Ein Verfahren für die Implantation von Mikrodrähte Organisierte Arrays für Einzel-Einheit Recordings in Awake, Behaving Tiere

Summary

Die Implantation organisiert Arrays von Mikrodrähten für den Einsatz in Single-Unit-elektrophysiologischen Ableitungen präsentiert eine Reihe von technischen Herausforderungen. Verfahren zum Durchführen dieses Verfahrens und die notwendige Ausrüstung beschrieben. Auch ist der wirtschaftliche Einsatz der organisierten Mikroarrays aus unterschiedlichen neuronalen Teilbereiche mit hoher räumlicher Selektivität aufzeichnen diskutiert.

Abstract

In vivo elektrophysiologischen Ableitungen im Wach, verhalten Tier bieten eine leistungsfähige Methode für das Verständnis der neuronalen Signal auf Einzelzellebene. Die Technik ermöglicht Experimentatoren zeitlich und regional, um aufgezeichnete Aktionspotentiale mit laufenden Verhalten korrelieren Prüfung spezifischer Feuermuster. Darüber hinaus können Single-Unit-Aufnahmen mit einer Vielzahl von anderen Techniken, um eine umfassende Erläuterung der neuronalen Funktion produzieren kombiniert werden. In diesem Artikel beschreiben wir die Anästhesie und die Vorbereitung für Mikro Implantation. Anschließend aufzuzählen wir die notwendige Ausrüstung und OP-Schritte, um eine Mikroarray in eine Zielstruktur genau einfügen. Schließlich beschreiben wir kurz die verwendet werden, um aus jeder einzelnen Elektrode im Array aufnehmen Ausrüstung. Die beschriebenen festen Mikroarrays für chronische Implantation gut geeignet und ermöglichen eine Längs Aufnahmen von neuronalen Daten in fast allen Verhaltens preparatiauf. Wir diskutieren Tracing Elektrodenbahnen auf Mikropositionen sowie Möglichkeiten, um Mikroimplantation mit immunhistochemischen Techniken, um die anatomischen Besonderheiten der aufgezeichneten Ergebnisse erhöhen kombinieren Triangulierung.

Introduction

Elektrophysiologische Aufzeichnungen können Wissenschaftler die elektrischen Eigenschaften von biologischen Zellen zu untersuchen. Im zentralen Nervensystem, in dem elektrische Impulse dienen als Signalmechanismus, sind diese Aufnahmen für das Verständnis der neuronalen Funktion ^1-2 besonderer Bedeutung. Während Single-Unit-Aufnahmen verhalten Tiere, ist ein Mikroelektroden, die in das Gehirn eingeführt worden ist in der Lage, Veränderungen in der Erzeugung von Aktionspotentialen eines Neurons im Laufe der Zeit zu erfassen.

Während viele Techniken erlauben es, Hirnaktivität aufzeichnen, ist Single-Unit-Elektrophysiologie eine der genauesten Methoden, indem Beschluss der einzelnen Neurons Ebene. Wenn eine hohe räumliche Spezifität gewünscht wird, kann verwendet werden, um diskrete Mikrodrähte Teilkerne oder Ensembles von Zellen innerhalb des brain3 Ziel. Single-Unit-Aufnahmen profitieren auch von hohen zeitlichen Auflösung, wie Aufnahmen sind präzise im Mikrosekundenbereich. Und in vivo eineWake-Aufnahmen ermöglichen intakt Schaltung Wechselwirkungen mit der natürlichen Milieu der zu-und abführenden Projektionen, systemische chemische und hormonelle Einflüsse und physiologische Parameter. Neuronale Signale werden von sensorischen Input, Motor-Verhalten, kognitive Verarbeitung, Neurochemie / Pharmakologie, oder eine Kombination abgeleitet. Dementsprechend ist die Trennung von sensorischen, motorischen, kognitiven und chemische Einflüsse erfordert durchdachte Experimente mit effektiven Eventualitäten und Steuerungen, die für die Beurteilung der jede der oben genannten Einflüsse lassen kann. Alles in allem Aufnahmen im lebenden Tier ermöglichen Experimentatoren, die Integration von mehreren Quellen von Informationen innerhalb einer funktionierenden Kreislauf zu beobachten und ein umfassenderes Modell der Schaltungsfunktion abzuleiten.

Single-Unit-Aufnahmen auch aus einer Reihe von Nachteilen, von denen jeder Experimentator sollte bewusst sein, zu leiden. In erster Linie können Aufnahmen schwierig durchzuführen sein. Tatsächlich Eigenschaften the heads Verstärker und die implantierten Mikrodrähten, die für die räumliche und zeitliche Spezifität in diesen Aufnahmen zu ermöglichen Aufnahmen macht auch anfällig für den Einfluss von Fremd elektrische Signale (dh elektrisches "Rauschen"). Dementsprechend ist die Fähigkeit, Probleme in einer elektrophysiologischen System beheben erfordert eine gut entwickelte technische Verständnis der elektrophysiologischen Prinzipien und Geräte. Es ist auch wichtig zu beachten, dass unter bestimmten Umständen, erfasst elektrische Signale in der extrazellulären Aufzeichnungen kann die Summierung mehrerer Nervensignale darstellen. Darüber hinaus ist die Verallgemeinerung der Single-Unit-Aktivität Population Aktivität innerhalb einer Zielregion kann oft durch den Grad der zellulären Heterogenität innerhalb der Zielregion begrenzen (siehe aber Cardin ^4). Zum Beispiel könnte Elektroden gegen Aufzeichnung hoher Amplitude Ausgangsneuronen anstelle von anderen Zellen vorgespannt werden. Die Interpretierbarkeit der Single-Unit-Aufnahmen wird erhöhtindem Aufnahmen mit anderen Techniken, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, elektrische (orthodrome oder antidromen), chemische (z. B. iontophoretische oder Designer-Rezeptor) oder optogenetische Stimulation ^4, temporäre neuronalen Inaktivierungen, sensomotorischen Untersuchungen ^5, Trennung Verfahren oder Immunhistochemie ^3.

In der, dass wir die Materialien und die notwendigen Schritte auflisten, um eine organisierte Mikroarrays in der Ratte implantiert werden (obwohl das Protokoll für den Einsatz in anderen Tierarten angepasst werden) folgt Protokoll. Die Vorgehensweise und die Art der festen Arrays in unserem Labor verwendet haben zuverlässig für Längsaufnahmen bewährt und kann Aufnahmen des gleichen Neuron für über einen Monat Zeit ^6-8 aufrecht zu erhalten. Damit ist dieses Verfahren ideal für die Prüfung phasischen Reaktionen auf experimentelle Reize, Kunststoff Änderungen in neuronalen Reaktionen oder Mechanismen von Lernen und Motivation.

Protocol

Muss mit größter Sorgfalt getroffen werden, um aseptischen Bedingungen zu halten, während der Vorbereitung und der Durchführung der folgenden Verfahren (wie im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren ⁹ beschrieben). Das folgende Protokoll ist in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee, Rutgers University zugelassen. Es wird geschätzt, dass die nachfolgenden Verfahren erfordert 3-6 Stunden in Anspruch.

Implantation des Micro Array:

1. Platz Tieren unter Narkose mit 50 mg / kg Natrium-Pentobarbital (ip) und verwalten 10 mg / kg Atropin Methylnitrat (IP; Glycopyrrolate ersetzt werden) und 0,25 mg Penicillin (300.000 U / ml im), um die Atemfunktion zu erhalten und eine Infektion zu verhindern sind.
   Anmerkung: Bei der 3-6 h Länge dieses Implantationschirurgie wird Natriumpentobarbital verwendet, da es kostengünstig ist und begrenzt die menschliche Exposition gegenAnästhetika (wie es bei längerem Gebrauch von Gas Anästhetika auftreten), während immer noch lang anhaltende Anästhesie. Substitution von anderen Anästhetika ist akzeptabel.
2. Stellen Sie sicher, dass die Betäubung Effekt mit dem Schwanz Prise Test, bevor Sie fortfahren übernommen.
3. Erforderlichenfalls geben abwechselnd Injektionen von Ketamin-Hydrochlorid (60 mg / kg IP) und Natriumpentobarbital (5-10 mg / kg IP) nach Anästhesie während der Operation aufrecht zu erhalten.
4. Rasieren Sie die Kopfhaut mit einem # 22 Skalpellklinge.
5. Desinfizieren Sie die rasierte Kopfhaut mit Povidon-Iod.
6. Geben subkutane Injektionen von Bupivacain (~ 1 mg / kg SC verteilt auf 4 Injektionsstellen), um lokal betäuben die Kopfhaut. Lassen 5-10 min für die örtliche Betäubung wirksam wird.
7. Legen Sie eine Augen Schmiermittel über die Augen, um Feuchtigkeit während der Narkose zu halten.
8. Sichern Sie das Tier in die Ohr-und Nasenklemme Bars eines stereotaktischen Apparat.
9. Verwenden Sie visuelle Landmarken (z. B. einen horizontalen Balken auf der stereotaxic Rahmen) auf den Kopf des Tieres ca. Niveau. Dieser Schritt ist nur etwa in Höhe der Schädel gemeint.
10. Einen Einschnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut unter Verwendung einer # 11 Skalpellklinge auf einer Skalpellträger montiert. Der Schnitt muss direkt hinter den Ohren bis zum hinteren Teil des Nasenbeins zu verlängern.
11. Mit einem Dissektionsspatel, deaktivieren Sie die Schädel aller übrigen Gewebe, bis beide lateralen Schädel Grate und die hintere Schädelkamm erreicht wurden.
12. Ziehen Sie die Haut um den Einschnitt mit einer Reihe von Gefäßklemmen (6x).
13. Reinigen Sie den Schädel von Blut und lassen es trocknen. Wenn der verbleibende Blutung auftritt, beenden Sie den Rest Blutungen mit einem kleinen cauterizing Tool. Sicherzustellen, dass die Schädel sauber und trocken bleibt ermöglicht dem Zahnacryl in nachfolgenden Schritten verwendet werden, um an dem Schädel dauerhaft binden.
14. Filter Bregma und Lambda (Fig. 2D) durch Interpolation der Schnittpunkt der Schädelnähte. Ein Sezieren micROSCOPE ist notwendig, diese Positionen genau zu kennzeichnen.
15. Bringen Sie einen kleinen spitzen Gegenstand (z. B. ein Stift oder Dentalbohrer) zu einem stereotaktischen Arm und senken Sie es, um den dorsalen / ventralen (DV) bestimmen Koordinate des Bregma und Lambda.
16. Passen Sie den Nasenklemme, bis die DV-Koordinaten für Bregma und Lambda sind im Umkreis von 100 um (0,1 mm) voneinander.
17. Einmal eingeebnet, erfassen die anterior / posterior (AP), medial / lateralen (ML) und DV-Koordinaten von Scheitelhöhe zusammen mit der Position des Nasenklemme. Überprüfen Sie die Koordinaten für die Richtigkeit, wie der Rest der Operation hängt von der Genauigkeit dieser Koordinaten.
18. Mit den gemessenen Koordinaten, um den ML und AP-Koordinaten für die vier Ecken des "Toten Fenster" relativ zu Bregma (dh Kraniotomie Abbildung 1) zu berechnen. Der Schädel Fenster ist ein Rechteck genau positioniert, durch die der Mikroarray wird vorübergehen.
19. Mit den berechneten Koordinaten zu markieren dieSchädel Fensterkoordinaten auf den Schädel mit einem spitzen stereotaktischen Befestigung und Füllfederhalter Tinte. Um genau zu Marken zu erhalten, gelten nur eine kleine Menge Tinte auf die Spitze des Markierungswerkzeug mit einem Baumwoll Applikator.
20. Ausbohren des Schädels Fenster durch Entfernen des Knochens in einer Reihe von kleinen Ebenen.
    1. Beginnen Sie mit dem Bohren der markierten Ecken der Fenster, in dem die Marken platziert wurden.
    2. Anschließend verbinden Sie die Ecken, und stellen Sie das Fenster.
    3. Schließlich klar aus dem Bereich innerhalb der Kontur bis zur Tiefe von Dura mater. Das Loch muss breiter (dh abgeschrägten) unter den oberflächlichen Schichten des Schädels, um sicherzustellen, dass das Fenster hält eine angemessene Breite von oben nach unten.
21. Verwenden microforceps sorgfältig entfernen Sie alle verbleibenden Knochenspäne, Schutt, oder Dura mater in den Schädel-Fenster. Dieser Schritt ist sehr wichtig, da diese Bits Material kann die Integrität der Anordnung beim Absenken beeinträchtigen. Einmal gelöscht, muss man th haltene Fenster feucht bakteriostatische Kochsalzlösung für den Rest der Operation.
22. Zeigen Markierungen auf dem Schädel für 5 Schädel Schrauben und ein Massekabel (Abbildung 1). Diese Positionen werden in Abhängigkeit von der gezielten Gehirnregion variieren. Die heads wird sichersten, wenn eine Schraube an jeder der 5 Schädelknochen platziert. Legen Sie beide die Schädelschrauben und Erdungskabel an Orten, die nicht mit dem Mikroarray Platzierung stören.
23. Bohren Sie Löcher für die Schrauben Schädel und sichern Sie die Schrauben fest. Die Schrauben müssen, bis nur noch 3-4 Fäden zeigen (oder, wenn Sie andere als die empfohlenen Schrauben, tief genug, um die Dicke des Schädels, um Stabilität zu fördern Array zu durchqueren, aber nicht zu tief, um Cortex beschädigen) gesenkt werden. Reinigen Sie die Gewinde der Schrauben nach der Platzierung.
24. Bohren Sie ein Loch für die Erdungskabel. Senken Sie den Draht langsam (über 1-2 min) auf die Ziel DV koordinieren und fixieren den Draht mit Zahn Acryl.
25. In Acryl rund um die Themender Schädelschrauben. Vor den Acryl trocknet, entfernen Sie überschüssige Zement, der vom Boden Draht oder Schrauben Schädel fließt. Lassen Sie 15 Minuten für den Zahn Acryl auf / verhärten trocknen.
26. Befestigen Sie das Array an die stereotaktischen Arm. Stufe das Array und richten Sie sie so, dass sie direkt über die Grenzen des Schädels Fenster passieren.
27. Zeigen Kochsalzlösung in den Schädel Fenster, so dass es in Höhe der Schädel ist. Senken Sie das Array, bis es ein Grübchen in der Kochsalzlösung erzeugt. Diese Koordinate wird als Schädel-Ebene für das Array verwendet. Verwenden Sie diesen Wert zu berechnen, der letzte DV-Koordinate des Arrays.
28. Senken Sie die Array langsam, bis es seine endgültige DV koordinieren. Stoppen Sie alle 1mm senken und warten Sie einige Minuten, damit die Gehirngewebe von Dellen zu erholen und um den unteren Teil des Polyethylenglykol (PEG) auf dem Array lösen (PEG wird verwendet, um die Leitungen vorübergehend halten in ihrer Konformation und gleichzeitig die und löst sich langsam in Kochsalzlösung).
29. Wenn das Array 1mmvon dem Ziel entfernt, senken sie langsamer, bis die endgültige Ziel erreicht ist. Absenken auf 0,1-0,2 mm zu einem Zeitpunkt, bevor das Gewebe für eine Dauer von 5 min ruhen soll, um das Gewebe an der Zielstelle als auch proximal synaptischen Verbindungen erhalten. Wenn das Gerät verfügbar ist, können Präzision Senkung des Arrays mit einer motorischen Aufnahme unterstützt.
30. Lösen Sie die verbleibenden PEG und verwenden Zahn Acryl, die Mikrodrähte an Ort und Stelle zu zementieren. In mehreren Schichten von Zement, um sicherzustellen, dass die Leitungen sicher sind und dann lassen 15-20 min, bis der Zement aushärten, bevor Sie fortfahren. Dies stellt sicher, dass die Kabel nicht von ihrer endgültigen Platzierung angerempelt werden.
31. Bauen Sie den Rest des Tieres heads mit Zahn Acryl. Verwenden Sie die Acryl die Schädelschrauben, Erdungskabel und Stecker für die Mikrodrähte umhüllen. Lassen Sie die Acryl-Hut, um ausreichend aushärten, bevor Sie fortfahren.
32. Naht der Kopfhauteinschnitt mit resorbierbaren Fäden und verwalten 2 ml of bakteriostatische Kochsalzlösung (sc) Hydratation von der Operation wieder herzustellen.
33. Nehmen Sie das Tier von den Ohr Bars und platzieren Sie das Motiv in einem sauberen Bereich. Beachten Sie die häufig Tier während der postoperativen Erholung, bis die Thermoregulation und Fortbewegung haben sich erholt. Nach der Erholung von der Narkose, bewegen Sie das Tier in den Single-Gehäuse für den Rest der postoperativen Erholung.
34. Geben Tiere täglich postoperative Überwachung und Betreuung in den Tagen nach dem Eingriff. Wiederherstellung von diesem Verfahren ist optimal, wenn sieben oder mehr Tagen sind erlaubt.
35. Geben Tiere Injektionen von Carprofen (5mg/kg) und Enrofloxacin (5-10 mg / kg) oder deren Äquivalente während der Wiederherstellung dem Zeitplan durch den behandelnden Tierarzt empfohlen.

Representative Results

Eine Liste der Geräte von diesem Labor für die Aufzeichnung von elektrophysiologischen Signalen verwendet werden, können in der Tabelle 3 zu finden. Nach der Erholung von der Operation, sind Single-Einheiten, indem Sie ein Unity-Gain-heads in die implantierten Anschluss aufgezeichnet. Diese heads ist über ein Kabel mit einem Kommutator, der durch die Verwendung von elektrischen Schleifringen, geeignet zur freien Rotation ohne Brüche in der elektrophysiologischen Aufzeichnung verbunden. Der Kommutator ermöglicht Themen frei zu bewegen, während die Aufnahme während Verhalten, das eine der wichtigsten Vorteile dieser Vorbereitung ist. Signale werden dann durch einen Vorverstärker (10x Verstärkung), die verwendet wird, um das Signal zu verstärken differentiell an jeder Elektrode gegen die Umgebungsgeräusche auf einer Elektrode gewählt, weil es nicht eine Signaleinheit aufweisen speist. Differential-Aufnahmen werden verwendet, um die momentane Differenz zwischen den beiden Spannungen zu verstärken. Da beide Drähte aufnehmen Umgebungsgeräusche etwa gleich, ihre Oppositionte Polaritäten effektiv ermöglichen Subtraktion der Umgebungsgeräusche vom neuronalen Aufnahmen (Abbildung 2). Schließlich Signale bandpaßgefilterten (450 Hz bis 10 kHz, rollen -1,5 dB / Oktave bei 1 kHz und -6 dB / Oktave bei 11 kHz) und verstärkt, 700x, bevor sie mit einem Computer mit einem A / D-Karte digitalisiert (50 kHz Sampling-Frequenz / Draht) und für die Offline-Analyse gespeichert.

In der Software sind Wellenformen, oft unter Verwendung eines Schwellendetektionsverfahren abgetastet. So Signale, die einen bestimmten Spannungsschwelle übergeben werden digitalisiert und gespeichert. Dennoch gibt es eine inhärente Rate der falsch-positive, in denen elektrische Artefakte passieren die Schwelle, Filter-und Differenzverstärkung und werden abgetastet. Diese nicht-neuronalen-Wellenformen werden post-hoc subtrahiert mit Spike-Sortiersoftware, die abgetastet Entladungen basierend auf ihren Parametern sortiert werden können (z. B. Amplituden-, Peak-und Tal-Spannungen, etc.) Und anschließend ermöglicht die Eliminierung von electrical "Rauschen" und die Auswahl des neuronalen Signals (Fig. 3). Wellenformen werden für die Analyse eingeschlossen, wenn 1) mit kanonischen Muster der neuronalen Aktivität, die eine klar definierte Aktionspotential und nach Hyperpolarisierung (Fig. 3 Wellenformen vorliegen, rechte Tafel), 2) die Amplitude der Wellenform eine mutmaßliche neuronale weist mindestens ein 2:1-Signal : Rausch-Verhältnis (dh ist eindeutig trennbar von der Kanalrauschband; Amplitude der Rauschband = ca. .. 50 uV), 3) Parameter stabil bleiben während der gesamten Sitzung und 4) eine Interspike-Intervall (ISI) Histogramm zeigt, dass keine Entladungen aufgetreten während der natürlichen Refraktärzeit des Neurons (dh ~ 2 ms, Fig. 3 links).

Neuronale Entladungen können dann mit Verhaltensereignisse (z. B. Hebelreaktion), die als Zeitmarken über den Einsatz eines digitalen Eingabe-Ausgabe-(I / O)-Karte aufgezeichnet werden korreliert werden. Diese Zeit-Stempel können verwendet werden, um peri-Ereigniszeit Histogramme (PETHs; 4A) zu erstellen, die verwendet werden, um neuronale Entladungen, die in einem bestimmten Zeitraum um einen bestimmten Verhaltens Ereignis auftreten anzuzeigen. Unser Labor hat in der Regel untersucht neuronalen Entladungen in der Größenordnung von Stunden (Tonic ^10), Minuten (Langsam-Phasic ¹¹⁾ und Sekunden / Millisekunden (Rapid-Phasic ^12). Tonic Brenn wird normalerweise verwendet, um die globale Ereignisse in einer Sitzung zu prüfen. Zum Beispiel haben wir oft nutzen diese, um Feuerraten der Neuronen zu vergleichen, wenn Tiere sind Selbstverwaltungs Droge, dh Vordrogen gegenüber auf-Drogen-Feuerraten. Langsam phasischen Analysen werden häufig verwendet, um während der langsamen Schuss wechselnde Veranstaltungen wie der Zerfall eines pharmakologischen Wirkstoffs über Minuten zu prüfen. Schließlich sind schnelle phasische Analysen für mehr augenblickliche Geschehen wie eine operante Reaktion bzw. der Ausbruch einer experimentellen Cue verwendet.

Fig. 4 zeigt ein Histogramm der Tonika Brennmit einer Anzahl von Entladungen in 30 Sekunden Behälter über eine gesamte Aufnahme-Session während Kokain Selbstverwaltung. Das gezeigte Beispiel Zelle reagiert empfindlich auf Veränderungen in der Körperspiegel von Kokain und wird gesperrt (4A) als Körper-Ebene von Kokain zunimmt (4B) des Tieres, sondern kehrt zu seinem ursprünglichen Feuerrate als das Niveau von Kokain fällt, nachdem der Selbst Verwaltung Eventualitäten sind beendet. Je nach Zielgebiet kann Nervenzellen empfindlich auf pharmakologische Wirkungen, oder eine beliebige Anzahl von Verhaltens Veranstaltungen wie Lohn-assoziierte Cues ^6, sensomotorische Eingang ¹³ oder motivierte Ansatz ³ sein.

Unter den richtigen Bedingungen ist es möglich, die gleiche Neuron für viele Sitzungen aufzeichnen. Im Striatum sind Neuronen homogen verteilt (80% der Leitungen liefern nur eine Einheit und Zellen nicht dicht geschichteten oder gruppiert) und produzieren relativ kleine Signale, die schnell Zerfall over Abstand. Unter diesen Bedingungen hat sich unser Labor in der Lage, die gleiche Neuron im Striatum für mehrere Wochen aufzunehmen. Wichtig ist, dass nicht alle Neuronen über Sitzungen überprüft werden, und nicht alle Neuronen werden über die Zeit aufrechterhalten. Die Bestimmung, die Fähigkeit, diese Arten von Längs Aufnahmen zu erhalten erfordert eine sorgfältige Prüfung der elektrophysiologischen Systems. Zum Beispiel ist es möglich, den Aufzeichnungsabstand von Mikrodrähten mit Hilfe antreibbar Elektroden schätzen. Wenn neben den physikalischen Eigenschaften der Drähte, regionale Anatomie und Wellenformparameter des Neurons über Sitzungen hinweg betrachtet, kann man mit hinreichender Sicherheit festzustellen, dass eine Wellenform über Sitzungen ^7,8,13 beibehalten.

Fig. 1 ist. Representative Platzierungen für die "Totenkopf-Fenster" (dh Kraniotomie), Schädelschrauben und Erdungskabel. A) Eine Rückenansicht des Schädels, die die Anordnung von einem Totenkopf Schraube auf jeder Platte des Schädels (rot), einem Schädel-Fenster (Quadrat), und ein Loch für den kontralateralen Erdungskabel (grün). Bei der Planung des Schädels Fenster sollten die Koordinaten durch die Bestimmung der vorderen B definiert werden) und C) posterioren medialen und lateralen Koordinaten für die Zielregion (z. B. dorsolateralen Striatum). D) Diese Koordinaten können dann verwendet werden, um die Position des Fensters zu bestimmen, auf der dorsalen Oberfläche des Schädels. Beachten Sie, daß der Schädel Fenster entspricht den medialen und lateralen Ziele in B und C identifiziert und überspannt den festgelegten Bereich in der anterior-posterioren Ebene zwischen B und C. Diese Koordinaten werden spezifisch für jeden einzelnen Zielbereich sein. Repräsentative Standortegen der Mikrodrähte in einem 2 x 8 Arrays mit kleinen Punkten innerhalb des Schädels Fenster in D gezeigt ist. Die endgültige dorsoventraler Koordinate der Drähte wird von der Tiefe, auf die sie abgesenkt werden, abhängen. Zahlen aus Paxinos & Watson ¹⁴ modifiziert. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

2. Eine Illustration des Verfahrens der Differential-Verstärkungs. Die oberste Platte stellt ein neuronales Signal vor der Differenzverstärkung (Signal + Noise). Nach Differenzverstärkung, Fremd elektrische Signale, die auf allen Kanälen zu finden sind (Noise, Mitte) kann effektiv von der Aufnahme wi abgezogen werdenres über die Verwendung eines bestimmten Differenz Elektrode, um die Isolierung des neuronalen Signalform (Signal, Bodenplatte) zu verbessern.

3. Ein Beispiel neuronale Signalform (rechts) von einem Draht aus einem Mikroarray aufgezeichnet. Das Histogramm (links) zeigt die Anzahl von Aktionspotentialen in den Millisekunden vor jeder beobachteten neuronalen Entladung in der Sitzung. Jedes Fach eine 1 Millisekunde Periode. Das Histogramm zeigt, dass keine Aktionspotentiale in natürlichen Refraktärzeit des Neurons (2 ms) aufgetreten.

Abbildung4. Ein Beispiel für ein Neuron, das tonisch während Kokain Selbstverwaltung gesperrt. A) Die Brennrate (Spikes/30 sec) eines Neurons über eine langfris Zugang Kokain Selbstverwaltung Sitzung in 30 Sekunden Behälter. B) Die entsprechende berechnet Drogen Ebene in der gleichen Sitzung. In Kombination werden Erhöhungen der Medikamentenspiegel mit einer Vertiefung in neuronalen Entladungen korreliert. Dementsprechend wird, wenn die Sitzung endet bei ~ 425 min, erholt neuronalen Entladungen als Körperspiegel von Kokain Herbst.

Abbildung 5. Histologische Scheiben von zwei Tieren, die mit Mikroimplantaten. A) Eine Nissl gefärbten Abschnitt mit neutralen rot kombiniert mit einer Kaliumhexacyanoferrat Gegenfärbung enthüllt Verletzungen ist Mikrospitzen (blau).Ein Mikro kann von der Rinde bis auf die Drahtspitzen (blau), indem Sie die Drahtbahnen im Gewebe zurückgeführt werden. Tracks können in einer einzigen Scheibe oder eine Reihe von benachbarten Scheiben schneiden. B) Ein Abschnitt für Substanz P gefärbt, die das ventrale pallidum zeigt, verbunden mit einer Kaliumhexacyanoferrat Gegenfärbung zurückverfolgt werden. Verwendung immunhistologische Techniken können einzelne Mikrodrähte in spezifischen Hirnregionen oder auch in bestimmten Teilbereichen eines bestimmten Zellkern lokalisiert werden. Abbildung zeigt eine Mikrospitze (blau) in der ventralen pallidum mit der Substanz P Fleck lokalisiert.

Discussion

Extrazelluläre Aufnahmen stellen eine leistungsfähige experimentelle Technik, die in nahezu jedem Versuchsansatz in der Neurowissenschaft integriert werden können. Drähte, die auf organisierten Arrays implantiert wurden, können verfolgt werden, wie ihre Wellen durch das Gehirn und in die Zielregion (5A) übergeben. Wenn ein kleiner, post-experimentellen Läsion an der nicht isolierten Mikrospitze geschaffen, um eine kleine Eisen Kaution aus der Edelstahldraht zu erstellen, kann man genau markieren Sie die Stelle des nicht isolierten Mikrospitze (wo die Single-Gerät aufgenommen wurde) mit einer Lösung von 5% Kaliumferrocyanid und 10% HCl (Fig. 5A und 5B; blaue Punkte). So kann man ohne weiteres verwenden eine Reihe von nachfolgenden Gehirnscheiben, um die Position der gesamten Anordnung im Gehirn wiederherzustellen. Schließlich können die oben erwähnten Techniken leicht mit Immunhistochemie kombiniert werden, um die räumlichen Besonderheiten der Aufnahmen zu erhöhen, umZielplatzierungen sogar um subregionalen Unterschiede innerhalb einer einzigen Zielkern ³ (5B) studieren zu überprüfen und.

Um die gewünschte räumliche Spezifität zu erreichen, müssen Mikroarrays entwickelt und mit Sorgfalt implantiert werden. In erster Linie muss der Abstand der Reihen und Spalten in der Anordnung, die speziell für den Bereich von Interesse konstruiert werden. Arrays, die zu lang oder zu breit für das gewünschte Ziel sind, können die Genauigkeit verringern oder produzieren eine große Anzahl von Drähten, die an der Grenze zwischen zwei benachbarten Kerne fallen. Zur gleichen Zeit können auch Mikrodrähte eng beabstandet eine separate Abgrenzung jeder Elektrode zu verhindern. Zweitens müssen Mikroarrays mit Vorsicht, um die Integrität der Anordnung aufrechtzuerhalten gehandhabt werden. Einzel-Elektroden-Arrays werden mit dünnen, haarähnlichen Drähte, die leicht beschädigt werden können, oder von ihrer Konfiguration angerempelt bei Kontakt hergestellt. Die Eigenschaften dieser Drähte sind ideal zur Reduzierung von Schäden to Gewebe auf dem Weg der Annäherung an ein Ziel und erlauben auch die Drähte, mit kleinen Bewegungen des Gehirns verschieben im Konzert. So ist es in der Regel ratsam, Arrays an einem sicheren Ort speichern und zu vermeiden Entfernen Arrays aus ihren Schutzhüllen bis kurz vor der Implantation. Auch muss darauf bei der Sterilisation von Mikroarrays genommen werden. In einigen Fällen kann es bei der Elektroden akzeptabel. Allerdings kann Ethylenoxid oder UV Desinfektion vorzuziehen, zerbrechlich Arrays zu schützen. Schließlich wird die Elektrode aus Metall und Isolierung, und der Durchmesser der einzelnen, sollten sorgfältig abgewogen werden. Zum Beispiel wird nur Elektroden, die Eisen (zB Edelstahl) enthalten können, Berliner Blau Reaktionen für individuelle Abgrenzung der einzelnen Mikro im Array zu erzeugen.

Gelegentlich wird Mikrodrähte in der Anordnung von ihrer Konfiguration beim Absenken unbemerkt durch streunende Hindernisse (zB Schädelfragmente in den Schädel Fenster) oder arm haLeitstellen. In diesen Fällen, wie ein Mikro oft noch bis zu seiner Spitze verfolgt werden kann (obwohl es wahrscheinlich außerhalb der Zielregion ist). Sollte ein Fall eintreten, dass jeder nummerierte Mikro im Array kann nicht verifiziert werden, ist es wichtig, die Integrität des Experiments, das Tier aus dem Datensatz entfernt werden. Fehlinterpretation der Position eines einzelnen Mikro der kann seine neuronale Signale ermöglichen, erschweren oder beschädigt Interpretation der Daten.

Während der Implantation, auch die Genauigkeit der Schädelfenster und Ausrichtungsanordnung kritisch Zielgenauigkeit. Schädel Fenster müssen breit genug sein, damit das Array ohne Bücken oder schädliche Drähte geben werden. Auf der anderen Seite wird das Fenster auch zur genauen Führung des Arrays zu der Zielposition und deshalb präzise in jeder Dimension gebohrt werden. Wenn Sie bereit sind für die Implantation, muss man auch sicher, dass das Array im Lot mit dem Schädel Fenster in allen Dimensionen sein. Das heißt,eine leichte Neigung des Arrays in jeder Dimension kann das Array entweder teilweise oder vollständig das Ziel verfehlen Kern verursachen. Schließlich sollten Sie besonders vorsichtig beim Absenken der ersten 1-3 mm genommen werden. Es ist während der ersten Senkung dass Trümmerstücke, die innerhalb des Schädels Fenster unbemerkt geblieben sind, können die Integrität des Arrays beeinträchtigen und stören den Weg der Mikrodrähte. Wenn der Pfad der Mikrodrähte behindert, während sie langsam abgesenkt werden, kann man sehen, Mikrodrähte biegen oder beugen unter leichter Vergrößerung, bevor das Array verursacht Schäden (z. B. mit Hilfe einer Lupe). An diesem Punkt können die Mikrodrähte zurückgezogen und Schutt aus dem Fenster vor der weiteren Implantation gelöscht.

Last but not least, erfolgreiche Implantation von Mikroarrays erfordert besondere Aufmerksamkeit auf die Aufrechterhaltung eines aseptischen Operationssaal und die gründliche Nachsorge. Wenn mit den oben genannten Vorkehrungen kombiniert wird, kann lebensfähigen Aufnahmen erhalten werdenRegionen von Interesse für die nach oben von einem Monat, wir haben Aufnahmen bis zu 40 Tage nach der Operation ⁶ prüft. Vielleicht am wichtigsten ist, liefert die Langlebigkeit dieser Aufnahmen die Möglichkeit, einzelne Funktionskreise im komplexen Umfeld der elektrischen, chemischen und hormonellen Einflüsse zu studieren und zu beantworten grundlegende Fragen über die Rolle dieser Schaltungen im Lernen und Motivation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table 1. List of Surgical Materials.
Gauze	Fisher (MooreBrand)	19-898-144
Cotton Swabs	Fisher (Puritan)	S304659
Nembutal (Pentobarbital)	Sigma Aldrich	P3761
Atropine Methyl Nitrate	Sigma Aldrich	A0382
Baytril (Enrofloxacin)	Butler Shein (Bayer)	1040007
Ketamine Hydrochloride	Butler Shein	SKU# 023061
Betadine (Povidone-Iodine)	Fisher (Perdue)	19-066452
Stereotax	Kopf	Model 900
Cauterizing Tool	Stoelting	59017
Dissecting Microscope	Nikon	SMZ445
Dental Drill	Buffalo	37800
Bacteriostatic Saline	Bulter Schein	8973
Jewlers Screws	Stoelting	51457
Microwire Array	Microprobes	Custom (Flexible)
Ground Wire	Omnetics	Custom Plug
Dental Acrylic	Fisher (BAS)	50-854-402
Absorbable Sutures	Fisher (Ethicon)	NC0258473
Puralube (Opthalamic Ointment/Lubricant)	Fisher (Henry Schein)	008897
Table 2. List of Surgical Instruments.
2x Microforceps	George Tiemann Co.	#160-57	Multi-use (e.g. clearing debris in skull window)
2x Forceps	George Tiemann Co.	#160-93	Multi-use (e.g. tying sutures)
6x Hemostats	George Tiemann Co.	#105-1125	Clamp and open incision
1x Small scissors	George Tiemann Co.	#105-411	Cut sutures after tying
1x Tissue forceps	George Tiemann Co.	#105-222	Holding tissue while suturing
1x Needle holder	George Tiemann Co.	#105-1259	Holding suture needle
1x Scalpel holder (with #11 blade)	George Tiemann Co.	#105-80 (w/ #105-71 blade)	Making skull incision
1x #22 Scalpel blade	George Tiemann Co.	#160-381	Shaving scalp
1x Surgical Spatula	George Tiemann Co.	#160-718	Scraping skull to clear tissue on skull
Machine/Jewelers Screws	Various	N/A	0/80 x 1/8”
Table 3. List of Equipment for Recording Electrophysiological Signals.
Microwire Array & Connector	Micro Probe, Inc. (Gaithersburg, MD)	N/A (Part No. based on array characteristics)	Cranially implanted in target recording region. Arrays are customized based on desired wire spacing, length, etc.
Unity-Gain Harness/Headstage	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1200	Initial amplification of neural signal; allows for propagation of small neural signals.
Commutator (and Optional Fluid Swivel)	Plastics One, Inc. (Roanoke, VA)	SL18C	Allows animals to freely rotate while propagating electrical signal to preamp
Pre-amplifier	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1198	Differentially amplifies neural signals against a reference electrode.
Filter and Amplifier	M.B. Turnkey Designs (Hillsborough, NJ)	Proj 1199	Band-pass filters and further amplifies the differentially amplified signal.
Acquisition Computer	EnGen (Phoenix, AZ)	N/A (Custom Build)	Runs software and hardware for behavioral and neural data acquisition.
A/D Card	Data Translation (Marlboro, MA)	DT-3010	Digitizes neural signals for computer sampling.
Digital I/O Card	Measurement Computing (Norton, MA)	PCI CTR-05	Acquires behavioral inputs and outputs