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Immunology and Infection

형광 doi: 10.3791/51030 Published: February 24, 2014

Summary

우리는 곤충과 식물 조직에서 바이러스와 박테리아의 현지화 여기 현장 하이브리드 화에 간단한 형광 (FISH) 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 전체 산에서의 mRNA의 시각화 및 미세한 부분에 대한 확장 할 수 있습니다.

Abstract

현장 하이브리드(물고기)의 형광은 일반적으로 진핵 세포의 유전자 사본을 시각화하고 추가 바이러스 나 세균 감염과 같은 세포의 다른 구성 요소를 시각화하기 위해 수정 될 수 있습니다에 사용되는 다양한 기술에 주어진 이름입니다. 공간 현지화 및 감염 과정에서 바이러스와 박테리아의 시각화는 다른 자극에 대한 응답으로 이러한 마이크로 어레이 및 RNAseq로 표현 프로파일 링 실험을 보완하는 필수 단계입니다. 이러한 에이전트와 시공간 감염을 이해하는 세포 구성 요소와의 상호 작용을 이해하기위한 생물학적 실험을 보완합니다. 이러한 리포터 유전자 시스템이나 면역 조직 화학적 방법으로 바이러스와 박테리아를 시각화하는 몇 가지 기술은 시간이 많이 소요되어, 일부는 모델 생물로 작업하고 복잡한 방법을 포함하도록 제한됩니다. 세포 내에서 RNA 또는 DNA 종을 대상으로 FISH는 상대적으로 쉽고 빠른 날입니다유전자의 시공간 현지화을 연구 및 진단 목적으로 THOD. 이 방법은 강력하고 프로토콜이 비싸지 않다 짧은 혼성화, 시중에서 구입 한 프로브를 사용하면 비교적 쉽게 구현할 수 있습니다. 샘플 준비, 고정, 하이브리드, 현미경 시각화 복잡한 단계를 포함하지 않는 경우에 특히 강력합니다. 여기에서 우리는 곤충과 식물 조직에서 박테리아와 바이러스의 현지화를위한 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 자신의 5 '또는 3'에 형광 염료에 접합 된 짧은 DNA 프로브가 종료 20 염기쌍 간단한 준비, 고정, 곤충 전체 마운트 및 해부 기관 또는 손으로 만든 플랜트 섹션의 하이브리드 화에 기반하고있다. 이 프로토콜은 성공적 곤충 및 식물 조직의 개수에인가되었으며, 셀에서의 mRNA 또는 기타 RNA 또는 DNA 종의 발현을 분석하기 위해 사용될 수있다.

Introduction

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감염된 식물들은 호스트와 식물 바이러스 및 기타 병원체 간의 상호 작용을 연구 할 때, 그것은 그들이 호스트에 부정적인 영향을 야기하는지 여부를 불문하고, 동일 반응계에서 병원균 및 각각 핵산을 시각화하는 것이 중요하다. 식물 세포 내와 사이에 병원균의 움직임을 연구 할 때이 가장 중요하다. 병원체의 유전자 제품의 현장 현지화에서 병원성 과정을 연구하기위한 다른 방법을 보완하는 필수적인 단계이다. 많은 식물 병원체, 특히 바이러스는 자신의 벡터를 복잡하고 친밀한 상호 작용을 갖는 곤충에 의해 전달된다. 자신의 그림에있는이 바이러스의 현지화 전송 경로를 연구하는데 중요하고, 벡터 내부의 가능한 상호 작용 사이트. 일부 곤충 벡터가 식물 바이러스의 전송은 이들 곤충에 상주 endosymbiotic 박테리아에 의해 도움을 받는다. 더 나은 이러한 식물 바이러스 B의 전송을 연구하는자신의 벡터, 그것은 일반적으로 endosymbiotic 박테리아를 시각화, 특히 바이러스의 전송에 관련된 사람들, 또한 필수적입니다 Y. 바이러스와 endosymbiotic 박테리아의 colocalization을 따라서 자신의 곤충 호스트 이내에 생물 사이의 가능한 관계를 조사를 위해 요구된다. 이외에도 바이러스 전송에서, endosymbiotic 박테리아가 곤충 벡터의 생물학의 여러 측면에 영향을 미치는, 곤충 이내에 세균 따라서 공간 현지화 높은 관심과 중요하다.

토마토 노란 잎 말림 바이러스 (TYLCV) (Begomovirus, Geminiviridae)는 전 세계적으로 1-4 재배 토마토의 가장 중요한 바이러스 성 질병의 복잡합니다. TYLCV는 사부 제한 바이러스 독점적 가루이 담배가 담배가 루이 5,6에 의해 벡터가된다. 자신의 가루이 벡터의 begomoviruses의 전위를 설명하는 모델은 6-9 제안되었다. 두 가지 특정 장벽을 적극적으로 DUR 교차중장 / 체액과 체액 / 침샘 장벽이이 순환 전송을 보내고. 이 송신 처리는 바이러스 캡시드를 인식 불명 수용체에 의해 매개되는 것으로 가정된다. TYLCV는 B를 교차 생각된다 이 식물에 주입되기 전에 담배가 루이의 중장 6,10, 그리고는 기본 침샘 (6)을 통해 흡수된다. 가루이 체액에서 TYLCV는 곤충 보조 endosymbiotic 박테리아 Hamiltonella에 의해 생산의 GroEL 단백질과 상호 작용합니다.이 상호 작용은 체액에서 TYLCV의 안전한 전송을 보장하고, 곤충의 면역 체계 11. HamiltonellaPortiera, 기본 endosymbiont의 공격으로부터 보호 가루이의, bacteriocytes에 보관되어, 체액 및 집 endosymbiotic 박테리아 11. B.에서 발견 된 곤충 세포 담배가 루이는 리케차, Arsenophonus, Wolbachia프리쉬 등의 추가 endosymbiotic 박테리아를 항구bacteriocytes 내부 또는 외부에 현지화 할 수 있으며, EA는, 곤충의 생물학 (12)에 다양한 영향을 미친다.

여러 보고서가 미세한 두께 섹션 10, 13에 현장에서 이러한 투과 전자 현미경 (TEM), 항체 및 RNA 등 많은 시간과 비용이 많이 드는 프로토콜을 사용하여 식물과 가루이의 TYLCV의 현지화를 연구하려고했습니다, 최근의 연구는 지역화를 설명 간단한 프로토콜 14을 사용하여 자신의 공장 및 벡터 호스트 내부의 식물 바이러스의. 여기에서 우리는 B에서 TYLCV의 지역화를위한 간단한 프로토콜을 설명 담배가 루이가 인 midguts과 침샘을 해부하고, 절에서 TYLCV에 감염된 식물에서 준비했습니다. 우리는 더 Portiera, B의 기본 endosymbiont의 현지화를 설명 담배가 루이, 그 차 endosymbionts Hamitonella, 리케차Arsenophonus은.이 프로토콜은 짧은 DNA 프로브를 사용을 기반으로하는찬란하게 자신의 5 '말단에 표시하고, 특히 바이러스 성 또는 세균성 유전자 서열에 상보적인 서열에 하이브리드된다. 샘플 처리는 비교적 쉽게 얻어진 신호는 매우 다릅니다. 기술 된 프로토콜은 식물, 동물 및 곤충 호스트에서 바이러스, 세균 및 기타 병원체를 집중하는 데 사용될 수 있고, 추가로 임의의 주어진 조직에서 mRNA를 지역화하는데 사용될 수있다.

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Protocol

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1. FISH 분석을위한 일반 가루이, 식물, 그리고 바이러스의 준비

  1. 후면 B와 Q 생물 형면 모종 (고십 피움 히르 수툼 L. 이력서. 동명왕)에 가루이 및 25 ± 2 ° C, 상대 습도 60 %의 표준 조건 하에서 곤충 방지 케이지와 성장 객실 내부에 유지하고, 14 시간 조명 / 10 시간 어두운 광주.
  2. 앞에서 설명한 15-19로 endosymbiont 특정 프라이머를 이용하여 endosymbionts 감염을 테스트하기 위해 PCR을 수행합니다.
  3. 상업 보육 또는 식물 토마토 씨앗에서 토마토 모종 (까 esculentum 이력서. 비프 스테이크)를 구입.
  4. 식물이 TYLCV 15 가루이 매개 접종에 가장 적합한 연령 (섹션 아래 4.1 참조), 네 사실 잎의 단계에 도달 할 때까지 상기 한 바와 같은 사육 조건에서 유지한다.

2. 엔도 해충 처리, 고정, 프로브 디자인, 하이브리드 및 시각화공생 물고기

  1. 면 공장에서 흡입 10 성인 가루이를 수집, 또는면 잎에서 10 제 3 또는 4 령 약충을 선택합니다.
  2. 즉시 에펜 도르프 튜브 내부 Carnoy의 정착 (클로로포름 에탄올 빙초산 6:3:1 권 / 권)에 몰두. (바람직 야간) 야간 2 시간 동안 수정.
  3. 완전히 정착을 제거하고 2 시간 동안 에탄올에 6 %의 H 2 O 2의 탈색.
  4. 실온에서 몇 주에 몇 일 동안 무수 에탄올의 샘플을 보존하거나 다음 단계를 진행합니다.
  5. 디자인 프로브 각 세균의 16S 리보솜 RNA 유전자를 기반으로 보완 역 DNA 프라이머. 프로브를 설계 할 경우, 계정에 PCR 프라이머를 설계 같은 고려 사항을. 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용 BTP1 5'-Cy5에-TGTCAGTGTCAGCCCAGAAG-3 ', 5'-Cy3가 사포닌 Rb1-TCCACGTCGCCGTCTTGC-3', 5'-Cy3가 BTH-CCAGATTCCCAGACTTTACTCA-3 '및 5'-Cy3가 Ars2-TCATGACCACAACCTCCAAA-3 '를 각각 Portiera, 리케차, HamilonellaArsenophonus, 특정 타겟팅.
  6. ML 당 하이브리드 버퍼에 어둠 속에서 하룻밤 샘플을 교배 (20 MM 트리스 - 염산, pH를 8.0, 0.9 M의 NaCl, 0.01 % [중량 / 부피 나트륨 도데 실 황산, 30 % [권 / 권] 포름 아미드) 10 pmol의를 포함하는 형광 프로브 . 필요한 경우 다른 형광 염료로 하나 이상의 프로브를 결합합니다. 대상 세균없이 프로브 샘플 부정적인 컨트롤과 비감염 가루이를 사용합니다.
  7. 액체 차단제와 함께 포함 된 하이브리드 버퍼에, 현미경 슬라이드에, 전체 샘플을 장착 커버 슬립 커버, 형광 또는 공 초점 현미경 매니큐어 및 전망 밀봉.

3. 가루이 기관 해부, 고정, 하이브리드 및 TYLCV 물고기에 대한 시각화

  1. 지속적으로 흡입과 고대 근동에서 TYLCV에 감염된 토마토 식물에 사육 성인 가루이 수집아세톤 함침 종이 타월에 노출 sthetize. 아세톤에 너무 오래 노출 가루이 조직을 고칠 수있는 것 1 ~ 2 분 동안 가루이 노출. 특정 하이브리드를 확인하는 비감염 토마토 식물 및 컨트롤 대한 조사 샘플에 사육 nonviruliferous 가루이를 사용합니다.
  2. 우울증 현미경에 장착 가루이 스테레오 현미경을 사용하여 장기의 해부에 대한 슬라이드.
  3. 앞가슴에서 곤충의 머리를 당깁니다 및 1X PBS의 침샘을 해부는 그들의 작은 크기, 더 나은 시각화를 위해 1 % 톨루이딘 블루 염색으로 보충. 2 ~ 3 분 동안 얼룩의 흡수를 허용합니다.
  4. 흉부와 관찰하고 중장을 추방하기 위해 복부 사이의 시점에서 떨어져 곤충을 잡아 당깁니다. 복부 끝에 집게로 눌러 복부의 내용을 추방.
  5. 조심스럽게 성공 해부에서 PBS와 톨루이딘 블루를 제거하고 부드럽게 5 분 동안 장기를 해결하기 위해 Carnoy의 정착의 300 μl를 추가합니다.
  6. 해부 기관의 제어되지 않은 이동을 방지하기 위하여 오목 웰의 일측으로부터 아니라 위에서 정착액 인 dd. 일단 정착을 터치, 기관은 유리에 부착하고, 그 과정을 통해 그들은 이동하지 않습니다.
  7. 정착액을 제거하고 TYLCV 외피 단백질 유전자의 서열에 상보적인 형광 DNA 프로브 Cy5에-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 ', 10 pmol의 보충 하이브리드 버퍼 500 μl를 추가합니다.
  8. 바닥에 젖은 수건 종이로 작은 플라스틱 상자로 구성된 작은 습기 챔버 내부의 표본으로 슬라이드를 배양하여 어둠 속에서 실온에서 하룻밤 하이브리드.
  9. 하이브리드에 이어, 미세 해부 도구를 사용하여 기관을 선택하고 신속하게 DAPI (1X PBS에 0.​​1 ㎎ / ㎖)로 보충 및 액체 차단제와 함께 포함 된 새로운 하이브리드 화 버퍼 30 μl를 포함하는 신선한 현미경 슬라이드로 이동합니다.
  10. 커버 슬립과 표본을 커버, 재치를 밀봉형광 또는 공 초점 현미경 H 매니큐어와보기.

4. 공장 처리, TYLCV의 물고기를 손으로 절편, 고정 및 하이브리드

  1. viruliferous 가루이 매개 접종을 사용 TYLCV와 토마토 묘를 접종한다. 바이러스 symptomless 식물이 FISH 방법 접종 후 1 주간을 이용하여 검출 할 수있다. 일반적인 질병의 증상은 눈에 보이는 3 주 후 접종입니다. 특정 하이브리드를 확인하기 위해 컨트롤에 감염되지 토마토 식물없이 프로브의 샘플을 사용합니다.
  2. 토마토의 손으로 잘라 2-4센티미터 긴 길이 또는 단면을 제조하는 날카로운 조직 학적 면도날을 사용하여 줄기와 잎.
  3. 에펜 도르프 튜브에서 2 시간에 실온에서 밤새에 Carnoy의 정착의 섹션을 수정합니다.
  4. 정착액을 제거하고 실온에서 몇 주에 몇 일 동안 무수 에탄올의 섹션을 보존하거나 다음 단계를 진행합니다.
  5. 섹션을 씻으하이브리드 버퍼에 세 번, 1 분마다.
  6. TYLCV 코트 단백질 유전자의 서열에 상보적인 올리고 뉴클레오티드 형광 프로브를 Cy3-5'-GGAACATCAGGGCTTCGATA-3 '10 pmol의 보충 된 혼성화 완충액 500 μL와 섹션 혼성화.
  7. 하이브리드 버퍼에, 절에 세 번, 1 분마다 씻으십시오.
  8. DAPI (1X PBS에 0.​​1 ㎎ / ㎖)로 보충 및 액체 차단기에 포함 된 하이브리드 버퍼의 전체 마운트 섹션은, 형광 또는 공 초점 현미경 매니큐어 및 전망 인감, 커버 슬립 커버.

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Representative Results

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이 원고에서 공부 시스템은 그림 1과 TYLCV와 감염된 식물, 성인 및 가루이 B의 요정이 포함되어 있습니다 담배가 루이, 그리고 곤충에 TYLCV 전좌의 경로를 보여주는 가루이의 내부 해부학. 2 차 공생 Portiera와 보조 공생을위한 성인 가루이에 두 번 생선을 보여줍니다 Arsenophonus. 그림 3은 PortieraHamiltonella에 두 번 생선을 보여 주며, 그림 4는 Portiera리케차, B의 두 인물에 두 번 생선을 보여줍니다 담배가 루이 4 령 요정. 5 가루이 해부 중장에서 TYLCV와 DAPI 염색을 위해 FISH를 보여주고, 그림 6은 해부 가루이 주 침샘에서 TYLCV와 DAPI 염색에 대한 FISH를 보여줍니다. 7 TYLCV와의 DAPI 염색을 위해 FISH를 보여줍니다손으로 자른 TYLCV에 감염된 식물 섹션.

그림 1
그림 1.이 원고에서 공부 시스템의 일반 개요 토마토 노란 잎 말림 바이러스 (TYLCV). B)와 감염에 의해 발생.) 일반적인 질병의 증상 성인 가루이 4 nymphal 단계. C) 외형의 외형 가루이 개발 수명주기. 다른 nymphal 단계는 일반적으로 외부보기에 비슷하지만 크기가 작습니다. D) 성인 (B)의 내부 해부학의 개략도 담배가 루이는 식물 자체의 요소, 순환 및 전송 (검은 색 화살표)에서 TYLCV 취득의 경로를 표시합니다. 붉은 입자는 TYLCV의 비리를 참조하십시오. P : 체관부;의 : S tylet, E : 식도, FC : 필터 챔버, DM : 내림차순 중장;입니다 :; caeca, HG : 캘리포니아 중장 오름차순 hindgut, BC : bacteriocytes, PSG :. 주요 침샘이 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. B.에 PortieraArsenphonus 더블 FISH 담배가 루이 Q의 생물 형 성인 (A)과 레이블이있는 영역 (B) 시야 채널에서합니다. Portiera 특정 프로브 (빨간색) Cy5에와 Arsenphonus 특정 프로브 (에 접합 된 각 프로브에 의해 방출되는 형광 신호를 검출 결합 광학 섹션 모두에 확대 를 Cy3에 복합 노란색)를 사용 하였다. E : 계란.PG "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. B.에 PortieraHamiltonella 더블 FISH Cy5에과를 Cy3에 접합 Hamiltonella 특정 프로브 (녹색)에 접합 된 담배가 루이 요정. Portiera 특정 프로브 (빨간색)이 사용되었다.) Hamiltonella 하이브리드 신호가 결합 된 광 섹션에서 얻을합니다. B 어두운 필드에서 볼 때)에서 얻은 Portiera 하이브리드 신호 광학 부분을 결합하고 어두운 필드에서 볼. C) PortieraHamiltonella 밝은 필드에서 신호를 합병했다. D) PortieraHamiltonella 결합 신호 다에서 볼RK 필드. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4. B.에 Portiera리케차의 더블 FISH Cy5에와 리케차 특정 프로브를 Cy3에 접합 (파란색)에 접합 된 담배가 루이 요정. Portiera 특정 프로브 (빨간색)이 사용되었다.) 결합 광학 섹션에서 얻은 어두운 필드에서 볼 리케차 하이브리드 신호. B에서 얻은) Portiera 하이브리드 신호 시야에서 광 섹션을 결합하고 어두운 필드에서 볼. C) Portiera리케차 결합 신호. D) 리케차 결합 신호. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
성인 B.의 해부 중장에 TYLCV의 그림 5. FISH 를 Cy3에 복합 감염된 토마토 식물. TYLCV 특정 프로브 (빨간색)에서 48 시간 동안 바이러스를 인수했다가 루이의 여성이 사용하고, 중장은 조합에서 본 해부 중장 설치 및 시각화.) 전에 DAPI로 염색했다 시야에서 광 섹션. B) TYLCV 물고기 신호 (적색) 및 DAPI 염색 핵 어두운 필드에서 결합 된 광 섹션에서 볼 때 (파란색). FC : 필터 챔버, DM : descendi NG 중장은, 어디로 : 오름차순 중장, CA : caeca, HG : hindgut. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
성인 B.의 해부 주 타액선에 TYLCV의 그림 6. FISH 를 Cy3에 복합 감염된 토마토 식물. TYLCV 특정 프로브 (빨간색)에서 48 시간 동안 바이러스를 인수했다가 루이의 여성이 사용되었으며 설치 및 시각화.) 해부 및 DAPI 스테인드 차 타액 전에 DAPI로 염색 침샘 시야에서 조합 섹션. B) TYLCV 물고기 신호 (적색)과 어두운 필드에서 조합 섹션에서 본 DAPI 염색 핵 (파란색)에서 본 선으로.의 :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51030/51030fig6highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7
그림 7. TYLCV에 감염된 식물의 줄기를 통해 손으로 자른 종단면에 TYLCV의 FISH. TYLCV 특정 프로브를 Cy3에 접합 (빨간색)은 빨간색으로 표시 한 부분을 설치 및 시각화.) 이전에 사용하고 DAPI 염색과 결합 된 TYLCV의 체관부 체 요소의 신호, 어두운 현장에서 조합 섹션. B) 방향에 대한 시야에서 (A)에 나타낸 바와 같은 조합 섹션에서 볼 DAPI 스테인드 핵. 수소 이온 지수 (pH) : 체관부, XY :. 통 큰 메신저를 보려면 여기를 클릭하십시오나이.

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Discussion

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그 공장 주인과 곤충 벡터 식물 바이러스의 현지화 및 특정 가루이 호스트에 endosymbiotic 박테리아 여기에 설명 된 프로토콜은, 식물, 심지어는 동물 조직에서 다른 바이러스의 현지화에 적용 할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 endosymbiotic 병원성 박테리아와 식물과 동물의 시스템에서 다른 미생물을 지역화하는 데 사용할 수 있습니다. 기술 된 방법은 짧은, 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브와 DNA 셀 표적 DNA 또는 RNA 분자 간의 혼성화의 간단한 개념에 의존한다. 결과는 최소한의 배경을 가진 특정 하이브리드, 형광 또는 공 초점 현미경을 이용하여 검출 신호이다. 하나 이상의 유전자를 타겟팅 다른 형광 염료 여러 프로브가 동시에 사용될 수있다. 이는 단일 세포 또는 조직에서 하나 이상의 타겟을 시각화 가능하게한다. 이러한 프로토콜에 설명 된 절차는 간단하고 시료 처리 시간 아르최소이다. 이러한 높은 백그라운드 신호, 시험편 긴 처리 시간 및 분석을 위해 다수의 값 비싼 재료의 사용과 같은 다른 프로토콜들과 연관된 문제는 여기에 설명 된 프로토콜에 제한되지 않는.

B.의 B와 Q 생물 형 조건은 각각의 호스트 식물로, 어떤 가루이 생물 형에 적용 양육, 그러나, 담배가 루이의 가루이이 원고의 프로토콜을 설명하는 데 사용되었다. 가루이가 발생한 상황에서 3 주 동안의 수명주기를 완료한다. 사용되는 B의 생물 형 인구의 각각의 개인이 기본 endosymbiont Portiera에 감염되었고, 보조 endosymbiotic 박테리아 Hamiltonella리케차가. Q의 생물 형 개인이 PortieraArsenophonus에 감염되었다. 세계의 다른 가루이 인구는 이러한 나에 감염된 것으로 나타났다 다른 endosymbiotic 세균 종, 다른 공간 localizati와몸의 16 ~ 20의 패턴에.

TYLCV에 감염된 식물은 일반적으로 질병의 증상에게 접종 다음과 같은 세 가지 주 보여준다. TYLCV 국소화 증상 식물은 24 시간 동안 가루이 의해 바이러스 획득을 위해 이용 될 수 있으며,이 바이러스는 상술 FISH 프로토콜을 사용하여 감염된 식물 및 곤충에 검출 될 수있다. 곤충에 사용되는 프로브는 식물에서 Cy3가이 최적이며 엽록체, 식물 세포에서 가장 풍부 소기관으로 유사한 파장에서 형광을하지 않고,를 Cy3 및 Cy5에 포함하여 상이한 파장으로 절제 할 수있는 많은 형광 물질과 컨쥬 게이트 될 수있다.

박테리아와 식물과 곤충 바이러스의 지역화에 대한 설명 프로토콜의 성공적인 구현은 더 나은 시각화 및 프로브 침투, 특이도 좋은 프로브 설계에 대한 전체 곤충의 경우 2 O 2 H으로 제거하기 위해 시료의 좋은 고정에 따라 달라집니다 B에터 신호의 시각화. 식물에서 FISH의 경우, 손으로 만든 섹션은 좋은 프로브 침투 신호의 더 나은 시각화를 위해 가능한 한 얇은해야합니다. 이 절단에 도움이 스티로폼 조각 사이 잎으로 바꾸어 여러 벤더로부터 이러한 목적에서 살 수있는 전문 면도날을 사용하여 개선 될 수있다.

프로토콜은 그러나이 프로브 포맷 아세포 지역화 적합한 방법으로, 여기에서 설명하여, 발전 할 수있는 잠재력을 가지고, 표적 세포 내 지역화 적합하지 않다. 예를 들어, 여기에서 설명하는 짧은 프로브는 비오틴 차례로 TEM에서 시각화 할 수 스트렙 타비 딘에 접합 된 금 입자를 사용하여 타겟팅 할 수 없습니다 형광 분자로 분자에 접합 될 수있다. 이 후 변형 유전자 성적 증명서 및 미생물 등 여러 가지 대상의 세포 내 현지화를 위해 적당 할 수있다. 마지막으로, 설명 된 프로토콜의는 DNA와 RNA가 아니라 단백질과 같은 핵산과 하이브리드 화에 적합하다.

여기에 설명 FISH 프로토콜에서 최상의 결과를 얻기 위해, 신선한 곤충 및 식물 물질뿐만 아니라 신선한 고정액과 혼성화 버퍼를 사용하는 것이 최선이다. 프로브는 항상 반복되는 동결 융해를 피하기 위해 작은 분량 씩 -20 º C에서 보관해야합니다. 각 설명 단계의 처리 시간은 연구 유기체에 따라 교정 될 수있다. 프로토콜에서 언급 한 바와 같이, 고정 및 탈색 다음, 가루이 식물 샘플을 상온에서의 용액 오랫동안 보존 할 수 있습니다. 한 위치에서 다른 위치로 처리를 위해 샘플을 보낼 때, 또는 긴 시간 코스 실험을 수행 할 때이 단계에 특히 유용합니다. 혼성화 신호의 품질이 장시간 보존 다음 영향을받지 않았다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

Ghanim 실험실에서 연구는 더 연구 보조금에 의해 지원되지 않았다. 독일 - 이스라엘 재단 (GIF)에서 908-42.12/2006는, 아니 부여합니다. IS-4062-07 미국 - 이스라엘 양국 농업 연구 개발 기금 (BARD), 연구 보조금 아니요. MG 이스라엘 과학 재단 (ISF)에서 884 / 07

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fluorescently labeled  Probes Metabion 20 bp HPLC purified Sequence designed by customer
Toluidine blue Sigma-Aldrich 89640
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Formamide Sigma-Aldrich F9037 Molecular Biology Grade
Tris-HCl Sigma-Aldrich T5941 Molecular Biology Grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Liquid Blocker Ted Pella Inc. 22309

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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형광<em&gt; 현장에서</em바이러스 및 식물과 곤충 조직에서 Endosymbiotic 박테리아의 지역화를위한&gt; 혼성화 (FISH)
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Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).More

Kliot, A., Kontsedalov, S., Lebedev, G., Brumin, M., Cathrin, P. B., Marubayashi, J. M., Skaljac, M., Belausov, E., Czosnek, H., Ghanim, M. Fluorescence in situ Hybridizations (FISH) for the Localization of Viruses and Endosymbiotic Bacteria in Plant and Insect Tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030, doi:10.3791/51030 (2014).

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