Fluoreszenz<em> In situ</em> Hybridisierungen (FISH) für die Lokalisierung von Viren und Bakterien in Endosymbiotic Pflanzen-und Insekten Gewebe
Summary
Wir beschreiben hier ein einfaches Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)-Verfahren zur Lokalisierung von Viren und Bakterien in Insekten-und Pflanzengeweben. Dieses Protokoll kann für die Visualisierung von mRNA in ganze Berg und mikroskopische Abschnitte erweitert werden.
Abstract
Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) ein Name, der einer Vielzahl von Techniken, die üblicherweise für die Visualisierung Gentranskripten in eukaryotischen Zellen und kann weiter modifiziert werden, um andere Komponenten in der Zelle, wie eine Infektion mit Viren und Bakterien zu visualisieren verwendet gegeben. Räumliche Lokalisierung und Visualisierung von Viren und Bakterien während der Infektion ist ein wesentlicher Schritt, die Genexpressionsexperimente wie Microarrays und RNAseq ergänzt in Reaktion auf verschiedene Reize. Das Verständnis der raumzeitlichen Infektionen mit diesen Mitteln ergänzt biologische Experimente auf das Verständnis ihrer Wechselwirkung mit zellulären Komponenten ab. Verschiedene Techniken zur Visualisierung von Viren und Bakterien, wie Reportergen-Systeme oder immunhistochemische Verfahren sind zeitaufwendig, und einige sind auf die Verwendung mit Modellorganismen und arbeiten mit komplexen Methoden. Fische, die RNA oder DNA-Spezies Ziele in der Zelle ist eine relativ einfache und schnelle mirthode zur Untersuchung der raum-zeitlichen Lokalisierung von Genen und für diagnostische Zwecke. Diese Methode kann robust und relativ einfach zu implementieren, wenn die Protokolle beschäftigen kurze Hybridisierungs, im Handel gekauft Sonden, die nicht teuer sind, sein. Dies ist besonders robust, wenn die Probenvorbereitung, Fixierung, Hybridisierung und mikroskopische Visualisierung beinhalten keine komplexe Schritte. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Lokalisierung von Bakterien und Viren in Insekten-und Pflanzengeweben. Die Methode basiert auf einfachen Zubereitung, Fixierung und Hybridisierung von Insekten ganzen Halterungen und seziert Organe oder handgefertigte Anlagenteile, mit 20 Basenpaaren kurzen DNA-Sonden zur Fluoreszenzfarbstoffe auf ihren 5 'oder 3' konjugiert endet basiert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich in einer Reihe von Insekten-und Pflanzengewebe aufgebracht wird, und kann verwendet werden, um die Expression von mRNA oder anderen RNA-oder DNA-Spezies in der Zelle zu analysieren.
Introduction
Bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Pflanze Viren und andere Pathogene mit infizierten Wirtspflanzen ist es wichtig, die Pathogene und ihre entsprechenden Nukleinsäuren in situ sichtbar, egal ob sie negative Auswirkungen auf ihre Wirte führen. Dies ist besonders wichtig bei der Untersuchung Pathogen Bewegung in und zwischen den Pflanzenzellen. In situ-Lokalisierung von Genprodukten des Pathogens ist ein wesentlicher Schritt, die andere Ansätze zur Untersuchung der Pathogenität Verfahren ergänzt. Viele Pflanzenkrankheitserreger, insbesondere Viren, werden von Insekten übertragen werden, mit komplexen und intimen Interaktionen mit ihren Vektoren. Lokalisierung dieser Viren in ihrer Vektoren ist wichtig für die Untersuchung der Pfad für die Übertragung, und die möglichen Wechselwirkungsstellen innerhalb des Vektors. Die Übertragung von einigen Insekten vectored Pflanzenviren wird durch Bakterien, die endosymbiontischen innerhalb dieser Insekten wohnen unterstützt. Um die Übertragung von diesen Pflanzenviren b besser studiereny deren Vektoren, ist es auch wichtig, die endosymbiontischen Bakterien im allgemeinen sichtbar zu machen, und die im Virus-Übertragung beteiligt sind, insbesondere. Kolokalisation der Viren-und Bakterien endosymbiontischen ist somit für die Untersuchung der möglichen Beziehungen zwischen diesen Organismen innerhalb ihrer Wirtsinsekten gewünscht. Abgesehen von der Übertragung des Virus, verschiedene Aspekte der Biologie der Insektenvektoren beeinflussen endosymbiontischen Bakterien, ist von hohem Interesse und Bedeutung somit räumliche Lokalisierung dieser Bakterien innerhalb von Insekten.
Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) ist die häufigste virale Krankheitskomplex der Kulturtomate weltweit 4.1. TYLCV ist eine Bast-Virus begrenzt und wird ausschließlich von der Weißen Fliege Bemisia tabaci 5,6 vektorisiert. Ein Modell, das die Translokation des Begomoviren in ihrer Weiße Fliege Vektoren beschreiben, wurde vorgeschlagen, 09.06. Zwei spezifische Barrieren aktiv während gekreuztten diese zirkulativen Übertragung: die Mitteldarm / Hämolymphe und die Hämolymphe / Speicheldrüse Barrieren. Dieser Übertragungsprozess wird angenommen, dass sie von unbekannten Rezeptoren, die das Virus-Kapsid erkennen vermittelt werden. TYLCV wird gedacht, um B. zu überqueren tabaci Darm 6,10 und wird durch die Primärspeicheldrüse 6 absorbiert, bevor es in die Anlage eingespritzt wird. In der Weißen Fliege Hämolymphe, interagiert mit einem TYLCV durch das Insekt Sekundär endosymbiontischen Bakterium produziert Hamiltonella GroEL Protein. Dieses Zusammenspiel sorgt für einen sicheren Transport von TYLCV in der Hämolymphe, und schützt sie vor Angriffen durch das Insekt Immunsystem 11. Hamiltonella und Portiera, die primäre Endosymbionten von Weißen Fliegen, sind in bacteriocytes untergebracht, Insektenzellen in der Hämolymphe und Haus endosymbiontischen 11 Bakterien. B. gefunden tabaci birgt zusätzliche endosymbiontischen Bakterien einschließlich Rickettsien, Arsenophonus, Wolbachia, und Fritschea, die innerhalb oder außerhalb der bacteriocytes lokalisiert werden kann, und haben unterschiedliche Auswirkungen auf die Biologie der Insekten 12.
Mehrere Berichte haben versucht, die Lokalisierung von TYLCV in Pflanzen und Weißen Fliegen unter Verwendung der Zeit-und kostenaufwendig Protokolle wie Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Antikörper und RNA in situ auf mikroskopischer dicken Abschnitt 10,13 untersuchen, eine neue Studie beschrieben, die Lokalisierung von Pflanzenviren in ihren Anlage-und Vektor-Rechner mit einem einfachen Protokoll 14. Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Lokalisierung von TYLCV in B. tabaci seziert midguts und Speicheldrüsen und in Abschnitte von TYLCV-infizierten Pflanzen vorbereitet. Wir beschreiben die Lokalisation von Portiera, die primäre Endosymbionten von B. tabaci und seine Sekundär Endosymbionten Hamitonella, Rickettsien und Arsenophonus. Dieses Protokoll wird auf Verwendung von kurzen DNA-Sonden auf der Basis, dassfluoreszierend an ihrem 5'-Ende markiert ist und spezifisch an komplementäre Sequenzen in viralen oder bakteriellen Gen-Sequenzen zu hybridisieren. Die Probenverarbeitung relativ einfach ist, und das erhaltene Signal ist hoch spezifisch. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um Viren, Bakterien und andere Krankheitserreger in der Pflanzen-, Tier-und Insekten Hosts zu lokalisieren, und kann weiter verwendet werden, um mRNA in einem bestimmten Gewebe zu lokalisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die für die Lokalisierung eines Pflanzenvirus in ihrer Wirtspflanze und Insektenvektor und endosymbiontischen Bakterien in ihrem spezifischen Weiße Fliege Wirts hier beschriebene Protokoll kann zur Lokalisierung von anderen Viren in Pflanzen und auch im tierischen Gewebe angepasst werden. Weiterhin kann das Protokoll verwendet, um endosymbiontischen und pathogene Bakterien und andere Mikroorganismen in Pflanzen-und Tiersystemen zu lokalisieren. Die beschriebenen Verfahren beruhen auf einfache Konzept der Hybridisierun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung im Labor Ghanim wurde von Forschungsstipendium nicht unterstützt. 908-42.12/2006 von der Deutsch-Israelischen Stiftung (GIF), gewähren keine. IS-4062 bis 07 aus den Vereinigten Staaten und Israel Binationale Agrarforschung und Entwicklungsfonds (BARD) und Forschungsförderung nicht. 884/07 aus Israel Science Foundation (ISF) in MG
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
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