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Medicine

심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰

doi: 10.3791/51064 Published: January 24, 2014

Summary

고혈압이나 심근 경색 등의 심혈관 질환의 생쥐 모델에서 심근 내 세포 전달은 널리 재생 연구에서 서로 다른 종류의 세포 치료 가능성을 테스트하는 데 사용됩니다. 그러므로, 상세한 설명이 수술의 명확한 시각화가 작은 설치류의 혈관 세포 치료 분석의 한계와 이점을 정의하는 것을 도울 것이다.

Abstract

이전 연구는 세포 배달 사이토 카인 및 심장 조직 재 시술 및 세포의 생존을 증가 요인의 방출에 의해 심장 기능의 개량을 촉진 것으로 나타났다. 또, 상기 관찰은 심장 줄기 세포, 간엽 줄기 세포와 같은 특정 cardiospheres 줄기 세포, 심근 세포, 평활근 세포 및 내피 세포로 분화하여 주변 심근 내에 통합 할 수있는 능력을 가질 것으로 나타났다.

여기, 우리는 확실하게 immunodepleted 마우스의 왼쪽 심실 벽에 noncontractile 세포를 제공 할 수있는 대상 및 방법을 제시한다. 이 미세 수술 절차의 현저한 단계는 마취 및 진통제 주입, 기관 내 삽관, 가슴을 열고 멸균 30 게이지 바늘과 정밀 마이크로 리터 주사기로 세포의 마음과 배달을 노출 절개를 포함한다.

심장 수확, embeddi 구성된 조직 처리NG, 절편 조직 학적 염색은 심근 내 세포 주입 작은 심 외막 지역의 피해뿐만 아니라, 심실 벽을 생산 것을 보여 주었다. Noncontractile 세포는 면역 생쥐의 심근 벽으로 유지하고, 심장 압력 및 기계적 부하로부터 보호 할 가능성이 섬유 성 조직의 층에 의해 포위되었다.

Introduction

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다양한 세포 배달 프로토콜은 인간의 환자에서이 실험 절차의 효율성, 효과와 안전성을 번역하는 것을 목표로 심혈관 질환의 생쥐와 쥐 모델에서 테스트되었습니다. 쥐의 심장 antegrade 3 역행 4 관동맥 세포 주입으로도 사용할 수있는 반면, 작은 설치류의 마음에, 심근 내 세포 전달은 세포 전달 1,2의 가장 실현 가능한 방법입니다. 두 가지 방법 모두 한계와 장점이 있습니다. 관상 동맥 내 경로를 통해 세포 전달은 글로벌 휴대 보급 3 증진에 직접 근육 주사를 통해 이론적 인 장점을 가지고 있지만, 그것은 또한 관상 동맥 색전증 3,5를 일으킬 위험이 있습니다. 심근 내 배달의 제한은 기계적 손상, 급성 염증, 심근 손상 6,7과 연결되어 있습니다. 인간, 심장 수리를 위해 세포 내막 또는 외과 심 외막을 통해 심근 내 주입에 의해 제공됩니다접근 또는 관상 동맥 내 동맥 경로 (8)에 의해. transvascular 경로로 주입은 급성 심근 경색 및 재관류 심근 환자에 적합하지만, 전체 폐색 또는 영향 지역 (9)의 혈관 내 가난한 흐름의 경우에는 할 수없는 경우가 있습니다. transendocardial 또는 transepicardial 주사 심실 벽에 직접 주사는 환자의 건강 상태에 따라 기술적으로 가능하다. 실제로, transepicardial 주입 열린 가슴 수술이 필요하고, transendocardial 위해 가능한 허혈성 또는 상처 심근 9의 사이트를 차별화하는 데 필요한 각각의 환자에 대한 전기 생리학 맵핑에 접근하지만,이 기술은 10, 11 안전한 것으로 나타났습니다.

중요한 사실은, 세포 치료 연구에 이식 될 수있는 가장 좋은 셀의 선택은 조사 중에있다. 단기 분석 (4 주) 보여 주었다 cardiospheres로 정의 심장 줄기 세포의 주입 13 쪽 인구 세포 흉터의 크기와 세포 사멸을 감소시킴으로써 심근 경색의 쥐 1415 모델에서 심장 기능 회복을 유도. 면역이없는 쥐의 심근 경색 모델에서 cardiospheres의 동종 이식은 심장 재생을 촉진, 안전한 것으로 판명, 내생 수리 메커니즘 (15)의 자극을 통해 심장 기능을 개선했다. 마음에 Lin-/c-kit + 성인 전구 세포는 시험 관내 및 생체 내에서 자기 갱신, 클론 원성 및 다 능성 것으로 표시하고, 허혈성 쥐의 심장에 주입했을 때이 부상 심근 벽 (16)의 많은 부분을 재구성하고 있었다되었다 도전과 중간 크기의 관상 동맥 (17)을 형성 할 수있는 능력. 이 유망한 데이터 상에 연료를 공급 I과 인간의 임상 2 :자가 및 동종 중간 엽 줄기 세포 (MSC) (18)의 주입은, 19 cardiospheres, 또는 C-키트 긍정적 인 심장 줄기 세포 (CSC) 허혈성 인간의 마음에있는 20 각 장기 연구에서 심장 기능에 유익한 효과를 보여 주었다. 그럼에도 불구하고, 넓은 장기 후속 및 향적 메타 분석 줄기 세포 요법이 아니라 예측할 수없는 결과 (21)의 범위 외에서는, 일부 환자에 상당한 이점을 제공한다는 것을 보여 주었다. 이들 제한은 각 각 질환에 대한 세포 전달의 특정 프로토콜의 설계를 필요로 할 가능성이있다.

마우스와 쥐 모델에서 장기 연구는 세포 주입이 더 심장 기능 (12 개월)이 개선되지 않은 것으로 나타났다. 실제로, 인간 배아 줄기 세포 유래 심근 (hESC의-CM)의 이식은 주로 섬유 성 조직 (22, 23)의 층에 의해 숙주 심근로부터 단리 하였다. 비슷한 결과는 경색 마우스 (24)의 마음으로 골격 근육 아세포의 심근 내 이식 후 관찰되었다. Furthermo다시 경색 심장에 기능을 유지하기 위해 동종 중간 엽 줄기 세포의 장기 기능이 분화 25 일 이후 면역 상태로 면역 적격의 전환에 의해 제한되어 있습니다.

고려 위에서 설명한 도전과 전망을 고려, 우리는 쥐의 심근 내 주입하여 세포를 전달하는 방법을 여기에 보여줍니다. 우리는 심근 수축 특성이없는 세포가 숙주 심근 접속하고 얇은 섬유 성 장벽 응집 덩어리를 형성하지 않는 것을 관찰한다. 일부 경우에 이러한 결과는 바람직 할 수도 있지만, 다음의 분석은 세포의 생착뿐만 아니라 기능적으로 연결된 심근 구조를 생성하기 위해 변조 될 수있는 방법을 이해하는 것이 유용 할 수있다.

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Protocol

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모든 동물 실험은 국제 (유럽 의회의 지침 2010/63/EU) 및 국가 (영국 홈 오피스, 법 1986) 규정에 따라 수행되었다. 본 명세서에 기재된 방법은 UK 라이센스 권한 하에서 작업 우리 계획의 일부와 기록의 목적으로 수행되지 않았다.

1. 세포의 준비

이 프로토콜은 설명을 위해 특정 세포주 (인간 배아 신장, HEK293 세포)의 제조를 설명한다. 셀 - 특정 프로토콜은 성장하고 결국 특정 세포 계통에 능성 또는 성체 줄기 세포 분화에 대한 고용해야합니다.

  1. DMEM 매체 1 % 피루브산 나트륨, 2 mM의 글루타민, 1 % 항생제 펜 / Strep의 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 (고 글루코스, 4500 ㎎ / L)에서 세포를 성장한다. 한 10cm 플레이트는 일반적으로 1:3 분할해야하고 미디어 이틀 신선한 보충.
  2. tryps와 약간 세포 치료1:1 설명 된 DMEM 배지에서 1X 및 재현 탁한다.
  3. 혈구 챔버에서 세포를 계산하고 별도의 튜브에 3 × 10 6 세포를 수집합니다.
  4. 5 분 100g에서 스윙 버킷 로터에서 원심 분리기.
  5. 뜨는을 취소하고 멸균 인산 완충 배와 세포 펠렛을 씻으십시오.
  6. immunodepleted 마우스의 좌심실에 주입을위한 10 50분의 6 UL의 농도로 PBS 1X에 재현 탁.

2. 수술 전 상태

  1. 각각의 수술 전, 온도 조절 아이솔레이터의 무균 식품 알약과 물 (표 1 22 ° C)와 immunodepleted 마우스 (NOD.CB17-Prkdscid/JHliHSD)를 유지한다.
  2. 층류 후드 immunodepleted 마우스의 수술을 수행합니다. 70 % 에탄올로 작업 영역을 청소하고 수술 도구 (집게와 가위를) 압력솥.
  3. 수술과 회복을위한 가열 패드의 전원을 켭니다. 전기 히터는 중요하다중에 발생하는 체온의 감소 및 사후 수술을 차단.
  4. 복구 가열 패드에 깨끗하고 멸균 케이지를 놓습니다.
  5. 아이솔레이터에서 멸균 멸균 봉투에 수술 방에 원래 케이지에 마우스를 수송한다.
  6. 마우스를 체중 및 체중에 따라 분사 피하 (SC) medetomidine 및 마우스를 마취 0.9 % 멸균 식염수에 희석 케타민 히드로 클로라이드를 함유하는 용액뿐만 아니라 (근육을 이완시키는 medetomidine 1 ㎎ / kg; 케타민 히드로 클로라이드 (75) ㎎ / kg).
  7. 완전히 마취 할 때 (1 ~ 2 분 이내에 자극 후 더 발가락 핀치 반사)를 케이지에서 마우스를 제거하지
  8. 가슴의 왼쪽에있는 제모 크림과 목의 영역을 적용합니다. 시간 (약 2-5 분)의 적당량 후, 물에 젖은 조직과 느슨한 머리를 닦아.
  9. 앙와위에서 수술 패널에 마우스를 놓습니다. 부터외과 의사의 관점 위치는 수직 꼬리 아래로 헤드 업입니다.
  10. 뒷다리의 피하에 멸균 생리 식염수 (부 프레 노르 핀)에 희석하여 0.1 ~ 0.2 ㎍ / g에서 진통 용액을 주입하고면 팁 어플리케이터를 사용하여 무균 용액 포비돈 요오드 면도 영역을 커버.
  11. 목 지역에 현미경 (2.5 배 목표를) 초점을 맞 춥니 다.

3. 외과 조건

  1. 무딘 가위 약간 윤상 연골 아래 약 0.5 cm 길이의 중간 선 복부 피부 절개를 함께. 침샘을 시각화하는 결합 조직에서 피부를 분리합니다.
  2. 동시에 forcep 자기 가슴 트랙터와 각 부분의 옆으로 당겨 자연 중간 선 부문의 침샘을 분할 및 기관을 노출합니다.
  3. 후두를 노출하는쪽으로 부드럽게 혀를 잡아 당깁니다. 주의기도에 삽관 튜브를 밀어 넣습니다. 튜브의 끝이 표시 L을 통해 볼 수 있습니다arynx 및 기관. 튜브에 있지만 확실하게 보이지 않는 경우에 중요한, 그것은 식도이다. 그것을 제거하고 튜브 끝의 위치를​​ 변경합니다.
  4. 환기 시스템에 튜브를 연결합니다. 200 ㎕의 150 스트로크 / 분에서 스트로크 볼륨을 설정합니다. 테이프로 수술 패널의 환기 튜브를 고정합니다.
  5. 왼쪽 흉부 지역에 1.5 cm 길이의 피부 절개에 - 무딘 가위와 집게로, 1 머리에 수직 꼬리를합니다.
  6. 절개를하지 않고 결합 조직 / 근육 층과 메이저와 마이너 가슴 근육으로부터 피부를 풉니 다.
  7. 다음과 같이 세 번째와 네 번째 늑골 간 개흉술을 수행
    1. 곤란하고 작은 둥근 집게로 긁어서 늑간 근육 층을 관통.
    2. 늑간 근육 층이 관통되면, 최대한 흉강을 열고 가슴 트랙터를 배치합니다. 그 위에있는 귓바퀴 (아트리움)과 좌심실 (LV)의 상단과 중간 부분은지금 눈에 보이는.
  8. 세포와 정밀 주사기를 준비합니다. 주사기 각 주사 10 UL의 볼륨의 양을 제공 할 수 있어야한다. 주사기의 끝 부분에 30 G 바늘을 캐스팅합니다.
  9. 노출에게 바늘의 오픈 팁을 포함하여 단 1 밀리미터를 떠나, 바늘 테이프 (introcan-W 20 G에서) 작은 플라스틱 캐 뉼러를 사용하여 고정하십시오. 이것은 전체 좌심실 벽을 관통하고 좌심실 공동 내로 세포를 주입부터 바늘을 방지 할 것이다.
  10. (각 주사 주입 106 세포의 총 10 UL를 제공 할 것입니다) 5 배 목표의 도움으로,이 배율 좌심실에서 시각화하고 5 개의 다른 위치에서 왼쪽 심실 벽에 세포를 주입. 주입이 성공하면 흰색 영역 및 셀 주요 역세의 부재 (사출에 성공하지 않은 경우, 동물은 기능 분석에서 제외된다) 표시 할 것이다.
  11. 트랙터를 제거합니다. 흉부 B 벽을 닫습니다Y는 6-0 실크 봉합사의 두 바늘에 두 개의 분리 된 갈비를 둘러싸.
  12. 가슴 근육과 PBS 1X에 젖어면 끝이 피부를 보습하고 조심스럽게 집게로 원래의 위치로 근육을 넣어.
  13. 6-0 실크 봉합사의 3 ~ 4 바늘로 피부를 닫습니다. 피부를 닫습니다 2-3 바늘 목 절개를 봉합.
  14. 마취 효과를 되돌릴 atipamezole (1 ㎎ / ㎏ 최종 농도)를 주입한다.
  15. 마우스가 자율적으로 호흡을 시작하자마자, 기관에서 튜브를 꺼내 그 오른쪽에 마우스를 넣어. 마우스를 몇 분 안에 복구 할 것으로 예상된다.
  16. 마우스를 켜고 도보 시간 동안 따뜻한 복구 케이지 (폐쇄 필터링 최고 작은 IVC 케이지)에 배치하기 시작합니다.
  17. 제어 가열 상자 (37 ℃)에서 밤새 동물을 둡니다.
  18. 수술 후 처음 2 일간 복구를 지원하기 위해 물과 펠렛 음식과 요리를 입력합니다.

다음과 같이 세포와 10 제어 주입하지 마음을 주사 열 마음은 조직 학적으로 분석하고 있습니다 :

  1. 일주 주입 (그림 1, 3) 후 이식 세포의 분석을 수행합니다.
    1. 이소 플루 란의 과다 복용에 의한 안락사 후, 조직을 해결하기 위해 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 20 ㎖와 마음을 perfuse. (70~100%) 에탄올의 비율을 증가하고 파라핀 블록에 삽입 고정 된 조직을 탈수.
    2. 제 형태 학적 분석을 위해 헤 마톡 실린 및 에오신 5 μm의 얼룩에서 마이크로톰 파라핀의 마음입니다.
    3. 메이슨의 트리 크롬 염색을 사용하여 결합 조직을 시각화.
    4. 슬라이드 스캐너 현미경 (도 1A, 2A, 3A, 3B 및 3C)에서 이미지를 분석하여 디지털 슬라이드 스캐너 현미경 (Figu을 사용하여 단축 뷰의 전체 심장을 시각화입술 1B 및 1C).
  2. 위의 분석은, 자일 렌의 심장 조직을 deparaffinize 후, 에탄올의 비율을 감소하는 표본을 잠수 (100 %의 물)과 주사 전자 현미경 (SEM)을위한 과정은 다음과 같이하여 재수 :
    1. 1 시간 동안 0.1 M 인산 버퍼에 1 % 탄닌산으로 탈 파라핀 블록을 품어.
    2. (25~100%) 에탄올의 비율을 증가하는 표본을 탈수.
    3. HMDS (헥사 메틸 디 실라 잔)을 건조 샘플.
    4. 애치슨은 다그 및 금 팔라듐 코팅을 가진 스텁에 시편을 장착합니다.
    5. 분석 스캐닝 전자 현미경 (그림 2B)에서보기 샘플.

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Representative Results

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우리는 긴 심근 (그림 1A)에 비해 조약돌 모양 (그림 1) 서로 다른 형태로 심장 세포에서 구별 HEK293 세포를 주입. HEK293 세포 때문에 그들의 증가 핵 콘텐츠 (그림 1A)의 가능성이 심근 (핑크 색상)에 비해 헤 마톡 실린 염색 (파란색)에 더 민감했다. 또한 호스트 조직으로부터 주입 된 세포를 구별하기 위해, HEK293 세포를 주사 전에 DAPI 2시간으로 표시했다. 도 1E에 도시 된 바와 같이 표지 된 세포가 심근 조직에 표시했다. 제어 가짜로 작동하는 마우스는 온 마음 (그림 1C)과 조직 (그림 1D)의 무결성에 손상을 보여 주었다.

심장의 전체 짧은 축보기에서 주입 된 세포는 주입의 영역 (그림 1B)의 균일 한 그룹으로 볼 수 있었다. 그룹화 CELL 학생은 트리 크롬 염색 (그림 2A)에서 파란색 영역으로 등장 섬유 성 조직의 얇은 층으로 둘러싸여 있었다. 주사 전자 현미경 (도 2B), 인해 noncontractile 함수 및 다른 셀룰러 구조 가능성에 의해 도시 된 바와 같이 세포를 숙주 심근 조직과 연결되지 않았다.

상기 관측 또, 바늘 (도 3a)를 주입 데미지의 작은 영역을 주목했다. 이 지역은 심근 벽에 심장의 외부 심 외막 층 (그림 3A)에서 실행합니다. 주입 된 세포 (녹색 화살표, 그림 3B)은 부상 영역 (검은 색 화살표, 그림 3B)의 근처에 존재한다. DAPI 양성 세포는 주사 부위 (그림 3C, 흰색 화살표)를 따라 볼 수 있었다. 일주일 부상 후, 터널 분석은 괴사를 제안, 부상의 사이트에서 증가 된 세포 사멸을 보여주지 않았다오히려 세포 사멸보다 바늘 주입 (그림 3D) 이후에 발생했습니다.

그림 1
그림 1. 주입 된 세포의 조직 학적 분석. 세포 주입 마음은 파라핀과 헤 마톡 실린 및 에오신 염색을 위해 처리 된 A) 일주일 후. 주입 된 HEK293 세포는 좌심실 벽에 존재 하였다. 이미지가) 스테레오 형광 현미경. B 얻어졌다 트리 크롬 염색 조직은 그들이 (화살표)를 주입 하였다 위치 세포가 같은 지역에 분류 된 것으로 나타났다. 오른쪽 하단 패널은 짧은 축이 오른쪽 (RV)과 왼쪽 심실 (LV)과 볼을 보여줍니다. 빨간색 사각형 셀 (1.5 배) 유지하는 영역을 보여줍니다. 이미지 슬라이드 스캐닝 현미경으로 기록되었다. C) 트리 크롬 성에게제어 가짜로 작동하는 마음의 aining. 배 목적. D) 심근 조직의 무결성. E를 보여주는 가짜로 작동하는 마우스의 트리 크롬 염색)와 온 마음보기는 HEK293 세포를 주사 전에 DAPI 시간 내 염색 하였다. 주입 하트 6 μm의에서 OCT에서 임베디드 및 저온 유지에 단면 한 일주일 후. 세포는 형광 현미경의 UV에서 가시화되었다. 왼쪽과 오른쪽 심실이 표시됩니다. 우심실에서 오른쪽 패널은 화이트 라인은 심 외막 층을 표시합니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 주입 된 세포와 숙주 조직과 섬유 성 층의 형성. A) 트리 크롬 염색 쇼HEK293 세포 및 쥐의 심근 조직 (화살표)의 사이에 형성된 콜라겐 조직. 이미지는 디지털 스캐닝 현미경으로 기록되었다. B) 마음이 주사 전자 현미경에 탈 파라핀 및 처리되었습니다. 이미지는 주사 전자 현미경으로 기록되고 주입 된 HEK293 세포 (왼쪽 사이드)와 호스트 심근 (오른쪽) 사이의 콜라겐 섬유 (화살표)를 표시했다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 세포 주입은 손상의 작은 영역을 생성. A) 트리 크롬 염색이 바늘 (파란색 주입 손상의 작은 영역 보여준다.) 화살표를 B) 파라핀 섹션은 트리 크롬 역으로 염색ining 및 세포가 주입 된 영역은 검은 색 화살표로 표시됩니다. 주입 된 세포 (녹색 화살표) DAPI 2시간 주입 전에 염색 HEK293 세포는, 주사 부위 (흰색 화살표)를 따라 존재했다) 부상당한 지역. C에 근접에서 볼 수 있었다. 주사 부위는 녹색 화살표로 표시하고 흰색 오픈 라인은 파라핀 섹션에서 수행, 심낭 층. D) 터널 분석을 표시, 관련 형광 긍정적 인 핵을 보이지 않았다됩니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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이 논문에서, 우리는 쥐의 심장 세포의 심근 내 주입을 수행하는 방법을 보여 주었다. 이 방법의 증거로, 우리는 HEK293 세포를 사용했습니다. 그것은 HEK293 세포가 어떤 세포 치료 연구에 사용하지 않으며, 따라서이 논문의 연구 결과는 치료 접근에 직접 번역에 적합하지 않은 것을 강조하는 것이 중요하다. 그러나, HEK293 세포는 세포 수축되지 않는 다른 종류의 세포에 transdifferentiate하지 않는다는 사실은 전달되는 세포의 특성 및 전달 경로와 같은 기술적 측면에주의를 집중한다.

그것은 관동맥 경로 부상 부위의 균질 분포를 제공 할 수있는 반면, 심근 내 경로, 심장 조직 (24, 26)에 포함 된 셀 클러스터를 야기하는 경향이 있다고보고되었다. 심근 교체, 이상적인 기증자의 세포는 전기 생리학, 구조 및 수축 properti을 전시한다심근의 ES 및 이식 전에 사용되는 세포 분화 프로그램에 대한 필요성을 제안, 숙주 조직에 구조적으로 및 기능적으로 통합 할 수 있어야한다.

다음과 같이 성공적인 수술을위한 핵심 사항은 다음과 같이 요약 될 수있다 :

  1. 심박수를 느리게하고 세포 주입을 용이하게 주사 가능한 화합물로 생쥐를 마취
  2. 폐 기능을 선호하는 마우스의 기관 내 삽관을 수행합니다.
  3. 올바른 호흡에 가슴 근육의 기능을 유지하기 위해 근육의 절개를 피하는 개흉술을 수행합니다.
  4. 마음을 노출 한 후, 주사 (옅은 색으로 표시)가 발생했는지 여부를 시각화하기 위해 현미경으로 좌심실을 관찰합니다.
  5. 심근 조직의 광범위한 천공을 방지하기 위해 얇은 바늘과 정밀 주사기를 사용하여 각각 재료의 원하는 양을 주입.
  6. O 노출 플라스틱 배관 시스템으로 바늘을 넣어 라팁 부분을 NLY. 이것은 심실 공동 내로 주입을 피하고, 좌심실 (0.5 mm)에 특정 깊이로 바늘의 도입을 허용한다.
  7. 외부 압력으로 폐의 노출을 피하기 위해 조심스럽게 갈비뼈 사이의 가슴과 공간을 닫습니다.

이 방법은 수술 후 건강 상태가 우선하는 경우 성공의 높은 수준을 가지고 있습니다. 동물은 집중적으로 고통과 고통의 흔적을 일주일에 매일 최대 모니터링해야합니다. 수술 후 필요에 따라 통증을 제어하는​​ 진통제 화합물의 주입은 관리해야합니다. 예컨대 리도카인과 같은 통증의 국소 적용은 또한 사용될 수있다. 출혈 조심 수술 기법에 의해 방지되어야한다. 발생하는 경우, 그 혈관의 압축이나 결찰에 의해 정지 될 수있다. 우리는 동물이 수술 후 12 ~ 20 시간 동안 37 ° C에서 가열 상자에 남아있는 경우 더 빠르게 복구 할 것을 지적했다. 이 치료는 급격한 체온 저하를 차단 또는 이용 것mally 마취의 수술 및 투여 후 발생. 수술 후 감염이 발생할 수 있지만, 1 % 미만이어야한다. 무균 절차는 엄격하게 감염을 방지하기 위해 따라야합니다. 로컬 감염이 항생제의 애플리케이션으로 처리 될 수있다. 중요한 것은, 탈수 염분의 피하 주사에 의해 제어되어야한다.

그런 이소 플루 란으로, 흡입 마취에 주사를 관리하는 것이 바람직하다. 사실, 우리는 주 사용 마취제는 동물의 불편을 초래하지 않고 쉽게 주입 적은 출혈을 허용, 심장 박동을 감소 것을 관찰했다.

침략 있지만, 마우스의 세포 (25-50 μL)의 작은 볼륨의 주입이 가능하고 안전합니다. 우리는 좌심실 벽 (10 μL / 주사)의 5 가지 영역에서 HEK293 세포의 50 μl를 주입하여 1 % 미만의 사망률을했다. 이 방법론은 중요하다 심근 벽의 여러 영역에서 세포의 존재를 확보허혈성 손상의 확장 된 영역이 전달 세포에 의해 도달 할 필요가있을 때 줄기 세포 치료. 다른 실험실에서의 재현성을 확인할 수 있지만 아직 덜 침습 수술을 수행하려면, 여러 프로토콜은 최근 발표되었다. 예를 들어, 세포 주입은 고해상도 초음파 검사 (27)를 사용하여 주변 - 가슴 기술에 의해 수행 될 수있다. 본 시스템의 사용은 이차원 영상에 깨끗이 좌심실 벽을 시각화하고 정상 수축기 / 확장기 사이클 동안 특정 위치에 바늘을 유지하는 높은 조작 기술을 필요로한다. 이 기술의 장점은 심근 경색의 유도 후 임상 적으로 관련된 시간 프레임에서 원하는 위치에 마우스로 심근 세포의 주입이다. 그러나,이 방법에서는 다음과 같은 이유로 인해 제 2 동작이 겪고 동물의 사망률 증가 심근 경색의 유도 또는 transaortic 줄무늬를 수술 절차에서는 불가능7. 흥미롭게도, 함디와 동료 Gelfoam 심 외막 영역 (28)에 생성 세포의 전달에 비해 직접 심근 내 주입을 비교했다. 그들은 심근 내 세포 주입에 비해 세포 외막에 구축 오버레이 것이 더 나은 이식 기능으로 이어진 관찰이 기술을 재현 할 것으로보고, 사용자 친화적 인, 그리고 동물 28 이하 외상.

세포 주입 실험의 중요한 특징은 세포의 추적 및 생존이다. 우리는 HEK293 세포가 심장 세포에 비해 인해 구별 할 수있는 형태로 감지하기 쉬운 것으로 나타났습니다. 이러한 세포는 주입 (데이터는 도시되지 않음) 생존 및 수술 후 1 주일 조직에서 유지 하였다. 장기 연구를위한 세포를 추적하고 전달의 조직뿐만 아니라 다른 조직에서의 생착을 분석하기 위해 몇 가지 기술은 형광 라벨 및 생선 등의 사용에섹스 불일치 이식 실험 29 (분석). 체외 미래 연구에서 분석으로 중요한 것은, 생체 이미징은 중요한 역할을 담당 할 것입니다. 실제로, 조직 학적 방법에 비해 생체 내 이미징의 장점 중 하나는 안락사 (29)의 필요성없이 동일한 동물 종 연구에서 세포의 추적이다. 이 방법에서, 세포는 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 및 자기 공명 (MRI)로 묘화되는 생물 발광 시약, 철 입자, 그리고 특정 리포터 유전자로 표시 될 수있다.

우리의 분석은 보여 주었다 이러한 우선적으로 그들이 얇은 콜라겐 조직에 둘러싸여 주입 된 영역으로 분류 HEK293 세포와 같은 세포 noncontractile. immunodepleted 마우스의 섬유 성 조직의 형성을 선도하는 병태 생리 학적 메커니즘은 알 수 있지만, 이식 세포의 주위에 보이는 콜라겐 조직의 엔드 포인트와 비교 될 수있다조직 호환 임플란트. 이 경우에, 외인성 물질은 염증 세포에 의해 제거 될 수없고, 주변 조직으로부터 분리 된 섬유 성 결합 조직의 치밀한 층으로 캡슐화된다. 마찬가지로 상처 치유의 말기 단계에,이 과립 조직은 매우 혈관이고 주입 재료의 생존을 보장한다.

심근 내 바늘 주입이 주변 조직에 대한 손상의 작은 영역을 생성하더라도 기술적으로는 여기에 기재된 방법은, 성공적이었다. 심장 기능의 측정이 리뷰의 목적은 아니었다하더라도, 미래의 연구는 작은 조직의 손상은 세포 치료의 분석을 교란 할 수 있는지 여부를 조사해야합니다. 또한, 주입 된 영역에서 생성 부상 주입 세포의 양에 의해 또는 이들의 조합에 의해, 바늘에 의해 발생 여부를 분석하는 것이 중요 할 것이다.

우리의 연구 결과의 지원, 그 transplantatio을 보였다면역 생쥐의 건강한 심장 (NOD-SCID)에 20 % ~ 25 %의 심근 (hESC의-CM)를 포함하는 차별화 된 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 혼합 집단의 n은 심근가 주최하고 성숙 된 한 이식의 급속한 형성의 결과 시간과 noncardiomyocyte 인구에 23을 잃었습니다. 흥미롭게도, 저자의 hESC-CM은 주로 전기 생리 syncytium 22, 23의 형성을 방지 섬유 성 조직의 층에 의해 숙주 심근로부터 분리되었다는 것을 관찰 하였다. 다른 연구에서는 Kehat 등.의 hESC-CM이 성공적으로 완료 심장 블록과 돼지의 심실을 진행하였습니다. 이 연구는 이식 된 세포가 살아 작용 및 숙주 세포와 통합, 전자 맥박 조정기 (30)에 대한 생물학적 대안으로 기능 할 수있는 능력에 대한 증거를 제공하는 것으로 나타났다. 이러한 두 결과가 불일치 호의 구조와 기능의 차이에 의해 조정되어야 할성 및 기증자 종. 실제로, 이식 된 심근 세포의 커플 링 효율은 호스트와 도너 세포의 상대적인 고동 주파수에 의존 할 가능성이있다. 반 Laake의 연구 (23)에, 기능 접합의 형성으로 인해 인간의 심근의 다른 박동 주파수 쥐의 심근 (60 ~ 100 BPM) (300 ~ 600 BPM)에 장애가 될 수있다. Kehat 분석 (30)에 설명 된대로이, 돼지 이식 실험에 비해 인간의 경우는 없을 것입니다.

관측 시간의 길이는 다른 교란 요인이다. 심근 경색은 단기 시점 (4 개월)에 심장 기능의 개량을 유도 한 후 hESC의-CM은 쥐의 심장에 이식. 그러나 12 주에, 심장 기능이 추가 이식 생존율 23에도 불구하고 지속되지 않았다. 저자는 이식편의 크기 (세포의 양을 증가)이 개선 된 장기 심장 SURV과 관련이없는 것을 관찰장기 짧거나 중기 분석 비교 분석 나타내는 ival 및 기능 개선 (31)은 인젝션 세포의 증가 된 수를 필요로하지 않고 향후 연구에서 수행되어야한다.

본 연구에서, 여러 가지 문제가 이식되는 세포의 종류, 테스트 될 호스트 도너 종의 선택 및 셀 부정맥 전위의 상세한 평가와 관련된 남아있다. 이상적으로, 교체 또는 심장 박동 기능의 심근에 이식 된 줄기 세포를해야 남아있는 근육 세포와 기능적으로 몇 가지. 심근 경색의 쥐 모델에서, 페르난데스 등. 32 대조군과 비교 근원 세포 주입 마음 심실 부정맥의 증가 inducibility을 보여주는, 부정맥 감수성을 평가하기 위해 프로그램 된 전기 자극 (PES)을 사용했다. 같은 연구에서 골수 유래자가 세포의 주사는 증가 inducibil 발생하지 않았다심실 부정맥의 ITY함으로써 근원 세포가 특정 부정맥 위험을 전시한다는 결론 저자를 선도, 대조군과 비교. 효율적으로 경색 흉터 또는 경계 지역 내 클러스터에 이식 만 보여 다른 연구, 골수 유래 세포 (BMC)에 전자 카 (33)를 과도 유발하지 않습니다. 흥미롭게도, 웨이 등 알. 중간 엽 줄기 세포 (MSC)가 경색 마음의 생존 기간 동안 성숙한 심근 세포의 전기 생리학 속성을 취득하지 않는 것으로 나타났다. 그러나, 그들은 전기 취약점을 완화 할 수 심실 부정맥의 34을 홍보하지 않습니다.

줄기 세포 치료의 효능 및 부정맥 발생은 세포에서뿐만 아니라 전달 경로에 의존한다. 심장 기능을 개선하지만 사실, 쥐 마음에 MI 35 후, 심근 내 BMC 주사는 연속 심실 조기 수축과 심실 tachycard 증가초기 14 일 동안 아이오와. 관동맥 경로가 사용 된 경우, 심실 부정맥의 발생을 현저하게 감소 하였다. 임상 연구에서 주입 된 세포의 프로 부정맥 기능은 허혈성 심장 질환에 대한 바와 같이 대부분의 환자는 베타 차단제 에이전트를받을 평가하기 어렵다. 베타 차단제로 치료는 이식 세포의 잠재적 인 프로 부정맥 효과를 마스크 할 수 있습니다. 동물 연구는 따라서 줄기 세포 치료에 프로 부정맥 자극의 기지를 평가하는 데있어 매우 중요합니다.

요약하면, 우리의 데이터는 생쥐의 심근 내 세포 주입의 가능성을 보여줍니다뿐만 아니라 세포 이식의 안전 상태에 대한 상세한 분석의 필요성을 강조한다. 인간에서는, 세포 주입이 프로 부정맥 36-38와 연결되어 있는지 표시 39 재 협착, 동맥 경화 (40), 및 관상 동맥 폐쇄 (41)을 가속화하고있다. 기초 연구는 미래 임상 응용에 중요하다세포가 전달해야하는 이해하기 lications, 배달의 형태, 세포 매개 성 심근 기능의 복구 메커니즘, 모든 인구에게 혜택자가 세포 이식 프로토콜에 비해 동종의 디자인. 때문에 대규모 임상 시험과 관련된 높은 비용의 효율성 및 이식 프로토콜의 효능의 재현성은 여기에 설명한 것과 전임상 모델에서 해결되어야한다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Acknowledgments

우리는 현미경 분석과 심장 수리 기술자 및 우리의 동물 시설의 관리자를 포함하는 프로젝트를 지원하기위한 Magdi 야콥 연구소 (MYI를) 감사합니다. 이 작품은 영국 심장 재단 (BHF), 프로젝트 보​​조금 PG/10/019에 의해 지원되었다. MPS는 MYI와 BHF에 의해 지원됩니다. TP는 BHF-우수 연구 위원입니다. NR은 NH & MRC 호주 연구원입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolator Pfi systems Quotation needed
Heating Pad Vet Tech Solutions HE006 For small animals
Medetomidine National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Ketamine hydrochloride National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Atipamezole National Veterinary Service Veterinary prescription is necessary
Hair removal cream commercial shops
Buprenorphine NVS Veterinary prescription is necessary
Leica MZFLIII microscope Leica Model S6E With swing arm stand TS0
Hamamatsu Nanozoomer digital slide scanner Hamamatsu RS series
Scanning Electron Microscope Jeol JSM-6610
Blunt scissors FST 14084-09
Minivent Harvard Apparatus 73-0043 Including small Y adapter (73-0027) and intubation cannula (73-2844)
Forceps FST 11052-10
Retraction system FST 18200-20 Kit for animals up to 200 g
30 G 12 mm; ½ inch BBraun A210 Fine yellow
Microliter syringe ESSLAB 81201 Also include a Hamilton repeating dispenser PB 600-1 Catalog number 83700
6-0 Silk suture Ethicon W1614T

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심근 내 휴대 납품 : 쥐과 마음의 관찰
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Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (83), e51064, doi:10.3791/51064 (2014).More

Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial Cell Delivery: Observations in Murine Hearts. J. Vis. Exp. (83), e51064, doi:10.3791/51064 (2014).

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