Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

משלוח הנייד intramyocardial: תוכן בלבבות Murine

doi: 10.3791/51064 Published: January 24, 2014

Summary

משלוח תא intramyocardial במודלים עכבריים של מחלות לב וכלי דם, כגון יתר לחץ דם או אוטם שריר הלב, הוא בשימוש נרחב כדי לבדוק את הפוטנציאל הטיפולי סוגי תאים שונים במחקרי התחדשות של. לכן, תיאור מפורט ויזואליזציה ברורה של הליך כירורגים זה יעזרו להגדיר את הגבולות ואת היתרונות של ניתוחים טיפוליים תא לב וכלי דם במכרסמים קטנים.

Abstract

מחקרים קודמים הראו כי משלוח התא מקדם שיפור תפקוד לב על ידי שחרורו של ציטוקינים וגורמים המגבירים revascularization רקמת לב והישרדות תא. בנוסף, תצפיות נוספות העלו כי יש תאי גזע ספציפיים, כגון תאי גזע לב, תאי גזע mesenchymal וcardiospheres היכולת לשלב בתוך שריר הלב שמסביב על ידי הבחנה לתוך שריר לב, תאי שריר חלק ותאי האנדותל.

כאן, אנו מציגים את החומרים ושיטות כדי לספק באופן אמין תאי noncontractile לתוך הקיר של החדר השמאלי של עכברי immunodepleted. הצעדים הבולטים של הליך microsurgical זה כרוך בהרדמה והזרקת שיכוך כאבים, אינטובציה intratracheal, חתך כדי לפתוח את החזה ולחשוף את הלב ואספקה ​​של תאים על ידי מחט 30 מד סטרילי ומזרק microliter דיוק.

עיבוד רקמות בהיקף של קצירת לב, embedding, חתך וצביעה היסטולוגית הראתה כי הזרקת תאי intramyocardial הופקה נזק קטן באזור epicardial, כמו גם בקיר של החדר. תאי Noncontractile נשמרו לתוך קיר שריר הלב של עכברי מדוכאי חיסון והיו מוקפים בשכבה של רקמת fibrotic, עשוי להגן מפני לחץ לב ועומס מכאני.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקולי מסירת תאים שונים נבדקו במודלים עכבריים ועכברושים של מחלות לב וכלי דם, במטרה לתרגם את היעילות, היעילות ובטיחות של הליך הניסוי בחולים אנושיים. בלב מכרסם קטן, משלוח תא intramyocardial הוא השיטה ריאלי ביותר של תא משלוח 1,2, ואילו בלב החולדה antegrade 3 ועירוי תאים 4 intracoronary מדרדר יכול לשמש גם. שני שיטות יש יתרונות ומגבלות. יש תא משלוח דרך מסלול intracoronary יתרונות תיאורטי על זריקה תוך שרירית ישירה בקידום הפצה סלולרי הגלובלית 3, אבל יש לה גם את הסיכון לגרימת 3,5 תסחיף כלילית. מגבלות על אספקת intramyocardial משויכות פגיעה מכאנית, דלקת חריפה, ו6,7 נזק בשריר הלב. בבני אדם, תאים לתיקון לב מועברים על ידי הזרקת intramyocardial דרך epicardial endocardial או כירורגיםלהתקרב או על ידי תוואי עורקי intracoronary 8. הזרקה במסלולי transvascular מתאימה בחולים עם אוטם שריר הלב אקוטי וreperfused, אבל ייתכן שלא ניתן במקרה של חסימות בסך הכל או זרימה לקויה בתוך כלי השטח בוצע 9. הזרקה ישירה לתוך הקיר של החדר על ידי הזרקת transendocardial או transepicardial היא אפשרית מבחינה טכנית, בהתאם למצב בריאות המטופל. ואכן, זה כבר הראה כי טכניקה זו היא בטוחה 10,11, אם כי להזרקת transepicardial ניתוח חזה פתוח הוא הכרחי ולtransendocardial גישות מיפוי אלקטרו לכל חולה נדרש לבדל את האתרים של שריר הלב איסכמי או מצולק קיימא 9.

חשוב מכך, במחקרים לטיפול בתא הבחירה של התא הטוב ביותר כדי להיות מושתלים היא עדיין תחת חקירה. ניתוחים לטווח קצר (4 שבועות) הראו כי הזרקה של תאי גזע לב המוגדרים כcardiospheres 13 מושרה התאוששות תפקודית לב ב14 ועכברוש 15 מודלים Murine של אוטם שריר הלב על ידי הפחתת גודל צלקת ומוות של תאים. השתלה אלוגנאית של cardiospheres במודל אוטם שריר הלב חולדה ללא דיכוי חיסוני נמצאה להיות בטוח, קידמה התחדשות לב, ושיפור בתפקוד לב באמצעות גירוי של מנגנוני תיקון אנדוגני 15. תאי אב Lin-/c-kit + מבוגר בלב הוצגו להיות עצמי חידוש, clonogenic, וmultipotent במבחנה ובחי, וכאשר הוא מוזרק לתוך לב חולדה איסכמי מחדש חלקים גדולה של קיר שריר הלב הפגוע 16 והיו לי יכולת ליצור עורקים הכליליים מוליך וגודל בינוני 17. נתונים מבטיחים אלה מונע על שלב I ו-II של ניסויים קליניים בבני אדם: הזרקה של תאי גזע mesenchymal עצמיים ואלוגנאית (MSC) 18, cardiospheres 19, או תאי c-Kit חיוביים גזע לב (CSC) 20 בלב אדם איסכמי כל הראו השפעות מועילות בתפקוד לב במחקרים לטווח ארוכים. עם זאת, מעקב ארוך טווח נרחב ומטה אנליזה רטרוספקטיבית, הוכיחו כי טיפול בתאי גזע מספק יתרון משמעותי לחלק מחולים, אבל לא באחרים עם מגוון של תוצאות בלתי צפויות 21. יתכן כי מגבלות אלה יחייבו את העיצוב של פרוטוקולים ספציפיים של משלוח תא עבור כל אדם ובכל מחלה.

במודלים של עכבר וחולדה, מחקרים ארוך טווח עולים כי הזרקת תאים לא שפרה את תפקוד לב (12 חודשים) נוספת. ואכן, שתלי של cardiomyocytes גזע העוברי האנושי שמקורם בתא (hESC-CM) היו מבודדים במידה רבה משריר לב המארח בשכבה של רקמת fibrotic 22,23. תוצאות דומות נצפו לאחר השתלת intramyocardial של myoblasts שלד ללב של עכברי infarcted 24. Furthermoמחדש, ביכולות ארוכות הטווח של MSCs אלוגנאית כדי לשמור על תפקוד בלב infarcted היו מוגבלות על ידי המעבר מimmunoprivileged למדינת immunogenic לאחר התמיינות 25.

אם ניקח בחשבון את האתגרים וסיכויים שתוארו לעיל, אנו מראים כאן כיצד להעביר את התאים על ידי הזרקת intramyocardial בעכברים. אנו צופים כי תאים ללא מאפייני התכווצות cardiomyocyte אינם קשורים לשריר לב המארח ויוצרים מסה מלוכדת עם מחסום fibrotic דק. אמנם בחלק ממקרי תוצאה זו עשויה להיות יתרון, הניתוח הבא עשוי להיות שימושי כדי להבין כיצד engraftment התא עשוי להיות מווסת כדי ליצור מבני שריר הלב פונקציונלי מחוברים גם כן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם בינלאומי (הוראת 2010/63/EU של הפרלמנט האירופי) ו( Office Home בריטניה, חוק 1986) הלאומי תקנות. ההליכים המתוארים במסמך זה הם חלק מתכנית העבודה תחת רישיון הרשויות בבריטניה שלנו ולא היה מבוצעים במטרה של הקלטה.

1. הכנת תאים

פרוטוקול זה מתאר את הכנתו של קו תאים ספציפי (כליה עוברי אנושית, HEK293 תאים) למטרות הדגמה. פרוטוקולי תא ספציפי חייבים להיות מועסקים לגידול וסופו של דבר תאי גזע pluripotent או מבוגר לשושלות תאים ספציפיים.

  1. לגדל תאי DMEM תקשורת (גלוקוז גבוהה, 4,500 מ"ג / ליטר) המכיל 1% פירובט נתרן, 2 גלוטמין מ"מ, פן / סטרפטוקוקוס אנטיביוטיקה 1% ו10% בסרום שור עוברי (FBS). צלחת 10 סנטימטר אחד יש בדרך כלל לפצל ב1:3 תקשורת בתוספת טרי כל יומיים.
  2. טיפול בתאים במתינות עם trypsב1x ו resuspend במדיום DMEM כפי שמתוארים ב1:1.
  3. ספירת תאים בתא hemocytometer ולאסוף 3 x 10 6 תאים לתוך צינור נפרד.
  4. צנטריפוגה בהרוטור דלי נדנדה ב100 גרם במשך 5 דקות.
  5. בטל supernatant ולשטוף את התא גלולה עם חיץ פוספט סטרילי 2x.
  6. Resuspend ב PBS 1x בריכוז של 10 6/50 ul להזרקה לתוך החדר השמאלי של עכברי immunodepleted.

2. תנאי Presurgical

  1. לשמור על עכברי immunodepleted (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD) עם כדורי סטרילי מזון ומים במבודד טמפרטורה מבוקרת (22 מעלות צלזיוס; טבלת 1) לפני כל ניתוח.
  2. לבצע ניתוח של עכברי immunodepleted תחת הזרימה למינרית. נקה את אזור העבודה עם אתנול 70% וחיטוי כלים כירורגיים (מלקחיים ומספריים).
  3. הפעל כריות חימום לניתוח ולהחלמה. כריות חימום חשובותכדי לחסום את הירידה של טמפרטורת גוף מתרחשת בזמן ולאחר ניתוח.
  4. מניחים כלוב נקי וautoclaved על כרית התאוששות לחימום.
  5. להעביר את העכברים בכלוביהם המקוריים מהמבודד לניתוח החדר לתוך שקית autoclaved סטרילי.
  6. לשקול את העכבר ובהתאם למשקל הגוף להזריק תת עורית (SC) תמיסה המכילה medetomidine וקטמין הידרוכלוריד בדילול מלא ב0.9% תמיסת מלח סטרילית כדי להרדים את העכבר, כמו גם להירגע השרירים (medetomidine 1 מ"ג / קילוגרם; קטמין הידרוכלוריד 75 מ"ג / קילוגרם).
  7. הסר את העכבר מהכלוב כאשר בהרדמה מלאה (בתוך 1-2 דקות, לא הבוהן קמצוץ רפלקס לאחר גירוי)
  8. להחיל את אזור גרון קרם להסרת שיער בצד השמאל של החזה ו. לאחר כמות מתאימה של זמן (כ 2-5 דק '), לנגב את השערות רופפות עם רקמת מים רטובים.
  9. מניחים את העכבר בלוח הניתוח במצב שכיבה. מןנקודת מבטו של המנתח העמדה היא למטה את הראש אנכי, זנב.
  10. הזרק פתרון במשככי כאבים ב0.1-0.2 מיקרוגרם / g בדילול מלא בתמיסה סטרילית תמיסת מלח (עצירות) לתוך תת עור הגפיים האחורי ולכסות את האזור המגולח עם יוד povidone הפתרון אספטיים באמצעות מטוש צמר גפן קצה.
  11. פוקוס מיקרוסקופ (האובייקטיבי 2.5x) באזור הגרון.

3. תנאי כירורגי

  1. במספריים קהים לעשות חתך בעור הגחון קו האמצע של כ 0.5-1 סנטימטר אורך מעט מתחת לסחוס cricoid. להפריד את העור מרקמות חיבור כדי להמחיש את בלוטות הרוק.
  2. לפצל את בלוטות הרוק בחלוקת קו האמצע הטבעי שלהם בו זמנית על ידי משיכת כל צידת חלק עם מפשק חזה מלקחיים ומגנטיים ולחשוף את קנה הנשימה.
  3. משוך את הלשון בעדינות לצד לחשוף את הגרון. חלק את צינור אינטובציה בזהירות לתוך קנה הנשימה. קצה הצינור גלוי דרך l מוצגarynx וקנה נשימה. חשוב מכך, אם הצינור הוא ב, אבל לא נראה בבירור, זה בוושט. הסר אותו ולשנות את המיקום של קצה הצינור.
  4. חברו את הצינור למכונת ההנשמה. הגדר את נפח הפעימה ב200 μl ושבץ 150 / דקה. אבטח את צינורות האוורור בלוח הניתוח עם קלטת.
  5. עם מספריים ומלקחיים בוטים, להפוך את זנב אנכי בראש 1 - ל1.5 ארוך סנטימטר חתך בעור מעל אזור בית החזה השמאלי.
  6. שחרר את העור משכבות רקמה / שריר חיבור ושרירי חזה הגדולים וקטנים מבלי לבצע חתכים.
  7. לבצע פתיחת בית החזה בין הצלעות השלישית והרביעית באופן הבא:
    1. לנקב את שכבת השרירים הבינה צלעיים על ידי צביטה ומגרד עם מלקחיים קטנים, מעוגלים.
    2. ברגע ששכבת השרירים הבינה צלעיים מחוררים, מניח את מפשק החזה כדי לפתוח את חלל החזה מקסימאלי. החלקים העליונים ואמצעיים של החדר השמאלי (LV) עם האפרכסת שמעליה (אטריום) שלה הםעכשיו נראה לעין.
  8. הכן את מזרק דיוק עם תאים. המזרק צריך להיות מסוגל לספק כמות נפח 10 ul לכל זריקה. יצוק מחט G 30 בקצה של המזרק.
  9. לתקן עם קלטת צינורית פלסטיק קטנה (מ20 G introcan-W) על המחט, והשאיר נחשף 1 מ"מ בלבד כולל הטיפ הפתוח של המחט. זה ימנע את המחט מחירור קיר חדר שמאל כולו והזרקת התאים לתוך חלל החדר השמאלי.
  10. בעזרתו של אובייקטיבי 5X, לדמיין בהגדלה זה החדר השמאלי ומזריק את התאים לתוך הקיר של החדר השמאלי ב5 מקומות שונים (כל זריקה תספק 10 ul עבור סכום כולל של 106 תאים המוזרקים). אם הזריקה היא מוצלחת, אזור לבן והעדר לגל גדול של התאים יהיו גלויים (אם הזריקה לא הייתה מוצלחת, בעלי החיים לא יורשו אנליזה פונקציונלית).
  11. הסר את מפשק. סגור את קיר בית החזה ב y מצרף שתי צלעות נפרדות עם שני תפרים של 6-0 תפר משי.
  12. לחות שרירי החזה ועור עם קצה כותנה הספוג PBS 1X והניח בעדינות את שרירי גב למצב המקורי עם המלקחיים.
  13. סגור את העור עם תפרים של 3-4 6-0 תפר משי. תפר את החתך בגרון עם 2-3 תפרים כדי לסגור את העור.
  14. הזרק atipamezole (1 מ"ג / קילוגרם ריכוז סופי) לחזור השפעות ההרדמה.
  15. ברגע שהעכבר מתחיל לנשום באופן עצמאי, מוציא את הצינור מקנה הנשימה ולשים את העכבר על הצד הימני שלה. העכבר צפוי להתאושש תוך מספר דקות.
  16. כאשר העכבר מתחיל להסתובב וללכת, למקם אותו בכלוב החם ההתאוששות (כלוב IVC קטן עם ראש סגור מסונן) לשעה.
  17. השאר את החיות לילה בתיבה מבוקרת מחוממת (37 מעלות צלזיוס).
  18. למלא צלחת עם מים ומזון גלולה כדי לתמוך בהתאוששות במהלך 2 הימים הראשונים שלאחר ניתוח.

ss = "jove_title"> 4. ניתוח שלאחר ניתוח

עשרה לבבות הוזרקו תאים ו10 לבבות לא הזריקו שליטה מנותחים בהיסטולוגיה כדלקמן:

  1. לבצע ניתוח של התאים המורכבים 1 שבוע לאחר ההזרקה (איורים 1 ו -3).
    1. לאחר המתת חסד על ידי מנת יתר של isoflurane, ינקב את לבם עם 20 מיליליטר של paraformaldehyde 4% (PFA) כדי לתקן את הרקמה. מייבשים את הרקמה קבועה בהגדלת אחוזי אתנול (מ70-100%) ולהטביע בבלוקי פרפין.
    2. סעיף הלבבות בפרפין עם microtome במיקרומטר 5 ואת הכתם עם hematoxylin ו eosin לניתוח צורני.
    3. דמיין רקמת חיבור באמצעות כתם Trichrome של מייסון.
    4. לנתח את התמונות תחת מיקרוסקופ סורק שקופיות (איורים 1 א, 2 א, 3 א, 3 ב, 3 ג ו) ולדמיין את כל הלב בתצוגת ציר קצר באמצעות מיקרוסקופ סורק שקופיות דיגיטלי (figuמיל 1B ו 1C).
  2. לאחר הניתוח לעיל, deparaffinize רקמות הלב בקסילן, רעננותם על ידי השריית דגימות בהפחתת אחוזי אתנול (מ100% למים) ותהליך הסריקה מיקרוסקופית אלקטרונים (SEM) כדלקמן:
    1. דגירה בלוקים deparaffinized עם 1% חומצה טאני ב0.1 חיץ פוספט M במשך שעה 1.
    2. מייבש את הדגימות בהגדלת אחוזי אתנול (25-100%).
    3. דגימות יבשים עם HMDS (hexamethyldisilazane).
    4. הר את הדגימות בסטאבס עם אצ'יסון הכסף דאג ומעיילם עם הזהב ופלדיום.
    5. צפה בדוגמאות במיקרוסקופ אלקטרונים סורק אנליטית (איור 2 ב).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אנו מזריקים HEK293 תאים, שניתן להבחין מתאי הלב על ידי המורפולוגיה שונה שלהם (איור 1), עם צורה מרוצפות בהשוואה לשריר הלב המוארך (איור 1 א). תאי HEK293 היו יותר תגובתי לצבע hematoxylin (צבע כחול) בהשוואה לשריר לב (בצבע ורוד), סביר להניח כי התוכן שלהם המוגבר הגרעיני (איור 1 א). כדי להבדיל עוד יותר את התאים המוזרקים מן הרקמה המארחת, HEK293 תאים תויגו עם DAPI 2 שעות לפני הזריקה. שכותרתו תאים היו גלויים לעין ברקמת שריר הלב כפי שמוצגים באיור 1E. עכברי דמה המופעל בקרה לא הראו כל נזק בלב השלם (איור 1 ג) ושלמות הרקמה (1D איור).

בתצוגת ציר קצר כל הלב, תאים מוזרקים נראו כקבוצה הומוגנית באזור ההזרקה (איור 1). ג מקובציםאמות היו מוקפות על ידי שכבה דקה של רקמת fibrotic, שהופיעה כאזור כחול בצביעת Trichrome (איור 2 א). תאים לא היו קשורים לרקמת שריר הלב מארח, כפי שמוצגים על ידי סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים (איור 2), ככל הנראה בשל תפקוד noncontractile ומבנה תאי שונה.

בנוסף לתצפיות לעיל, אנו ציינו אזורים קטנים של נזק שבו המחט הייתה מוזרקת (איור 3 א). אזורים אלה לרוץ מהשכבה החיצונית epicardial של הלב לתוך קיר שריר הלב (איור 3 א). תאים מוזרקים (חץ ירוק, איור 3) נמצאים בקרבתו של האזור הפגוע (חיצים שחורים, איור 3 ב). תאי DAPI החיוביים היו גלויים לאורך אתר הזרקה (איור 3 ג, חצים לבנים). שבוע לאחר פציעה, assay Tunel לא הראה תאים אפופטוטיים מוגברים באתר של פציעה, מה שמרמז שנימקבמקום אפופטוזיס התרחש לאחר הזרקת המחט (איור 3D).

איור 1
איור 1. ניתוח היסטולוגית של תאים מוזרקים. א) שבוע לאחר הזרקת תאי לב היו משובץ בפרפין ומעובד לhematoxylin ומכתים eosin. HEK293 תאים מוזרקים נכחו לתוך הקיר של החדר השמאלי. תמונות התקבלו עם הקרינה סטריאו מיקרוסקופ. B) Trichrome רקמות מוכתמים הראו כי התאים קובצו באותו האזור שבו הם הוזרקו (חץ). פנלים מימין למטה מראים את הציר הקצר להציג עם ימין (RV) וחדרים שמאלי (LV). המלבן האדום מראה את האזור שבו תאים נשמרים (1.5x). התמונות נרשמו עם מיקרוסקופ סריקת שקופיות. C) Trichrome staining לבבות דמה המופעל שליטה. צפה בכל לב עם 5X אובייקטיבי. ד) Trichrome הכתמה של עכברי דמה המופעל מראים שלמות רקמות שריר הלב. ה) HEK293 תאים היו מוכתמים DAPI 2 שעות לפני הזריקה. שבוע לאחר הזרקת לבבות היו מוטבעים אוקטובר ומחולקים בcryostat ב6 מיקרומטר. תאים היו דמיינו תחת UV במיקרוסקופ פלואורסצנטי. על ימין ועל חדרים הנכונים מוצגים. בחדר ממני, פנל ימני, הקו הלבן מסמן את שכבת epicardial. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2
איור 2. היווצרות של שכבת fibrotic בין תאים מוזרקים ורקמה מארחת. א) להראות מכתים Trichromeרקמת collagenous נוצרה בין תאים ורקמות HEK293 עכבריים שריר הלב (חיצים). התמונות נרשמו עם מיקרוסקופ סריקה דיגיטלי. ב ') לבבות היו deparaffinized ומעובד לסריקה מיקרוסקופית אלקטרונים. תמונות נרשמו עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ולהראות סיבי קולגן (חיצים) בין התאים המוזרקים HEK293 (בצד שמאל) ושריר לב המארח (בצד ימין). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3
איור 3. הזרקת תאים המיוצרת באזורים קטנים של נזק. א) Trichrome מכתים מראה אזורים קטנים של נזק שבו מחט הייתה מוזרקת (צבע הכחול;. חיצים) ב ') סעיפי פרפין הוכתמו על ידי Trichrome staining והאזור שבו התאים הוזרקו הוא מסומן על ידי חצים שחורים. תאים מוזרקים (חץ ירוק) היו גלויים בסמיכות לאזור פגוע. C) HEK293 תאים, מוכתמים בDAPI 2 שעות לפני הזרקה, היו נוכחים לאורך אתר ההזרקה (חץ לבן). אתר הזרקה מסומן בחץ ירוק והקו הפתוח הלבן מסמן את שכבת קרום הלב. ד) Tunel assay, שבוצע על סעיפי פרפין, לא הראה גרעינים חיוביים ניאון רלוונטיים. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בכתב היד הזה, שהראינו כיצד לבצע הזרקת intramyocardial של תאים בלב עכברי. כהוכחה של מתודולוגיה זו, יש לנו להשתמש HEK293 תאים. חשוב להדגיש, כי תאי HEK293 אינם משמשים בכל מחקר טיפול בתא, ולכן הממצאים של כתב היד הזה אינם מתאימים לתרגום ישיר לגישה טיפולית. עם זאת, העובדה כי תאי HEK293 אינם תאי התכווצות ולא transdifferentiate בסוגי תאים אחרים ממקדת את תשומת לב בהיבטים טכניים כגון מאפיינים של התאים כדי להיות מועבר ואת המסלול של משלוח.

זה כבר דווח כי מסלול intramyocardial נוטה לגרום צבירי תאים משובצים ברקמת לב 24,26, ואילו המסלול intracoronary יכול לספק הפצה הומוגנית יותר באתר של פציעה. להחלפת cardiomyocyte, תא התורם האידיאלי צריך להפגין properti אלקטרו, המבני והתכווצותes של שריר לב וצריך להיות מסוגל לשלב מבחינה מבנית ותפקודי לרקמה המארחת, דבר המצביע על הצורך בתכנית התמיינות תאים להיות מועסקים לפני ההשתלה.

נקודות מפתח לניתוח מוצלח ניתן לסכם באופן הבא:

  1. הרדימי עכברים עם תרכובות בזריקות להאט את קצב לב ולהקל על הזרקת תאים
  2. בצע cannulation intratracheal של עכברים לטובת פונקציונלי ריאות.
  3. לבצע פתיחת בית החזה הימנעות חתך שריר כדי לשמור על פונקציונליות שריר חזה לנשימה נכונה.
  4. לאחר חשיפת הלב, לבחון את החדר השמאלי מתחת למיקרוסקופ כדי לחזות אם הזרקה התרחשה (נראה כמו צבע חיוור).
  5. שימוש במחט דקה ומזרק דיוק כדי למנוע ניקוב נרחב של רקמת שריר הלב ולהזריק את הכמות הרצויה של חומר, בהתאמה.
  6. לנדן את המחט עם מערכת צינורות פלסטיק חשיפת only חלק הקצה. היכולת זו תאפשר כניסה של המחט עד לעומק מסוים לתוך החדר השמאלי (0.5 מ"מ), הימנעות מהזרקה לתוך חלל החדר.
  7. סגור את החזה ואת החלל בין הצלעות בזהירות כדי להימנע מחשיפה של ריאות ללחץ חיצוני.

טכניקה זו יש רמה גבוהה של הצלחה אם מצבים בריאותיים שלאחר הניתוח מקבלים עדיפות. בעלי חיים חייבים להיות אינטנסיבי במעקב כל יום עד שבוע לסימני מצוקה וכאב. הזרקה של תרכובות משכך כאבים לטיפול בכאב חייבת להיות מנוהלת כנדרש לאחר ניתוח. יישום מקומי של הקלה על כאב, כמו לידוקאין, עשוי לשמש גם. דימום צריך למנוע על ידי טכניקות כירורגיות זהירות. עם זאת, אם מתרחשים, ניתן לעצור אותו על ידי דחיסה או קשירה של כלי דם. יש לנו לציין כי בעלי החיים לשחזר טובים יותר ומהר יותר אם תישארו בקופסא חימום ב37 מעלות צלזיוס למשך 12-20 שעות לאחר ניתוח. טיפול זה יחסום ירידת טמפרטורת גוף מהירה, ולאמלי שהתרחש לאחר הליך וממשל של הרדמה כירורגית. זיהומים לאחר ניתוח עלולים להתרחש, אבל צריך להיות פחות מ -1%. נהלים אספטיים חייבים להיות אחריו בקפדנות כדי למנוע זיהום. זיהום מקומי יכול להיות מטופלים עם יישום של אנטיביוטיקה. חשוב לציין, התייבשות צריכה להיות נשלטה על ידי הזרקה תת עורית של תמיסת מלח.

עדיף לנהל בזריקות הרדמה בשאיפה למעלה, כגון isoflurane. ואכן, אנו ציינו כי הרדמה בזריקות ירד קצב לב, ומאפשר הזרקה קלה יותר ופחות דימום ללא גרימת אי נוחות לבעלי חיים.

למרות פולשנית, הזרקה של כמויות קטנות של תאים (25-50 μl) בעכברים היא אפשרית ובטוחה. היו לנו תמותה פחות מ 1% על ידי הזרקת 50 μl של תאי HEK293 ב 5 אזורים שונים של קיר החדר השמאלי (10 μl / הזרקה). מתודולוגיה זו הבטיחה את נוכחותם של התאים במספר תחומים של קיר שריר הלב, וזה חשוב בטיפול בתאי גזע, כאשר אזורים מורחבים של נזק איסכמי צריכים להגיע על ידי התאים נמסרו. כדי לבצע ניתוח פחות פולשני, כמה פרוטוקולים שפורסמו לאחרונה, למרות שהשחזור שלהם במעבדות שונות עדיין לא אומת. לדוגמא, הזרקת תאים יכולה להתבצע על ידי טכניקה קרוב חזה באמצעות אקו ברזולוציה גבוהה 27. השימוש במערכת זו דורשת מיומנויות מפעיל גבוהות כדי להמחיש באופן ברור בתמונה דו ממד על הקיר של החדר השמאלי ולשמור את המחט במיקום מסוים במהלך מחזורי סיסטולי / דיאסטולי נורמלים. היתרון של שיטה זו הוא ההשתלה של התאים לתוך שריר הלב העכבר למקומות רצויים במסגרת זמן רלוונטית מבחינה קלינית לאחר אינדוקציה אוטם שריר הלב. עם זאת, גישה זו אינה אפשרית עם ניתוחים כגון אינדוקציה שריר הלב אוטם או פסי transaortic בגלל התמותה המוגברת של בעלי חיים שעברה ניתוח שני 27. מעניין, חמדי ועמיתיו לעומת הזרקת intramyocardial ישירה לעומת משלוח של תאים בGelfoam לבנות על אזור epicardial 28. הם ציינו כי כיסו את התא לבנות על epicardium הביא פונקציונלי שתל טוב יותר בהשוואה להזרקת תאי intramyocardial ודיווחו כי טכניקה זו היא לשחזור, ידידותי למשתמש, ופחות טראומטי עבור בעלי החיים 28.

תכונה חשובה של ניסויי הזרקת תא היא העתקה של התאים וההישרדות שלהם. אנחנו הראינו כי תאי HEK293 קלים לזהות בשל המורפולוגיה להבחינם בהשוואה לתאי לב. תאים אלה שרדו את ההזרקה (מידע לא מוצג) ונשמרו ברקמה שבוע לאחר ניתוח. כדי לעקוב אחר תאים למחקרים ארוך טווח ולנתח engraftment ברקמות של משלוח, כמו גם ברקמות אחרות, כמה טכניקות נמצאות בשימוש, כוללים תיוג ניאון ודגnalysis בניסויי השתלת מין חוסר התאמת 29. חשוב לציין, in vivo הדמיה תשחק תפקיד חשוב לקראת ניתוח במבחנה במחקרים עתידיים. ואכן, אחד יתרונות של בתחום ההדמיה vivo על פני שיטות היסטולוגית הוא המעקב של התאים במחקרים ארוכי טווח באותה חיות ללא הצורך בהמתת החסד 29. במתודולוגיה זו, ניתן לסמן תאים עם ריאגנטים פליטת אור, חלקיקי ברזל, וגני כתב ספציפיים להיות צילמו עם טומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) ותהודה מגנטית (MRI).

הניתוחים שלנו הראו כי תאי noncontractile כגון תאי HEK293 מקובצים מעדיפים באזור שבו הם הוזרקו מוקפים ברקמת collagenous דקה. למרות מנגנוני pathophysiological מובילים להיווצרות של רקמת fibrotic בעכבר immunodepleted אינם ידועים, רקמת collagenous גלויה סביב התאים המושתלים עשויה להיות דומה לנקודתי הקצה שלשתל תואם רקמות. במקרה זה, לא ניתן להסיר את החומר אקסוגני על ידי התאים דלקתיים והופך במארז בשכבה צפופה של רקמת חיבור fibrotic, המבודדת אותו מהרקמות הסובבות. בדומה לשלבים בשלב הסופי של ריפוי פצעים, רקמה פרטנית זה vascularized ביותר ומבטיחה את הישרדות של החומר המושתל.

מבחינה טכנית בשיטה שתוארה כאן הייתה מוצלחת, אם כי הזרקת מחט intramyocardial מיוצרת אזור קטן של נזק לרקמות שמסביב. למרות שמדידות תפקוד לב לא היו המטרה של סקירה זו, מחקרים עתידיים צריכים לבדוק האם נזק לרקמות קטין יכול להפריע ניתוחי טיפול בתא. יתר על כן, זה יהיה חשוב לנתח האם הפציעה מיוצרת באזור המוזרק נגרמת על ידי מחט, לפי כמות התאים מוזרקת או על ידי שילוב של שניהם.

בתמיכתם של הממצאים שלנו, זה הוכח transplantatio כיn של אוכלוסיות מעורבות של תאים מובחנים גזע עובריים אנושיים (hESC) המכילות 20-25% שריר לב (hESC-CM) לתוך הלב בריא של עכברי מדוכאי חיסון (NOD-SCID) הביא להיווצרות מהירה של שתלים שבו שריר הלב הפך מאורגן והתבגר לאורך זמן ואוכלוסיית noncardiomyocyte אבד 23. מעניין לציין, כי החוקרים מצא כי hESC-CM היו מבודדים במידה רבה משריר לב המארח בשכבה של רקמת fibrotic שמנעה היווצרות של syncytium אלקטרו 22,23. במחקר אחר, קהת ואח'. מצא כי hESC-CM בקצב בהצלחה את החדר בחזירים עם חסם לב מלא. מחקר זה הראה כי התאים המושתלים שרדו, תפקדו, ומשולבים עם תאי מארח, במתן עדות ליכולתם לתפקד כחלופה ביולוגית לקוצב האלקטרוני 30. ניתן ליישב שתי תוצאות צורמות אלה על ידי ההבדל במבנה ותפקוד של הוst ומינים תורמים. ואכן, זה אפשרי, כי היעילות של צימוד של שריר לב מושתל עשויה להיות תלויה בתדירות המכות היחסית של תאי מארחים ותורמים. במחקרו של ואן Laake 23, היווצרות של צמתים פונקציונליים עלולה להיפגע בשל תדירות הפעימות השונות של שריר לב אנושי (60-100 פעימות לדקה) לעומת cardiomyocytes מכרסמים (300-600 פעימות לדקה). זה לא יהיה המקרה באדם לעומת ניסויי השתלה חזיריים, כפי שתואר בניתוח קהת 30.

משך זמן תצפית הוא עוד גורם בלבול. hESC-CM הושתלו הלב המכרסם לאחר אוטם שריר הלב הנגרם שיפור תפקוד לב רק לנקודות לטווח קצר בזמן (4 שבועות). עם זאת, ב12 שבועות, תפקוד לב לא ספג עוד יותר למרות הישרדות שתל 23. החוקרים מצאו כי גודל שתל (כמות מוגברת של תאים) לא היה קשור לsurv לב ארוך טווח המשופרשיפור ival ותפקודי ביום 31, המציין כי לטווח ארוך ניתוח לעומת ניתוח טווח בינוני קצר או צריכה להתבצע במחקרים עתידיים ללא צורך במספרים מוגברים של תאים להזרקה.

במחקר הנוכחי, כמה שאלות נותרו בנוגע לסוג של תאים להשתלה, הבחירה של מין מארח התורם להיבדק והערכה מפורטת של הפוטנציאל בקצב לא הסדיר של התאים. באופן אידיאלי, בתאי גזע מושתלים לתוך שריר הלב להחלפה או לפונקציה קוצב לב צריך פונקציונלי זוג עם myocytes הנותר. במודל עכברים של אוטם שריר הלב, פרננדס ואח'. 32 משמש מתוכנת גירוי חשמלי (PES) כדי להעריך את רגישות הפרעות קצב, מראה inducibility מוגבר של הפרעות קצב לב בלב מוזרקת והיצמדות למנגנון השוואה לקבוצת ביקורת. באותו מחקר, זריקות של תאים עצמיים המופק ממוח עצם לא הביאו לinducibil מוגברity של הפרעות קצב לב בהשוואה לבקרה, ובכך מוביל את החוקרים להסיק שmyoblasts הציגה ספציפי arrhythmogenic סיכון. במחקר, תאים שונים שמקורם במח עצם (BMC) מורכבים ביעילות באשכולות בתוך צלקת האוטם או אזור גבול, אבל לא הראו באופן אלקטרוני עורר Ca ארעיים 33. מעניין, ווי ואח'. הראה כי תאי גזע mesenchymal (MSC) לא רוכשים את מאפייני אלקטרו של שריר לב בוגר בתקופת ההישרדות בלב infarcted. עם זאת, הם יכולים להקל על פגיעות חשמל ולא לקדם הפרעות קצב לב 34.

היעילות והתרחשות הפרעות קצב של טיפול בתאי גזע תלוי בתאים, כמו גם על מסלולי האספקה. ואכן, בלב חולדה לאחר 35 MI, זריקות BMC intramyocardial, למרות שיפור תפקוד לב, גדלו התכווצויות רצופות חדרית מוקדמות וtachycard חדריתIA ל14 הימים הראשונים. כאשר מסלול intracoronary היה בשימוש, התרחשות הפרעת קצב חדרית הופחתה במידה ניכרת. במחקרים קליניים, הפונקציה התומכות בקצב לא הסדירה של תאים מוזרקים קשה להעריך כמו רוב החולים מקבלים סוכני חוסם בטא כפי שצוין למחלת לב איסכמית. טיפול בחוסמי בטא עלולים להסוות השפעה הפרו הפרעות קצב פוטנציאל של התאים המושתלים. מחקרים בבעלי חיים ולכן הם חיוניים כדי להעריך את הבסיסים של גירויים הפרו הפרעות קצב בטיפול בתאי גזע.

לסיכום, הנתונים שלנו מוכיחים את ההיתכנות של תאי הזרקת intramyocardial בעכברים, אלא גם מדגיש את הצורך בניתוח מפורט לגבי תנאי הבטיחות של השתלת תאים. בבני אדם, זה כבר הראה כי הזרקת תאים מזוהה עם תומכי הפרעות קצב 36-38, restenosis 39, מואץ טרשת עורקים 40 ושיבוש הליכים כלילית 41. מחקר בסיסי יהיה חשוב ביישום קליני בעתידlications להבין שתאים צריכים להיות מועברים, במצב של מסירה, מנגנונים של תיקון תפקוד שריר הלב תא בתיווך, והעיצוב של אלוגנאית לעומת פרוטוקול השתלת תאים עצמי שיועיל לכל האוכלוסייה האנושית. בגלל העלויות גבוהות כרוכות בניסויים קליניים גדולים, שחזור של יעילות ויעילות של פרוטוקולי השתלה יש לטפל במודלים פרה כמו אלה שתוארו כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים למגדי יעקוב המכון (MYI) לתמיכה בניתוח מיקרוסקופית ופרויקטים של תיקון לב, טכנאים והמנהל של מתקן בעלי החיים שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי קרן הלב הבריטית (BHF), PG/10/019 מענק פרויקט. MPS נתמך על ידי MYI וBHF. TP הוא BHF-מחקר מצוינות עמית. NR הוא אוסטרליה עמית NH & MRC.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolator Pfi systems Quotation needed
Heating Pad Vet Tech Solutions HE006 For small animals
Medetomidine National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Ketamine hydrochloride National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Atipamezole National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream commercial shops
Buprenorphine NVS Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope Leica Model S6E With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner Hamamatsu RS series
Scanning Electron Microscope Jeol JSM-6610
Blunt scissors FST 14084-09
Minivent Harvard Apparatus 73-0043 Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps FST 11052-10
Retraction system FST 18200-20 Kit for animals up to 200 g
30 G 12 mm; ½ inch BBraun A210 Fine yellow
Microliter syringe ESSLAB 81201 Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700
6-0 Silk suture Ethicon W1614T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menasche, P., et al. Myoblast transplantation for heart failure. Lancet. 357, 279-280 (2001).
  2. Taylor, D. A., et al. Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Nat. Med. 4, 929-933 (1998).
  3. Suzuki, K., et al. Cell transplantation for the treatment of acute myocardial infarction using vascular endothelial growth factor-expressing skeletal myoblasts. Circulation. 104, 207-212 (2001).
  4. Suzuki, K., et al. Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function. Circulation. 110, 225-230 (2004).
  5. Robinson, S. W., et al. Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts. Cell Transplant. 5, 77-91 (1996).
  6. Muller-Ehmsen, J., et al. Survival and development of neonatal rat cardiomyocytes transplanted into adult myocardium. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 107-116 (2002).
  7. Reinecke, H., Zhang, M., Bartosek, T., Murry, C. E. Survival, integration, and differentiation of cardiomyocyte grafts: a study in normal and injured rat hearts. Circulation. 100, 193-202 (1999).
  8. Dimmeler, S., Zeiher, A. M., Schneider, M. D. Unchain my heart: the scientific foundations of cardiac repair. J. Clin. Invest. 115, 572-583 (2005).
  9. Oettgen, P., Boyle, A. J., Schulman, S. P., Hare, J. M. Cardiac Stem Cell Therapy. Need for Optimization of Efficacy and Safety Monitoring. Circulation. 114, 353-358 (2006).
  10. Krause, K., et al. Percutaneous intramyocardial stem cell injection in patients with acute myocardial infarction: first-in-man study. Heart. 95, 1145-1152 (2009).
  11. Rodrigo, S. F., et al. Intramyocardial injection of bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial ischemia patients after previous placebo injection improves myocardial perfusion and anginal symptoms: an intra-patient comparison. Am. Heart J. 164, 771-778 (2012).
  12. Smith, R. R., et al. Regenerative potential of cardiosphere-derived cells expanded from percutaneous endomyocardial biopsy specimens. Circulation. 115, 896-908 (2007).
  13. Sadek, H. A., Martin, C. M., Latif, S. S., Garry, M. G., Garry, D. J. Bone-marrow-derived side population cells for myocardial regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 2, 173-181 (2009).
  14. Messina, E., et al. Isolation and expansion of adult cardiac stem cells from human and murine heart. Circ Res. 95, 911-921 (2004).
  15. Malliaras, K., et al. Safety and efficacy of allogeneic cell therapy in infarcted rats transplanted with mismatched cardiosphere-derived cells. Circulation. 125-1100 (2012).
  16. Beltrami, A. P., et al. Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell. 114, 763-776 (2003).
  17. Bearzi, C., et al. Identification of a coronary vascular progenitor cell in the human heart. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15885-15890 (2009).
  18. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308, 2369-2379 (2012).
  19. Makkar, R. R., et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells for heart regeneration after myocardial infarction (CADUCEUS): a prospective, randomised phase 1 trial. Lancet. 379, 895-904 (2012).
  20. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378, 1847-1857 (2011).
  21. Brunt, K. R., Weisel, R. D., Li, R. K. Stem cells and regenerative medicine - future perspectives. Can. J. Physiol. Pharmacol. 90, 327-335 (2012).
  22. Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nat. Biotechnol. 25, 1015-1024 (2007).
  23. van Laake, L. W., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes survive and mature in the mouse heart and transiently improve function after myocardial infarction. Stem Cell Res. 1, 9-24 (2007).
  24. Leobon, B., et al. Myoblasts transplanted into rat infarcted myocardium are functionally isolated from their host. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7808-7811 (2003).
  25. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122, 2419-2429 (2010).
  26. Reinecke, H., Poppa, V., Murry, C. E. Skeletal muscle stem cells do not transdifferentiate into cardiomyocytes after cardiac grafting. J. Mol. Cell Cardiol. 34, 241-249 (2002).
  27. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, 1307-1314 (2005).
  28. Hamdi, H., et al. Cell delivery: intramyocardial injections or epicardial deposition? A head-to-head comparison. Ann. Thorac. Surg. 87, 1196-1203 (2009).
  29. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marban, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circ. Res. 106, 479-494 (2008).
  30. Kehat, I., et al. Electromechanical integration of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 1282-1289 (2004).
  31. van Laake, L. W., et al. Improvement of mouse cardiac function by hESC-derived cardiomyocytes correlates with vascularity but not graft size. Stem Cell Res. 3, 106-112 (2009).
  32. Fernandes, S., et al. Autologous myoblast transplantation after myocardial infarction increases the inducibility of ventricular arrhythmias. Cardiovasc. Res. 69, 348-358 (2006).
  33. Scherschel, J. A., Soonpaa, M. H., Srour, E. F., Field, L. J., Rubart, M. Adult bone marrow-derived cells do not acquire functional attributes of cardiomyocytes when transplanted into peri-infarct myocardium. Mol. Ther. 16, 1129-1137 (2008).
  34. Wei, F., et al. Mesenchymal stem cells neither fully acquire the electrophysiological properties of mature cardiomyocytes nor promote ventricular arrhythmias in infarcted rats. Basic Res Cardiol. 107, 274 (2012).
  35. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  36. Bartunek, J., et al. Intracoronary injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells promotes cardiac recovery after recent myocardial infarction: feasibility and safety. Circulation. 112, 178-183 (2005).
  37. Britten, M. B., et al. Infarct remodeling after intracoronary progenitor cell treatment in patients with acute myocardial infarction (TOPCARE-AMI): mechanistic insights from serial contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Circulation. 108, 2212-2218 (2003).
  38. Smits, P. C., et al. Catheter-based intramyocardial injection of autologous skeletal myoblasts as a primary treatment of ischemic heart failure: clinical experience with six-month follow-up. J. Am. Coll. Cardiol. 42, 2063-2069 (2003).
  39. Kang, H. J., et al. Effects of intracoronary infusion of peripheral blood stem-cells mobilised with granulocyte-colony stimulating factor on left ventricular systolic function and restenosis after coronary stenting in myocardial infarction: the MAGIC cell randomised clinical trial. Lancet. 363, 751-756 (2004).
  40. Fernandez-Aviles, F., et al. Experimental and clinical regenerative capability of human bone marrow cells after myocardial infarction. Circ. Res. 95, 742-748 (2004).
  41. Vulliet, P. R., Greeley, M., Halloran, S. M., MacDonald, K. A., Kittleson, M. D. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs. Lancet. 363, 783-784 (2004).
משלוח הנייד intramyocardial: תוכן בלבבות Murine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (83), e51064, doi:10.3791/51064 (2014).More

Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (83), e51064, doi:10.3791/51064 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter