Um Procedimento para Implantação de Arrays organizado de microfios para gravações a única unidade em Awake, comportando-se Animais

Summary

Implantar matrizes organizados de microfios para utilização em gravações eletrofisiológicas unitárias apresenta uma série de desafios técnicos. Métodos para a realização desta técnica e os equipamentos necessários são descritos. Além disso, discute-se o uso benéfico de matrizes microfios organizados para gravar a partir de sub-regiões neurais distintos, com alta seletividade espacial.

Abstract

Em gravações eletrofisiológicas vivo no acordado, comportando animais fornecem um método poderoso para a compreensão da sinalização neural ao nível de uma única célula. A técnica permite que pesquisadores para examinar temporal e regionalmente padrões de disparo específicas, a fim de correlacionar os potenciais de ação gravadas com o comportamento em curso. Além disso, as gravações unitárias podem ser combinados com uma infinidade de outras técnicas, a fim de produzir explicações abrangentes da função neural. Neste artigo, descrevemos a anestesia e preparação para a implantação microfio. Posteriormente, enumerar os equipamentos necessários e passos cirúrgicos para inserir de forma precisa uma matriz microfio em uma estrutura alvo. Por fim, descrevemos brevemente o equipamento usado para gravar a partir de cada eletrodo individual na matriz. Os conjuntos de microfios fixos descritos são bem adaptados para a implantação crónica e permitir a gravação de dados longitudinais neurais em quase qualquer preparati comportamentaisna. Discutimos traçando trilhas de eletrodos para triangular as posições microfios, bem como maneiras de combinar implantação microfio com técnicas de imuno-histoquímica, a fim de aumentar a especificidade anatómica dos resultados gravados.

Introduction

Registros eletrofisiológicos permitirá aos cientistas estudar as propriedades elétricas das células biológicas. No sistema nervoso central, onde impulsos elétricos servir como um mecanismo de sinalização, essas gravações são de particular importância para a compreensão da função neural ^1-2. Durante as gravações unitárias em comportando animais, um microeletrodo que foi inserido no cérebro é capaz de registrar as mudanças na geração de um neurônio de potenciais de ação ao longo do tempo.

Embora muitas técnicas permitem gravar a atividade cerebral, unidade única eletrofisiologia é um dos métodos mais precisos, permitindo resolução no nível neurônio único. Quando um elevado grau de especificidade espacial é desejada, microfios pode ser usado para atingir ou núcleos sub-conjuntos de células dentro do brain3 discretas. Gravações de uma única Unidade também se beneficiam com alta resolução temporal como gravações são precisos ao nível do microssegundo. E, in vivo agravações vigília permitir interações circuito intactas, com o meio natural de aferentes e eferentes projeções, química sistêmica e influências hormonais e parâmetros fisiológicos. Os sinais neurais são derivados de entrada sensorial, comportamentos motores, o processamento cognitivo, neuroquímica / farmacologia, ou alguma combinação. Assim, a segregação de sensoriais, motoras, cognitivas e químicos influências exige experiências bem concebidas com contingências e controles eficazes que podem permitir a avaliação de cada uma das influências acima mencionadas. Ao todo, as gravações em animais se comportando permitir experimentadores para observar a integração de múltiplas fontes de informação dentro de um circuito em funcionamento e para derivar um modelo mais abrangente de função do circuito.

Gravações de uma única Unidade também sofrem de uma série de desvantagens do que qualquer pesquisador deve estar ciente. Em primeiro lugar, as gravações podem ser difíceis de realizar. De facto, as propriedades de the amplificadores headstage e os microfios implantados que permitem a especificidade espacial e temporal nessas gravações também faz gravações suscetíveis à influência de sinais elétricos estranhas (ou seja, "ruído" elétrico). Assim, a capacidade de resolver problemas em um sistema eletrofisiológico exige uma compreensão técnica dos princípios e aparelhos eletrofisiológicos bem desenvolvida. É também importante notar que, em certas circunstâncias, os sinais eléctricos registados em gravações extracelulares podem representar a soma de vários sinais neurais. Além disso, a generalização de actividade de uma única unidade de actividade da população de uma região alvo muitas vezes pode ser limitada pelo grau de heterogeneidade celular dentro da região alvo (mas ver Cardin ^4). Por exemplo, os eléctrodos podem ser inclinados para a gravação de neurónios de saída de grande amplitude no lugar de outras células. A interpretação das gravações unitárias é aumentadacombinando gravações com outras técnicas, incluindo, mas não limitado a, eléctrico (ortodrômica ou antidrômica), estimulação química (por exemplo, iontoforese ou receptor designer) ou optogenetic ^4, inativações neurais temporários, exames sensório-motores ^5, os procedimentos de desconexão, ou imuno-histoquímica ^3.

No protocolo que se segue, enumerar os materiais e as medidas necessárias para implantar uma matriz microfio organizado no rato (embora o protocolo pode ser adaptado para o uso em outras espécies). O procedimento e estilo de matrizes fixos utilizados em nosso laboratório têm demonstrado confiança para gravações longitudinais e pode sustentar gravações do mesmo neurônio para ao longo do tempo de um mês ^6-8. Isso faz com que este procedimento ideal para examinar as respostas fásicas aos estímulos experimentais, mudanças plásticas nas respostas neurais, ou mecanismos de aprendizagem e motivação.

Protocol

O máximo cuidado deve ser tomado para manter as condições de assepsia (conforme descrito no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório ⁹⁾ durante a preparação para a realização e o procedimento a seguir. O protocolo a seguir é de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foi aprovado pelo Animal Care e Use Comitê Institucional, da Universidade Rutgers. Estima-se que os procedimentos subsequentes irão requerer 3-6 horas para completar.

Implantação da Matriz Microwire:

1. Animais lugar sob anestesia, utilizando 50 mg / kg de pentobarbital de sódio (ip) e administrar 10 mg / kg de atropina, nitrato de metilo (IP; glicopirrolato pode ser substituído) e 0,25 mg de penicilina (300.000 U / mL im) para manter a função respiratória e prevenir a infecção , respectivamente.
   Nota: Com o comprimento de 3-6 horas da cirurgia de implantação, pentobarbital de sódio é usado porque é eficaz em termos de custos e limita a exposição humana aanestésicos (como pode ocorrer com o uso prolongado de anestésicos de gás) enquanto continua a fornecer anestesia de longa duração. A substituição de outros anestésicos é aceitável.
2. Verifique se a anestesia começou a produzir efeitos utilizando o teste de cauda pitada antes de prosseguir.
3. Conforme necessário, dar injecções de cloridrato de cetamina (60 mg / kg IP) e pentobarbital de sódio (5-10 mg / kg IP) alternando para manter a anestesia durante toda a cirurgia.
4. Raspar o couro cabeludo com uma lâmina de bisturi n º 22.
5. Desinfetar o couro cabeludo raspado com iodopovidona.
6. Dê injeções subcutâneas de bupivacaína (~ 1 mg / kg SC, distribuídos por quatro locais de injecção) para anestesiar localmente no couro cabeludo. Permitir 5-10 min para o anestésico local para fazer efeito.
7. Coloque um lubrificante oftalmológico sobre os olhos para manter a umidade durante a anestesia.
8. Fixe o animal para as barras de ouvido e nariz braçadeira de um aparelho estereotáxico.
9. Use marcos visuais (por exemplo, uma barra horizontal na sterquadro eotaxic) para aproximadamente nível da cabeça do animal. Este passo só é feito para aproximadamente nível do crânio.
10. Realizar uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo utilizando uma lâmina de bisturi # 11 montado sobre um suporte de bisturi. A incisão deve se estender a partir de apenas atrás das orelhas para a parte posterior do osso nasal.
11. Usando uma espátula de dissecação, limpar o crânio de todo o tecido restante até dois sulcos lateral do crânio e do cume posterior do crânio foram alcançados.
12. Puxe a pele ao redor da incisão usando um número de hemostats (6x).
13. Limpe o crânio de qualquer sangue e deixe-a secar. Se ocorrer alguma hemorragia restante, encerrar o sangramento residual com uma ferramenta de cauterização pequeno. Assegurar que o crânio permanece limpo e seco permite que o acrílico dental utilizado em passos subsequentes para se ligar ao crânio permanentemente.
14. Mark bregma e lambda (Figura 2D), interpolando a intersecção das suturas do crânio. Um mic dissecandoroscope é necessário marcar com precisão estas posições.
15. Prenda um pequeno objecto pontiagudo (por exemplo, um pino ou dental broca) para um braço estereotáxico e abaixá-lo para determinar a dorsal / ventral (DV) de coordenadas do bregma e lambda.
16. Ajustar a braçadeira até que o nariz coordena o DV para bregma e lambda são de 100 mm (0,1 mm), de um ao outro.
17. Uma vez nivelado, gravar o anterior / posterior (AP), medial / lateral (ML) e DV coordenadas bregma, juntamente com a posição do grampo de nariz. Checar as coordenadas de precisão, como o restante da cirurgia depende da precisão dessas coordenadas.
18. Use as coordenadas medidas para calcular o ML e coordenadas AP para os quatro cantos do "janela crânio" em relação ao bregma (isto é craniotomia, Figura 1). A janela de crânio é um retângulo precisamente posicionado através do qual a matriz microfio vai passar.
19. Use as coordenadas calculadas para marcar ocoordena janela crânio no crânio usando um acessório estereotáxica pontiagudo e caneta de tinta. Para obter marcas precisas, aplicam-se apenas uma pequena quantidade de tinta para a ponta do instrumento de marcação com um aplicador de algodão.
20. Broca para fora da janela do crânio através da remoção do osso de uma série de pequenas camadas.
    1. Comece por perfuração dos cantos marcados da janela onde as marcas foram colocadas.
    2. Em seguida, conecte os cantos e delinear a janela.
    3. Por fim, limpar a área dentro do contorno até a profundidade de dura-máter. O furo tem de ser mais largo (isto é, chanfrada) abaixo das camadas superficiais do crânio para garantir que a janela mantém uma largura apropriada de cima para baixo.
21. Use micropinças para remover cuidadosamente chips de qualquer osso remanescente, detritos, ou dura-máter dentro da janela do crânio. Este passo é extremamente importante, uma vez que estes bits de material pode comprometer a integridade da matriz durante a descida. Depois de limpo, deve-se manter ªe janela úmido com solução salina bacteriostática para o restante da cirurgia.
22. Coloque marcas no crânio por 5 parafusos de crânio e um fio terra (Figura 1). Estas posições irão variar consoante a região do cérebro alvo. O andar de entrada será mais seguro se um parafuso é colocado em cada um dos cinco ossos do crânio. Coloque ambos os parafusos do crânio e fio terra em locais que não interfiram com a colocação disposição microfio.
23. Faça furos para os parafusos do crânio e aperte os parafusos no lugar. Os parafusos devem ser reduzidos até que apenas 3-4 tópicos estão mostrando (ou, se estiver usando diferentes dos recomendados parafusos, profundo o suficiente para atravessar a espessura do crânio para promover a estabilidade matriz, mas não muito profunda, de modo a danificar córtex). Limpe as roscas dos parafusos após a colocação.
24. Faça um furo para o fio terra. Abaixe o fio lentamente (mais de 1-2 min) para o DV-alvo coordenar e fixar o fio no lugar usando o acrílico dental.
25. Adicionar acrílico em torno dos tópicosdos parafusos do crânio. Antes de a seca de acrílico, remova qualquer excesso de cimento que corre para longe do fio terra ou parafusos do crânio. Permita 15 minutos para o acrílico dental para secar / endurecer.
26. Anexar a matriz para o braço estereotáxico. Nível da matriz e orientá-lo para que ele irá diretamente passar dos limites da janela do crânio.
27. Coloque salina na janela do crânio de modo a que fique ao nível do crânio. Abaixe a matriz até que ele cria uma covinha na solução salina. Este coordenar é usado como nível crânio para a matriz. Utilize este valor para calcular a coordenada DV final do array.
28. Abaixe o array lentamente até atingir coordenar a sua DV final. Pare cada 1mm de abaixamento e esperar durante vários minutos a fim de permitir que o tecido cerebral de se recuperar de ondulações e dissolva a porção de fundo do polietileno glicol (PEG) na matriz (PEG é utilizada para manter temporariamente os fios na sua conformação ao mesmo tempo reduzindo , e dissolve-se lentamente na solução salina).
29. Quando a matriz é 1 milímetrolonge do alvo, abaixá-lo mais lentamente até que o objectivo final seja alcançado. Baixando a 0,1-0,2 mm de cada vez antes de permitir que o tecido em repouso por um período de 5 min destina-se a manter o tecido no local alvo, bem como as conexões sinápticas proximais. Se o equipamento estiver disponível, reduzindo a precisão da matriz pode ser auxiliada usando um manipulador motorizado.
30. Dissolver o restante PEG e usar acrílico dental para cimentar os microfios no lugar. Adicionar várias camadas de cimento para garantir que os fios são seguras e, em seguida, permitir que 15-20 minutos para que o cimento endurece antes de prosseguir. Isso garante que os fios não será empurrado da sua colocação definitiva.
31. Construir o restante headstage do animal usando o acrílico dental. Use o acrílico para encerrar os parafusos crânio, fio terra, e conector para os microfios. Permitir que o chapéu acrílico para endurecer suficientemente antes de prosseguir.
32. Suturar a incisão no couro cabeludo com suturas absorvíveis e administrar 2 ml of soro fisiológico bacteriostático (sc) para restabelecer a hidratação de uma cirurgia.
33. Remover o animal a partir das barras de ouvido e colocar o assunto em uma área limpa. Observar o animal com frequência durante a recuperação pós-operatória até a termorregulação e locomoção se recuperaram. Após a recuperação da anestesia, mover o animal para habitação única para o restante da recuperação pós-cirúrgica.
34. Dê animais monitorização pós-operatória diária e cuidados nos dias após o procedimento. A recuperação deste procedimento é o ideal quando sete ou mais dias são permitidos.
35. Dê animais injeções de carprofeno (5mg/kg) e enrofloxacina (5-10 mg / kg) ou seus equivalentes durante a recuperação de acordo com o esquema recomendado pelo veterinário responsável.

Representative Results

A lista de equipamentos utilizados por este laboratório para a gravação de sinais eletrofisiológicos podem ser encontrados na Tabela 3. Após a recuperação da cirurgia,-unidades individuais são registrados conectando um headstage de ganho unitário no conector implantado. Este andar de entrada é ligado através de um cabo a um comutador, o qual é capaz de rotação livre, sem quebras na gravação electrofisiológico através da utilização de anéis deslizantes eléctricos. O comutador permite sujeitos a mover-se livremente enquanto que a gravação durante o comportamento, que é uma das principais vantagens desta preparação. Os sinais são então alimentados através de um pré-amplificador (10x ganho) que é utilizado para amplificar o sinal diferencial em cada um dos eléctrodos contra o ruído ambiente num eléctrodo seleccionada porque não exibem um sinal de unidade. Gravações diferenciais são utilizados para amplificar a diferença instantânea entre as duas tensões. Porque ambos os fios gravar o ruído ambiente, aproximadamente, igualmente, a sua oposiçãopolaridades te efetivamente permitir a subtração do ruído ambiente a partir de gravações neurais (Figura 2). Finalmente, os sinais são pass-band filtrada (450 Hz a 10 kHz; roll off -1,5 dB / oitava a 1 kHz e -6 dB / oitava em 11 kHz) e 700x amplificado antes de ser digitalizados usando um computador com uma placa A / D (frequência de amostragem de 50 kHz / fio) e armazenados para análise offline.

Em software, as formas de onda são frequentemente amostrados usando um método de detecção do limiar. Assim, os sinais que passam de um dado limiar de tensão são digitalizadas e armazenadas. Ainda assim, existe uma taxa inerente de falsos positivos, nos quais artefactos eléctricos passam através do limiar, de filtragem e de amplificação diferencial, e são amostrados. Estas formas de onda não neurais são subtraídos post-hoc usando software de triagem pico que permite descargas amostrados a serem classificados com base em seus parâmetros (por exemplo, tensões de amplitude, de pico e vale, etc.) E, posteriormente, permite a eliminação de el"ruído" ectrical e a selecção do sinal neuronal (Figura 3). As formas de onda são incluídos para análise se 1) Formas de onda apresentam padrões canônicos de atividade neural, incluindo um potencial de ação claramente definidos e depois hiperpolarização (Figura 3; painel direito), 2) a amplitude de um putativo exposições de forma de onda neurais pelo menos um sinal 02:01 : ruído (ou seja, é claramente separável da banda de ruído do canal; amplitude de banda de ruído = aprox .. 50 mV); 3) Parâmetros permanecer estável durante toda a sessão e 4) um intervalo interspike (ISI) histograma mostra que não ocorreram descargas durante período refratário natural do neurônio (ou seja, ~ 2 ms; painel Figura 3 esquerda).

Descargas neuronais pode então ser correlacionado com eventos comportamentais (por exemplo, a alavanca de responder) que estão registados como marcas de tempo através da utilização de uma entrada-saída digital do cartão (I / O). Estes tempo-selos podem ser usados ​​para criar os histogramas de tempo peri-acontecimento (PETHs; Figura 4A), que são usados ​​para exibir as descargas neuronais que ocorrem em um intervalo de tempo especificado em torno de um evento comportamental específica. Nosso laboratório tem tipicamente examinadas disparo neural da ordem de horas (Tonic ^10), minutos (Slow-fásicos ^11), e segundos / milissegundos (Rapid-Phasic ^12). Disparo Tonic é normalmente usado para examinar o maior número de eventos globais em uma sessão. Por exemplo, muitas vezes usamos isso para comparar taxas de disparo dos neurônios quando os animais são auto-administração de drogas, ou seja predrug contra taxas de disparo de drogas. Análises fásicas lentas são freqüentemente usados ​​para examinar disparo durante lenta mudança de eventos, como a decadência farmacológica de uma droga ao longo de minutos. Finalmente, as análises rápidas fásicas são utilizadas para eventos mais instantâneos como uma resposta operante ou o início de uma pista experimental.

A Figura 4 mostra um histograma de tónico disparocom uma contagem de descargas em 30 caixas de segundo através de uma sessão de gravação durante toda a cocaína auto-administração. A célula exemplo mostrado é sensível a alterações nos níveis de corpo de cocaína e torna-se inibido (Figura 4A) como o nível do corpo do animal de aumentos de cocaína (Figura 4B), mas retorna à sua taxa de disparo original como o nível de cocaína cai após a auto- contingências de administração ter terminado. Dependendo região-alvo, os neurônios podem ser sensíveis aos efeitos farmacológicos, ou qualquer número de eventos comportamentais, incluindo associados e recompensa pistas ^6, a entrada sensório-motor ¹³ ou abordagem motivada ^3.

Sob as condições corretas, é possível gravar o mesmo neurônio para muitas sessões. No striatum, os neurónios são distribuídas homogeneamente (80% de fios de produzir somente uma única unidade e as células não são colocadas em camadas ou bem agrupados) e relativamente pequenos sinais que ove rapidamente deterioraçãodistância r. Sob estas condições, o nosso laboratório tem sido capaz de gravar o mesmo neurónio no estriado por várias semanas. É importante ressaltar que nem todos os neurônios podem ser verificadas através de sessões e nem todos os neurônios são mantidos ao longo do tempo. Determinar a capacidade de obter estes tipos de gravações longitudinais requer cuidadosa análise do sistema eletrofisiológico. Por exemplo, é possível estimar a distância de gravação de microfios usando eléctrodos dirigíveis. Quando considerado juntamente com as propriedades físicas dos fios, anatomia regional e os parâmetros da forma de onda do neurônio entre sessões, pode-se determinar com confiança razoável de que uma forma de onda tem sido mantido entre sessões ^7,8,13.

Figura 1. Representative colocações para a "janela crânio" (ie craniotomia), parafusos do crânio, e fio terra. A) Uma vista dorsal do crânio, mostrando a colocação de um parafuso de crânio sobre cada placa do crânio (vermelho), uma janela do crânio (quadrado), e um furo contralateral para o fio terra (verde). Ao planear a janela do crânio, as coordenadas devem ser definidos através da determinação da B) anterior e C) medial posterior e coordenadas laterais para a região-alvo (por exemplo, corpo estriado dorsolateral). D) Estas coordenadas pode, então, ser utilizado para determinar a posição da janela sobre a superfície dorsal do crânio. Note que a janela do crânio corresponde às metas medial e lateral identificados em B e C e também abrange o intervalo especificado no plano ântero-posterior entre B e C. Estas coordenadas serão específicas para cada região alvo individual. Loca Representanteções dos microfios em uma matriz 2 x 8 são mostrados usando pequenos pontos dentro da janela crânio mostrado em D. O dorsoventral cota final dos fios dependerá da profundidade a que eles são reduzidos. Figuras modificados de Paxinos e Watson ^14. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Figura 2. Uma ilustração do processo de amplificação diferencial. O painel superior representa um sinal neural antes do diferencial de amplificação (sinal + ruído). Após a amplificação diferencial, os sinais elétricos estranhos que são encontrados em todos os canais (ruído; painel do meio) pode ser efetivamente subtraído wi gravaçãores através da utilização de um eléctrodo diferencial especificado, a fim de melhorar o isolamento da forma de onda neural (Signal; painel inferior).

Figura 3. Um exemplo de forma de onda neural (direita) gravado a partir de um fio de uma matriz microfio. O histograma (esquerda) mostra o número de potenciais de ação nos milésimos de segundo que antecede cada descarga neural observado na sessão. Cada bin representa um período de 1 milissegundo. O histograma demonstra que há potenciais de ação ocorreu em período refratário natural do neurônio (2 ms).

Figura4. Um exemplo de um neurônio que está tonicamente inibida durante cocaína auto-administração. A) A taxa de queima (Spikes/30 seg) de um neurônio em uma sessão cocaína auto-administração de acesso longa em 30 caixas de segundo. B) O correspondente nível de droga calculado através da mesma sessão. Em combinação, aumenta o nível de droga são correlacionados com uma depressão no disparo neural. Assim, quando a sessão termina em ~ 425 min, disparo neural recupera como os níveis do corpo de queda de cocaína.

Figura 5. Cortes histológicos de dois animais com implantes de microfios. A) Uma seção Nissl coradas utilizando neutro combinado com um contador mancha ferrocianeto de potássio revelando dicas microfios lesionados (azuis) vermelho.A microfio pode ser rastreada desde o córtex até as pontas do fio (azul), seguindo as trilhas de arame no tecido. Trilhas podem ser rastreados em uma única fatia ou uma série de fatias adjacentes. B) A seção corados para a substância P, o que revela o pallidum ventral, juntamente com um contador mancha ferrocianeto de potássio. Usando técnicas de imuno-histológicos, micro-fios individuais podem ser localizados dentro de regiões específicas do cérebro, ou mesmo dentro de sub-regiões específicas de um núcleo particular. Figura mostra uma ponta microfio (azul) localizada dentro do pallidum ventral usando o P mancha Substância.

Discussion

Gravações extracelulares representam uma técnica experimental poderosa que pode ser incorporado em quase qualquer preparação experimental em neurociência. Os fios que foram implantados em matrizes organizados pode ser rastreada como os seus veios passam através do cérebro e para a sua zona alvo (Figura 5A). Quando uma lesão pequena, pós-experimental é criada na ponta microfio não isolados para criar um pequeno depósito de ferro a partir do fio de aço inoxidável, pode-se marcar com precisão a localização da ponta do microfio, sem isolamento (em que o único aparelho foi registada) usando uma solução de de 5% de ferrocianeto de potássio e 10% de HCl (Figuras 5A e 5B; pontos azuis). Assim, pode facilmente usar uma série de fatias cerebrais subsequentes para recriar a posição de toda a matriz no interior do cérebro. Finalmente, as técnicas acima mencionadas podem ser facilmente combinada com imuno-histoquímica, a fim de aumentar a especificidade do espaço de gravação, de modopara verificar canais segmentados, e até mesmo, a fim de estudar as diferenças sub-regionais dentro de um único núcleo alvo ³ (Figura 5B).

Para alcançar a especificidade espacial desejada, conjuntos de microfios precisam ser projetados e implantados com cuidado. Em primeiro lugar, o espaçamento das linhas e colunas dentro da matriz deve ser projetado especificamente para a região de interesse. Matrizes que são muito longos ou largos para o destino desejado pode diminuir a precisão ou produzir um grande número de fios que caem na fronteira entre dois núcleos adjacentes. Ao mesmo tempo, microfios espaçadas muito de perto, juntos, podem proibir uma demarcação separada de cada eletrodo. Em segundo lugar, as matrizes de microfios devem ser manuseados com cuidado, a fim de manter a integridade da matriz. Matrizes de eletrodos simples são produzidos usando, fios de cabelo, como finas que podem ser facilmente danificados ou empurrado a partir de sua configuração quando contatado. As qualidades desses fios são ideais para reduzir os danos causados ​​to tecido no percurso de aproximação para um alvo e também de permitir que os fios para trocar em conjunto com pequenos movimentos do cérebro. Assim, é normalmente aconselhável para armazenar matrizes em um local seguro e evitar a remoção de matrizes de suas capas protetoras até pouco antes da implantação. Além disso, é preciso ter cuidado quando esterilização dos conjuntos de microfios. Em alguns casos, a autoclavagem de eléctrodos podem ser aceitáveis. No entanto, o óxido de etileno ou sanitização UV pode ser preferível proteger as matrizes frágeis. Finalmente, o eléctrodo de metal e de isolamento, e o diâmetro de cada um, deve ser cuidadosamente considerada. Por exemplo, somente os eléctrodos que contêm ferro (por exemplo, aço inoxidável) será capaz de produzir reacções de azul da Prússia para demarcação individual de cada microfio, dentro da matriz.

Na ocasião, microfios na matriz irá desviar sua configuração durante a descida devido a obstruções despercebidos (por exemplo, fragmentos de crânio na janela do crânio) ou pobre handling. Nesses casos, tal microfio muitas vezes pode ainda ser rastreado até a sua ponta (embora ele provavelmente vai estar fora da região de destino). No caso de um exemplo, resultar em qualquer microfio numerados na matriz não pode ser verificado, que é importante para a integridade da experiência que este animal ser removido a partir do conjunto de dados. Má interpretação da posição de um microfio indivíduo pode permitir que seus sinais neurais para complicar ou interpretação corrupto dos dados.

Durante a implantação, a precisão da janela crânio e alinhamento de matriz também são críticos para atingir a precisão. Janelas do crânio deve ser feita ampla o suficiente para permitir a matriz para passar sem dobrar ou fios prejudiciais. Por outro lado, a janela é também utilizado para guiar com precisão o conjunto para a posição do alvo e, portanto, devem ser perfurados com precisão em todas as dimensões. Quando estiver pronto para implantação, é preciso também ter a certeza de que a matriz é de prumo com a janela crânio em todas as dimensões. Isto é,uma ligeira inclinação da matriz em qualquer dimensão pode causar a matriz, quer parcialmente ou totalmente perca o núcleo alvo. Por fim, um cuidado especial deve ser tomado quando abaixar o primeiro 1-3 mm. É durante a primeira redução que pedaços de detritos que passaram despercebidos dentro da janela do crânio pode comprometer a integridade da matriz e perturbar o caminho de microfios. Se o caminho dos microfios está obstruído, enquanto eles estão lentamente reduzida, pode-se ver microfios curva ou arco sob uma ligeira ampliação antes de a matriz incorre qualquer dano (por exemplo, usando uma lupa). Neste ponto, microfios pode ser recolhido e detritos podem ser apagados a partir da janela antes de continuar com a implantação.

Por último, mas não menos importante, implantação bem-sucedida de conjuntos de microfios requer atenção especial para manter uma sala de cirurgia asséptica e prestação de cuidados pós-operatória completa. Quando combinada com as precauções acima referidas, as gravações viáveis ​​podem ser obtidas a partir deregiões de interesse por mais de um mês, temos gravações verificado até 40 dias após a cirurgia ^6. Talvez o mais importante, a longevidade dessas gravações oferece a oportunidade de estudar os circuitos funcionais discretos dentro do ambiente complexo de influências hormonais elétrica, química e e responder a perguntas vitais sobre o papel desses circuitos na aprendizagem e motivação.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. List of Surgical Materials.
Gauze	Fisher (MooreBrand)	19-898-144
Cotton Swabs	Fisher (Puritan)	S304659
Nembutal (Pentobarbital)	Sigma Aldrich	P3761
Atropine Methyl Nitrate	Sigma Aldrich	A0382
Baytril (Enrofloxacin)	Butler Shein (Bayer)	1040007
Ketamine Hydrochloride	Butler Shein	SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine)	Fisher (Perdue)	19-066452
Stereotax	Kopf	Model 900
Cauterizing Tool	Stoelting	59017
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ445
Dental Drill	Buffalo	37800
Bacteriostatic Saline	Bulter Schein	8973
Jewlers Screws	Stoelting	51457
Microwire Array	Microprobes	Custom (Flexible)
Ground Wire	Omnetics	Custom Plug
Dental Acrylic	Fisher (BAS)	50-854-402
Absorbable Sutures	Fisher (Ethicon)	NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant)	Fisher (Henry Schein)	008897
Table 2. List of Surgical Instruments.
2x Microforceps	George Tiemann Co.	#160-57	Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps	George Tiemann Co.	#160-93	Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats	George Tiemann Co.	#105-1125	Clamp and open incision
1x Small scissors	George Tiemann Co.	#105-411	Cut sutures after tying
1x Tissue forceps	George Tiemann Co.	#105-222	Holding tissue while suturing
1x Needle holder	George Tiemann Co.	#105-1259	Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade)	George Tiemann Co.	#105-80 (w/ #105-71 blade)	Making skull incision
1x #22 Scalpel blade	George Tiemann Co.	#160-381	Shaving scalp
1x Surgical Spatula	George Tiemann Co.	#160-718	Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws	Various	N/A	0/80 x 1/8”
Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals.
Microwire Array & Connector	Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)	N/A (Part No. based on array characteristics)	Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc.
Unity-Gain Harness/Headstage	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1200	Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (and Optional Fluid Swivel)	Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)	SL18C	Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-amplifier	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1198	Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter and Amplifier	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1199	Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer	EnGen (Phoenix, AZ)	N/A (Custom Build)	Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card	Data Translation (Marlboro, MA)	DT-3010	Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card	Measurement Computing (Norton, MA)	PCI CTR-05	Acquires behavioral inputs and outputs