Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact
Summary
Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, um Aufnahmen und Manipulation der neuronalen Aktivität in einem intakten Tier zu ermöglichen.
Abstract
Zuvor elektrophysiologische Studien bei erwachsenen Zebrafisch sind begrenzt worden, um die Vorbereitungen oder Augenmuschel Präparate und electrorentinogram Aufnahmen zu schneiden. Dieses Papier beschreibt, wie ein erwachsenen Zebrafisch immobilisiert werden können, intubiert und für in vivo elektrophysiologischen Experimenten verwendet, so dass die Aufnahme der neuronalen Aktivität. Immobilisierung des Erwachsenen erfordert einen Mechanismus, um gelösten Sauerstoff zu den Kiemen statt der Mund-und Kiemendeckel Bewegung zu liefern. Mit unserer Technik werden die Tiere immobilisiert und mit Lebensraum Wasser durchströmt, um diese Anforderung zu erfüllen. Ein Kraniotomie unter Tricainmethansulfonat geführt (MS-222; Tricaine) Anästhesie Zugang zum Gehirn zu liefern. Die Primärelektrode wird dann innerhalb der Kraniotomie Fenster positioniert ist, um extrazelluläre Aktivität des Gehirns erfassen. Durch die Verwendung eines Viel Perfusionssystem kann eine Vielzahl von pharmakologischen Verbindungen, die dem erwachsenen Fisch und jede Änderung in der neuralen Aktivität, verabreicht werdenbeobachtet werden. Die Methodik ermöglicht nicht nur Erklärungen zu den Veränderungen der neurologischen Aktivität gemacht werden, aber es ermöglicht auch Vergleiche zwischen Larven-und erwachsenen Zebrafisch hergestellt werden. Dies gibt Forscher die Möglichkeit, die Veränderungen in der neurologischen Aktivität aufgrund der Einführung der verschiedenen Verbindungen in verschiedenen Lebensstadien zu identifizieren.
Introduction
In diesem Artikel wird ein Protokoll für den Erhalt von In-vivo-Aufnahmen von neuronalen Aktivität bei erwachsenen Zebrafischen beschrieben. Extrazelluläre Aufzeichnungsverfahren verwendet werden, wodurch Spannungsmessungen der elektrischen Aktivität in einem kleinen Bereich des Nervengewebes. Diese Untersuchungsmethode beinhaltet die Überwachung einer großen Anzahl von Zellen in einem Tier 1 verhalten. Bisher haben die Scheibe Aufnahmen bei Erwachsenen und Larven durchgeführt wurde, wie Augenmuschel Präparate und Elektroretinogramm Aufnahmen haben. Diese Versuche sind weitgehend zum Detail durchgeführt wurde physiologischen Reaktionen der verschiedenen Sinnessysteme 5.2. Bis vor kurzem haben intakten Zubereitungen erst seit Durchführung der Elektrophysiologie mit Zebrafisch-Larve 3,6,7, wobei Atmung und die Sauerstoffdiffusion durch die Haut auftreten verfügbar. Unsere Vorbereitung ermöglicht die native neurologische Aktivität eines erwachsenen Zebrafisch zu messen, während das Tier noch bei vollem Bewusstsein und bewusst of seine Umgebung.
Zebrafisch (Danio rerio) spielen derzeit eine grundlegende Rolle als Modell für genetische, toxikologische, pharmakologische und pathophysiologische Studien 3. Zebrafische haben die Sichtbarkeit auf dem Gebiet der Neurowissenschaften gewonnen, weil sie Aktien weitgehende Homologie Säugetieren an den genetischen, neuronalen und endokrinen Ebenen 8. In den vergangenen zehn Jahren haben sich Standard-neuroanatomische und immunhistochemischen Techniken verwendet, um die detaillierten Kenn Organisation des Zebrafisch-Nervensystem 9-12 und der Verteilung der unterschiedlichen Neurotransmitter 3,8,13 bestimmen. In jüngster Zeit haben Forscher ihren Fokus auf Funktionsstudien 14,15, von denen viele zentrieren Verhaltensprozesse 16-19 und elektrophysiologische Eigenschaften von sensorischen Systemen 2,13,20 verschoben. Eine kleine Anzahl dieser Studien haben sich auf die elektrische Aktivität des speziellen Bereichen des adul engtt Zebrafischgehirn 21-23, wurden aber nicht mit einem in-vivo-Ansatz durchgeführt.
Dieses Protokoll kann für elektrophysiologische Studien sowohl spontane und evozierte Aktivität innerhalb des Zebrafisch-Nervensystem, um die Muster der Aktivität in bestimmten Hirnregionen beschreiben angepasst werden. Die Anwendung dieser Technik ermöglicht Vergleiche zwischen der neurologischen Aktivität junge Larvenstadien und Erwachsenen erfolgen. Außerdem ermöglicht unser Protokoll Vergleiche zwischen genetischen oder pharmakologische Veränderungen. Zusammen mit anderen Ansätzen, wie der Gentechnik oder pharmakologischen Tests bietet dieses Verfahren eine neue Möglichkeit für die funktionelle Analyse von neuronalen Kommunikation und Plastizität im intakten adulten Tier als auch für potentielle Anwendungen, wie z. B. das Studium späten Beginn Epilepsie oder neurodegenerativen Prozessen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll wurde verwendet, um die neuronale Aktivität von erwachsenen Zebrafisch in vivo zu messen. Mit etwas Übung können neuronale Aktivität konsequent eingehalten werden, obwohl die Eigenschaften (Amplitude und Form der Ereignisse) der aufgezeichneten Aktivität kann zwischen einzelnen Fische variieren. Nutzung der extrazellulären Aufnahmetechnik kann diese Beobachtung erklären. Das Verfahren ermöglicht die gleichzeitige Überwachung einer Vielzahl von Zellen in einem Bereich 1, so d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH / NINDS Zuschuss R01NS070159 (TMD, JDL und ATS) unterstützt.
Materials
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
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