Fluorescens<em> In situ</em> Hybridiser (FISH) for lokalisering av virus og Endosymbiotic Bakterier i plante-og insekt Vev

Summary

Vi beskriver her en enkel fluorescens in situ hybridisering (FISH) Fremgangsmåte for lokalisering av virus og bakterier i insekt-og plantemateriale. Denne protokollen kan utvides for visualisering av mRNA i hele fjellet og mikroskopiske deler.

Abstract

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er navnet gitt til en rekke teknikker som vanligvis brukes for visualisering av gentranskriptene i eukaryote celler og kan bli ytterligere modifisert for å visualisere andre komponenter i cellen slik som infeksjon med virus og bakterier. Romlig lokalisering og visualisering av virus og bakterier under infeksjonen prosessen er et viktig skritt som utfyller uttrykk profilering eksperimenter som mikromatriser og RNAseq i respons på ulike stimuli. Forstå Spatiotemporal infeksjoner med disse agentene utfyller biologiske eksperimenter som tar sikte på å forstå deres interaksjon med cellulære komponenter. Flere teknikker for å visualisere virus og bakterier, som reporter gene systemer eller immunohistokjemiske metoder er tidkrevende, og noen er begrenset til å arbeide med modellorganismer, og involverer komplekse metoder. FISH som er rettet RNA-eller DNA-materiale i cellen er en relativt enkel og rask method for å studere tid og rom lokalisering av gener og for diagnostiske formål. Denne metoden kan være robust og forholdsvis lett å gjennomføre når protokollene anvende korte hybridiserende, kommersielt innkjøpte prober, som ikke er kostbart. Dette er særlig robust når prøvepreparering, fiksering, hybridisering, og mikroskopisk visualisering ikke innebærer kompliserte trinn. Her beskriver vi en protokoll for lokalisering av bakterier og virus i insekt-og plantemateriale. Metoden er basert på enkle forberedelser, fiksering, og hybridisering av insekt hele mounts og dissekerte organer eller håndlagde plante seksjoner, med 20 basepar korte DNA prober konjugert til fluorescerende fargestoffer på sin 5 'eller 3' slutter. Denne protokollen har blitt brukt på en rekke insekt-og plantemateriale, og kan brukes til å analysere ekspresjonen av mRNA eller annet RNA eller DNA-materiale i cellen.

Introduction

Ved studering av interaksjonen mellom plante-virus og andre patogener med sine infiserte plante-verter, er det viktig å visualisere de patogener og deres respektive nukleinsyrene in situ, uansett om de forårsaker negative effekter på deres verter. Dette er det viktigste når en skal studere patogen bevegelse innenfor og mellom planteceller. In situ lokalisering av genprodukter av patogenet er et viktig skritt som utfyller andre tilnærminger for å studere patogenitet prosessen. Mange plante patogener, spesielt virus, blir overført av insekter, har komplekse og intime interaksjoner med sine vektorer. Lokalisering av disse virus i sine vektorer er viktig for å studere forløpet for overføring, og de mulige interaksjon steder inne i vektoren. Overføringen av noen insekt-vectored plante virus blir hjulpet av endosymbiotic bakterier som bor innenfor disse insektene. For bedre å studere overføring av disse plante-virus by sine vektorer, er det også viktig å visualisere de endosymbiotic bakterier generelt, og de som er involvert i virusoverføring, spesielt. Colocalization av virus og endosymbiotic bakterier er derfor ønskelig for å undersøke mulige sammenhenger mellom disse organismene innenfor deres insekt vert. Bortsett fra virus overføring, endosymbiotic bakterier påvirker flere aspekter av biologi av insekt vektorer, er dermed romlig lokalisering av disse bakteriene i løpet av insekter av stor interesse og betydning.

Tomat gul leaf curl virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) er den viktigste virussykdom kompleks av dyrket tomat på verdensbasis ^1-4. TYLCV er en phloem begrenset virus og er utelukkende vectored av whitefly Bemisia tabaci ^5,6. En modell som beskriver translokasjon av begomoviruses i sine whitefly vektorer har vært foreslått ^6-9. To konkrete barrierer er aktivt krysset during dette circulative overføring: midgut / hemolymph og hemolymph / spyttkjertel barrierer. Denne overføringsprosess, er antatt å bli mediert av ukjente reseptorer som gjenkjenner virus capsid. TYLCV er antatt å krysse B. tabaci midgut ^6,10, og absorberes gjennom den primære spyttkjertel ⁶ før den føres inn i anlegget. I whitefly hemolymph, samhandler med en GroEL protein som produseres av insekt sekundær endosymbiotic bakterien Hamiltonella TYLCV. Denne interaksjonen sikrer trygg transport av TYLCV i hemolymph, og beskytter den mot angrep av insekt immunsystemet ^11. Hamiltonella og Portiera, den primære endosymbiont av whiteflies, er plassert i bacteriocytes, insektceller som finnes i hemolymph og huset endosymbiotic bakterier ^11. B. tabaci havner ekstra endosymbiotic bakterier inkludert Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia, og Fritschea, som kan lokaliseres innenfor eller utenfor bacteriocytes, og har forskjellige virkninger på insekt biologi ^12..

Flere rapporter har forsøkt å studere lokalisering av TYLCV i planter og whiteflies ved hjelp av tidkrevende og kostbare protokoller som transmisjonselektronmikroskopi (TEM), antistoffer og RNA in situ på mikroskopisk tykke delen ^10,13, en fersk studie beskrev lokalisering av plante virus i sine anlegg og vektor verter ved hjelp av en enkel protokoll ^14. Her beskriver vi en enkel protokoll for lokalisering av TYLCV i B. tabaci dissekert midguts og spyttkjertlene, og i seksjoner forberedt fra TYLCV-infiserte planter. Vi beskriver lokalisering av Portiera, den primære endosymbiont av B. videre tabaci, og dets sekundære endosymbionts Hamitonella, Rikettsiearter og Arsenophonus. Denne protokollen er basert på bruk av korte DNA-prober, somer fluorescensmerkede på sin 5 'ende, og spesifikt hybridisere til komplementære sekvenser i virus-eller bakterie-gensekvenser. Denne type behandling er relativt enkelt og signalet som oppnås er svært spesifikk. Den beskrevne protokoll kan benyttes for å lokalisere virus, bakterier og andre patogener i sitt anlegg, dyre-og insekt verter, og kan videre brukes til å lokalisere mRNA i et gitt vev.

Protocol

En. Generelt Whitefly, Plant, og Virus Forberedelser til FISH analyse Bak B og Q biotypen whiteflies på bomulls frøplanter (Gossypium hirsutum L. cv. Acala) og vedlikeholde inne insektnett bur og vekst rom under standardbetingelser på 25 ± 2 ° C, 60% relativ fuktighet, og en 14-timers lys / 10-timers mørke daglengde. Utfør PCR for å teste infeksjon med endosymbionts hjelp endosymbiont-spesifikke primere som tidligere beskrevet 15-19. Kjøpe Tomato frøp…

Representative Results

Systemet undersøkt i dette manuskriptet er vist i figur 1 og omfatter en infisert plante med TYLCV, en voksen og et hulder av whitefly B. tabaci, og den interne anatomi whitefly viser banen for TYLCV translokasjon i insektet. Figur 2 viser dobbelt FISH i en voksen whitefly for primær symbiont Portiera og sekundær symbiont Arsenophonus. Figur 3 viser dobbelt FISH for Portiera og Hamiltonella, og Figur 4 vis…

Discussion

Den protokoll som er beskrevet her for lokalisering av en plante-virus i sitt anlegg vert og insektvektor, og endosymbiotic bakterier i deres spesifikke whitefly vert, kan tilpasses for lokalisering av andre virus hos planter og til og med i animalsk vev. Videre kan protokollen kan brukes for å lokalisere endosymbiotic og patogene bakterier og andre mikroorganismer i plante-og dyresystemer. De beskrevne fremgangsmåter basert på et enkelt konsept for hybridisering mellom et kort, fluorescensmerket-merket oligonukleoti…

Materials

Fluorescently labeled  Probes	Metabion	20 bp HPLC purified	Sequence designed by customer
Toluidine blue	Sigma-Aldrich	89640
sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Formamide	Sigma-Aldrich	F9037	Molecular Biology Grade
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	T5941	Molecular Biology Grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Liquid Blocker	Ted Pella Inc.	22309