Fluorescens<em> In situ</em> Hybridiseringer (FISH) til lokalisering af vira og Endosymbiotic Bakterier i plante-og insektliv Væv
Summary
Vi beskriver her en simpel fluorescens in situ hybridisering (FISH) metode til lokalisering af vira og bakterier i insekt-og plantevæv. Denne protokol kan udvides til visualisering af mRNA i hele mount og mikroskopiske sektioner.
Abstract
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er et navn givet til en række teknikker, der almindeligvis anvendes til at visualisere gentranskripter i eukaryote celler og kan modificeres yderligere til at visualisere andre komponenter i cellen, såsom infektion med virus og bakterier. Rumlig lokalisering og visualisering af virus og bakterier i løbet af infektionen proces er et vigtigt skridt, som supplerer udtryk profilering eksperimenter såsom microarrays og RNAseq som reaktion på forskellige stimuli. Forståelse af de spatiotemporale infektioner med disse midler supplerer biologiske eksperimenter med henblik på at forstå deres interaktion med cellulære komponenter. Adskillige teknikker til visualisering af virus og bakterier, såsom reportergenassays systemer eller immunhistokemiske metoder er tidskrævende, og nogle er begrænset til at arbejde med modelorganismer og involverer komplekse metoder. FISH, der er målrettet RNA-eller DNA arter i cellen er en forholdsvis nem og hurtig migThOD for at studere Spatiotemporal lokalisering af gener og til diagnostiske formål. Denne metode kan være robust og relativt let at gennemføre, når de protokoller anvender korte hybridiserende kommercielt indkøbte prober, som ikke er dyre. Dette er særlig robust når prøveforberedelse, fiksering, hybridisering og mikroskopisk visualisering ikke involverer komplicerede trin. Her beskriver vi en protokol til lokalisering af bakterier og virus i insekt-og plantevæv. Metoden er baseret på simpel forberedelse, fiksering og hybridisering af insekt hele mounts og dissekerede organer eller håndlavede plante sektioner med 20 basepar korte DNA-prober konjugeret til fluorescerende farvestoffer på deres 5 'eller 3' ender. Denne protokol er blevet anvendt med succes til en række insekter og plantevæv, og kan bruges til at analysere ekspression af mRNA'er eller andre RNA-eller DNA-arter i cellen.
Introduction
Når man studerer samspillet mellem plante vira og andre patogener med deres inficerede plante værter, er det vigtigt at visualisere patogener og deres respektive nukleinsyrer in situ, uanset om de forårsage negative virkninger på deres værter. Dette er meget vigtigt, når man studerer patogen bevægelighed inden for og mellem planteceller. In situ lokalisering af genprodukter af patogenet er et vigtigt skridt, der supplerer andre tilgange til at studere patogenicitet processen. Mange plantepatogener, især virus, der overføres af insekter, der har komplekse og intime samspil med deres vektorer. Lokalisering af disse vira i deres smittebærere er vigtig for at studere vejen for transmission, og de mulige interaktion steder inde i vektor. Transmissionen af nogle insekt-vektoriserede plantevirus er hjulpet af endosymbiotic bakterier, der bor inden for disse insekter. For bedre at studere fremsendelse af disse plantevira by vektorer, er det også vigtigt at visualisere endosymbiotic bakterier i almindelighed, og de, der er involveret i virus transmission, i særdeleshed. Colokalisering af virus og endosymbiotic bakterier er således ønsket at undersøge de mulige sammenhænge mellem disse organismer i deres insekt vært. Bortset fra virus transmission, endosymbiotic bakterier påvirke flere aspekter af biologi insekt vektorer, og dermed rumlig lokalisering af disse bakterier indenfor insekter er af stor interesse og betydning.
Tomat gule blade krøller virus (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae) er den vigtigste virussygdom kompleks af dyrkede tomater på verdensplan 1-4. TYLCV er en Phloem begrænset virus og udelukkende vektoriserede af mellus Bemisia tabaci 5,6. En model, der beskriver translokation af begomoviruses i deres mellus vektorer er blevet foreslået 6-9. To specifikke barrierer aktivt krydses durning denne circulative transmission: mellemtarmen / hæmolymfe og hemolymph / spytkirtel barrierer. Denne transmission proces er en hypotese at være medieret af ukendte receptorer, som genkender virus capsidet. TYLCV menes at krydse B. tabaci mellemtarmen 6,10 og absorberes gennem den primære spytkirtel 6, før det sprøjtes ind i planten. I whitefly hæmolymfe, TYLCV interagerer med en GroEL protein produceret af insekt sekundære endosymbiotic bakterie Hamiltonella. Dette samspil sikrer sikker transport af TYLCV i hæmolymfe, og beskytter den mod angreb fra insektet immunsystemet 11. Hamiltonella og Portiera den primære endosymbiont af whiteflies, er opstaldet i bacteriocytes, insektceller findes i hemolymph og hus endosymbiotic bakterier 11. B. tabaci havne yderligere endosymbiotic bakterier, herunder Rickettsia, Arsenophonus, Wolbachia og Fritschea, der kan lokaliseres i eller uden for bacteriocytes og har forskellige virkninger på insektets biologi 12.
Adskillige rapporter har forsøgt at undersøge lokalisering af TYLCV i planter og mellus ved hjælp af tidskrævende og kostbare protokoller såsom Transmission Electron Microscopy (TEM), antistoffer og RNA in situ på mikroskopisk tyk sektion 10,13, beskrev en nylig undersøgelse lokalisering af plante virus inde i deres plante-og vektor værter ved hjælp af en simpel protokol 14. Her beskriver vi en enkel protokol til lokalisering af TYLCV i B. tabaci dissekeret midguts og spytkirtler, og i afsnit fremstillet af TYLCV-inficerede planter. Vi beskriver yderligere lokalisering af Portiera den primære endosymbiont B. tabaci, og dens sekundære endosymbionts Hamitonella, Rickettsia og Arsenophonus. Denne protokol er baseret på anvendelse af korte DNA-sonder, derer fluorescensmærket på deres 5'-ende, og specifikt at hybridisere til komplementære sekvenser i virale eller bakterielle gensekvenser. Prøven behandlingen er forholdsvis let, og det opnåede signal er meget specifik. Den beskrevne protokol kan anvendes til at lokalisere vira, bakterier og andre patogener i deres plante-, dyre-og insekt-værter, og kan yderligere anvendes til at lokalisere mRNA i en given væv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den her beskrevne til lokalisering af en plante virus i sin fabrik vært og insektvektor og endosymbiotic bakterier i deres specifikke mellus vært protokol kan tilpasses til lokalisering af andre vira i planter og selv i dyrevæv. Endvidere kan protokollen anvendes til at lokalisere endosymbiotic og sygdomsfremkaldende bakterier og andre mikroorganismer i vegetabilske og animalske systemer. De beskrevne metoder er afhængige af enkle koncept af hybridisering mellem en kort, fluorescens-mærket oligonucleotid-DNA-probe …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Ghanim lab blev støttet af forskningsbevilling nej. 908-42.12/2006 fra den tysk-israelske Foundation (GIF), ikke give. IS-4062-07 fra USA-Israel Binational Agricultural Research og Development Fund (BARD), og forskningsbevilling nej. 884/07 fra Israel Science Foundation (ISF) til MG
Materials
| Fluorescently labeled Probes | Metabion | 20 bp HPLC purified | Sequence designed by customer |
| Toluidine blue | Sigma-Aldrich | 89640 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F9037 | Molecular Biology Grade |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | Molecular Biology Grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Liquid Blocker | Ted Pella Inc. | 22309 |
References
- Czosnek, H., Laterrot, H. A worldwide survey of Tomato yellow leaf curl viruses. Arch. Virol. 142, 1391-1406 (1997).
- Ling, K. S., Simmons, A. M., Hassell, R. L., Keinath, A. P., Polston, J. E. First report of Tomato Yellow Leaf Curl Virus in South Carolina. Plant Dis. 90, 379 (2006).
- Polston, J. E., McGovern, R. J., Brown, L. G. Introduction of Tomato yellow leaf curl virus in Florida and implications for the spread of this and other geminiviruses of tomato. Plant Dis. 83, 984-988 (1999).
- Polston, J. E., Rosebrock, T. R., Sherwood, T., Creswell, T., Shoemaker, P. J. Appearance of Tomato yellow leaf curl virus in North Carolina. Plant Dis. 86, 73 (2002).
- Frohlich, D. R., Torres-Jerez, I., Bedford, I. D., Markham, P. G., Brown, J. K. A phylogeographical analysis of the Bemisia tabaci species complex based on mitochondrial DNA markers. Mol. Ecol. 8, 1683-1691 (2002).
- Ghanim, M., Morin, S., Czosnek, H. Rate of Tomato yellow leaf curl virus translocation in the circulative transmission pathway of its vector, the whitefly Bemisia tabaci. Phytopathology. 91, 188-196 (2001).
- Ghanim, M., Rosell, R. C., Campbell, L. R., Czosnek, H., Brown, J. K., Ullman, D. E. Digestive salivary and reproductive organs of Bemisia tabaci (Gennadius) Hemiptera: Aleyrodidae) B type. J. Morphol. 248, 22-40 (2001).
- Hunter, W. B., Hiebert, E., Webb, S. E., Tsai, J. K., Polston, J. E. Location of geminiviruses in the whitefly Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae). Plant Dis. 82, 1147-1151 (1998).
- Rosell, R. C., Torres-Jerez, I., Brown, J. K. Temporal pathway of geminivirus in whitefly extracts, saliva, hemolymph and honeydew. Phytopathology. 89, 239-246 (1999).
- Czosnek, H., Ghanim, M., Ghanim, M. The circulative pathway of begomoviruses in the whitefly vector Bemisia tabaci—insights from studies with Tomato yellow leaf curl virus. Ann. Appl. Biol. 140, 215-231 (2002).
- Gottlieb, Y., et al. The transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virusby the whitefly Bemisiatabaciis correlated with the presence of aspecificsymbiotic bacterium species. J. Virol. 84, 9310-9317 (2010).
- Brumin, M., Levy, M., Ghanim, M. Transovarial transmission of Rickettsia spp. and organ-specific infection of the whitefly Bemisia tabaci. Appl. Environ. Microbiol. 78, 5565-5574 (2012).
- Ghanim, M., Medina, V., Czosnek, H. . Localization of Tomato yellow leaf curl virus in its whitefly vector Bemisia tabaci. In Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, Management, Molecular Biology, Breeding for Resistance. , 175-187 (2007).
- Ghanim, M., Brumin, M., Popovski, S. A simple, rapid and inexpensive method for localization of Tomato yellow leaf curl virus and Potato leafroll virus in plant and insect vectors. J. Virol. Methods. 159, 311-314 (2009).
- Gotz, M., et al. Implication of Bemisia tabaci heat shock protein 70 in Begomovirus-whitefly interactions. J. Virol. 86, 13241-13252 (2012).
- Nirgianaki, A., et al. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47, 93-101 (2003).
- Baumann, P. Biology of bacteriocyte-associated endosymbionts of plant sap-sucking insects. Ann. Rev. Microbiol. 59, 155-189 (2005).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (Homoptera) Aleyrodidae). App. Environ. Microbiol. 72, 3646-3652 (2006).
- Li, Z. X., Lin, H. Z., Guo, X. P. Prevalence of Wolbachia infection in Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 54, 467-471 (2007).
- Skaljac, M., Zanic, K., Hrncic, S., Radonjic, S., Perovic, T., Ghanim, M. Diversity and localization of bacterial symbionts in three whitefly species (Hemiptera: Aleyrodidae) from the east coast of the Adriatic. Bull. Entomol. Res. 103, 48-59 (2013).
