन रिकॉर्ड करने में सक्षम हो गया है. महत्वपूर्ण बात है, नहीं सभी न्यूरॉन्स सत्र भर में सत्यापित किया जा सकता है और नहीं सभी न्यूरॉन्स समय के साथ रखा जाता है. अनुदैर्ध्य रिकॉर्डिंग के इन प्रकार प्राप्त करने की क्षमता का निर्धारण electrophysiological प्रणाली के सावधान परीक्षण की आवश्यकता है. उदाहरण के लिए, यह drivable इलेक्ट्रोड का उपयोग करके microwires की रिकॉर्डिंग दूरी अनुमान लगाना संभव है. तारों, क्षेत्रीय शरीर रचना, और सत्र के पार न्यूरॉन की तरंग मापदंडों के भौतिक गुणों के साथ माना जाता है, एक एक तरंग सत्र 7,8,13 भर में बनाए रखा गया है कि उचित विश्वास के साथ निर्धारित कर सकते हैं.
चित्रा 1. REPRESENTAT"खोपड़ी खिड़की" (यानी कपाल - उच्छेदन), खोपड़ी शिकंजा, और जमीन तार के लिए प्लेसमेंट ive. ए) खोपड़ी (लाल), एक खोपड़ी खिड़की (वर्ग), और जमीन तार (हरा) के लिए एक contralateral छेद में से प्रत्येक प्लेट पर एक खोपड़ी पेंच की नियुक्ति दिखा खोपड़ी के एक पृष्ठीय देखें. खोपड़ी खिड़की योजना बना, निर्देशांक) बी के निर्धारण से परिभाषित पूर्वकाल और सी) पीछे औसत दर्जे का है और लक्ष्य क्षेत्र के लिए पार्श्व निर्देशांक (जैसे dorsolateral striatum). डी) ये निर्देशांक तो खिड़की की नियुक्ति निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है किया जाना चाहिए खोपड़ी के पृष्ठीय सतह पर. खोपड़ी खिड़की बी और सी में पहचान की औसत दर्जे का है और पार्श्व लक्ष्यों से मेल खाती है और भी बी और सी के बीच अग्रपश्चस्थ विमान में निर्दिष्ट सीमा तक फैला है ध्यान दें. ये निर्देशांक प्रत्येक व्यक्ति के लक्ष्य क्षेत्र के लिए विशिष्ट हो जाएगा. प्रतिनिधि locaएक 2 एक्स 8 सरणी में microwires का माहौल डी में दिखाया खोपड़ी खिड़की के भीतर छोटे डॉट्स का उपयोग कर दिखाया गया है. अंतिम dorsoventral तारों का समन्वय जो वे कम कर रहे हैं करने के लिए गहराई पर निर्भर करेगा. Paxinos और वाटसन 14 से संशोधित आंकड़े. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. अंतर प्रवर्धन की प्रक्रिया का एक उदाहरण. सर्वोच्च पैनल प्रवर्धन अंतर करने से पहले एक तंत्रिका संकेत (सिग्नल + शोर) का प्रतिनिधित्व करता है. निम्नलिखित अंतर प्रवर्धन, सभी चैनलों पर पाए जाते हैं कि बाहरी विद्युत संकेतों (शोर, मध्यम पैनल) को प्रभावी ढंग से रिकॉर्डिंग वाई से घटाया जा सकता हैतंत्रिका तरंग (; नीचे पैनल सिग्नल) के अलगाव को बेहतर बनाने के क्रम में एक निर्दिष्ट अंतर इलेक्ट्रोड के उपयोग के माध्यम से जोड़कर.
चित्रा 3. एक microwire सरणी से एक तार से दर्ज एक उदाहरण तंत्रिका तरंग (दाएं). हिस्टोग्राम (बाएं) प्रत्येक सत्र में तंत्रिका मुक्ति मनाया पूर्ववर्ती मिलीसेकेंड में कार्रवाई क्षमता की संख्या से पता चलता है. प्रत्येक बिन एक 1 millisecond अवधि का प्रतिनिधित्व करता है. हिस्टोग्राम कोई कार्रवाई क्षमता न्यूरॉन की प्राकृतिक दुर्दम्य अवधि (2 मिसे) में हुई यह दर्शाता है कि.
आंकड़ा4. सुर के अनुसार कोकीन आत्म - प्रशासन के दौरान हिचकते कि. एक न्यूरॉन का एक उदाहरण एक) 30 दूसरे डिब्बे में एक लंबे समय से पहुँच कोकीन स्वयं प्रशासन सत्र भर में एक न्यूरॉन की फायरिंग दर (Spikes/30 सेक). बी) इसी एक ही सत्र में गणना की दवा स्तर. संयोजन में, दवा स्तर में वृद्धि के तंत्रिका फायरिंग में एक अवसाद के साथ सहसंबद्ध होते हैं. सत्र ~ 425 मिनट पर समाप्त होता है जब इसके अनुसार, तंत्रिका फायरिंग कोकीन गिरावट के शरीर के स्तर के रूप में ठीक हो जाए.
चित्रा 5. Microwire प्रत्यारोपण के साथ दो जानवरों से Histological स्लाइस. ए) lesioned microwire टिप्स (नीला) खुलासा एक पोटेशियम ferrocyanide काउंटर दाग के साथ संयुक्त तटस्थ लाल का उपयोग कर एक Nissl दाग अनुभाग.एक microwire ऊतक में तार पटरियों का पालन करके तार टिप्स (नीला) के लिए नीचे प्रांतस्था से पता लगाया जा सकता है. पटरियों एक टुकड़ा या आसन्न स्लाइस की एक श्रृंखला. बी) एक पोटेशियम ferrocyanide काउंटर दाग के साथ मिलकर उदर pallidum का पता चलता है जो पदार्थ पी के लिए एक दाग अनुभाग, में पता लगाया जा सकता है. Immunohistological तकनीकों का प्रयोग, व्यक्तिगत सूक्ष्म तार विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर, या यहां तक कि एक विशेष नाभिक के विशिष्ट उप क्षेत्रों के भीतर स्थानीयकृत किया जा सकता है. चित्रा पदार्थ पी दाग का उपयोग उदर pallidum भीतर स्थानीयकृत एक microwire टिप (नीला) से पता चलता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table 1. List of Surgical Materials. | |||
| Gauze | Fisher (MooreBrand) | 19-898-144 | |
| Cotton Swabs | Fisher (Puritan) | S304659 | |
| Nembutal (Pentobarbital) | Sigma Aldrich | P3761 | |
| Atropine Methyl Nitrate | Sigma Aldrich | A0382 | |
| Baytril (Enrofloxacin) | Butler Shein (Bayer) | 1040007 | |
| Ketamine Hydrochloride | Butler Shein | SKU# 023061 | |
| Betadine (Povidone-Iodine) | Fisher (Perdue) | 19-066452 | |
| Stereotax | Kopf | Model 900 | |
| Cauterizing Tool | Stoelting | 59017 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | SMZ445 | |
| Dental Drill | Buffalo | 37800 | |
| Bacteriostatic Saline | Bulter Schein | 8973 | |
| Jewlers Screws | Stoelting | 51457 | |
| Microwire Array | Microprobes | Custom (Flexible) | |
| Ground Wire | Omnetics | Custom Plug | |
| Dental Acrylic | Fisher (BAS) | 50-854-402 | |
| Absorbable Sutures | Fisher (Ethicon) | NC0258473 | |
| Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant) | Fisher (Henry Schein) | 008897 | |
| Table 2. List of Surgical Instruments. | |||
| 2x Microforceps | George Tiemann Co. | #160-57 | Multi-use (e.g. clearing debris in skull window) |
| 2x Forceps | George Tiemann Co. | #160-93 | Multi-use (e.g. tying sutures) |
| 6x Hemostats | George Tiemann Co. | #105-1125 | Clamp and open incision |
| 1x Small scissors | George Tiemann Co. | #105-411 | Cut sutures after tying |
| 1x Tissue forceps | George Tiemann Co. | #105-222 | Holding tissue while suturing |
| 1x Needle holder | George Tiemann Co. | #105-1259 | Holding suture needle |
| 1x Scalpel holder (with #11 blade) | George Tiemann Co. | #105-80 (w/ #105-71 blade) | Making skull incision |
| 1x #22 Scalpel blade | George Tiemann Co. | #160-381 | Shaving scalp |
| 1x Surgical Spatula | George Tiemann Co. | #160-718 | Scraping skull to clear tissue on skull |
| Machine/Jewelers Screws | Various | N/A | 0/80 x 1/8” |
| Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals. | |||
| Microwire Array & Connector | Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD) | N/A (Part No. based on array characteristics) | Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc. |
| Unity-Gain Harness/Headstage | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1200 | Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals. |
| Commutator (and Optional Fluid Swivel) | Plastics One, Inc. (Roanoke, VA) | SL18C | Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp |
| Pre-amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1198 | Differentially amplifies neural signals against a reference electrode. |
| Filter and Amplifier | M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ) | Proj 1199 | Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal. |
| Acquisition Computer | EnGen (Phoenix, AZ) | N/A (Custom Build) | Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition. |
| A/D Card | Data Translation (Marlboro, MA) | DT-3010 | Digitizes neural signals for computer sampling. |
| Digital I/O Card | Measurement Computing (Norton, MA) | PCI CTR-05 | Acquires behavioral inputs and outputs |
References
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- Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. (3-4), 106-103 (2012).
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- Ghitza, U. E., et al. Persistent cue-evoked activity of accumbens neurons after prolonged abstinence from self-administered cocaine. J. Neurosci. 23 (19), 7239-7245 (2003).
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- Root, D. H., et al. Slow phasic and tonic activity of ventral pallidal neurons during cocaine self-administration. Synapse. 66 (2), 106-127 (2012).
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- Tang, C. C., et al. Decreased firing of striatal neurons related to licking during acquisition and overtraining of a licking task. J. Neurosci. 29 (44), 12952-12961 Forthcoming.
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press/Elsevier. (1997).
