Summary

Registrazione elettrofisiologica nel cervello di intatto Zebrafish adulti

Published: November 19, 2013
doi:

Summary

Questo documento descrive come un zebrafish adulto può essere immobilizzata, intubato, e utilizzati per esperimenti di elettrofisiologia in vivo per permettere registrazioni e manipolazione di attività neurale in un animale intatto.

Abstract

In precedenza, studi elettrofisiologici in zebrafish adulto si sono limitati a tagliare i preparativi o alle preparazioni oculare e registrazioni electrorentinogram. Questo documento descrive come un zebrafish adulto può essere immobilizzata, intubato, e utilizzati per esperimenti di elettrofisiologia in vivo, che permette la registrazione di attività neurale. Immobilizzazione dell'adulto richiede un meccanismo per fornire ossigeno disciolto alle branchie al posto di movimento buccale e opercolare. Con la nostra tecnica, gli animali vengono immobilizzati e perfusi con acqua habitat per soddisfare questo requisito. Una craniotomia viene eseguita sotto tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anestesia per fornire l'accesso al cervello. L'elettrodo primario viene quindi posizionato all'interno della finestra craniotomia per registrare l'attività cerebrale extracellulare. Attraverso l'uso di un sistema di perfusione multitube, una varietà di composti farmacologici può essere somministrato ai pesci adulti e eventuali alterazioni nell'attività neuralepuò essere osservato. La metodologia permette non solo per le osservazioni devono essere fatte per quanto riguarda i cambiamenti di attività neurologica, ma permette anche di effettuare confronti tra larvale e zebrafish adulto. Questo dà ricercatori la capacità di identificare le alterazioni dell'attività neurologica dovuta all'introduzione di vari composti a differenti stadi di vita.

Introduction

In questo articolo, un protocollo è descritto per ottenere le registrazioni in vivo di attività neurale in zebrafish adulto. Metodi di registrazione extracellulari sono utilizzati, fornendo misure di tensione di attività elettrica all'interno di una piccola regione del tessuto neurale. Questo metodo di indagine comporta monitorare un gran numero di cellule in un animale comportarsi 1. In precedenza, le registrazioni fetta sono stati effettuati sia negli adulti e larve, come hanno fatto i preparativi oculare e registrazioni elettroretinogramma. Questi esperimenti sono stati eseguiti in gran parte al dettaglio risposte fisiologiche dei vari sistemi sensoriali 2-5. Fino a poco tempo, preparazioni cerebrali intatti sono stati disponibili per eseguire elettrofisiologia con zebrafish 3,6,7 larva, dove la respirazione e ossigeno diffusione può avvenire attraverso la pelle solo. La nostra preparazione consente l'attività neurologica nativo di zebrafish adulto da misurare, mentre l'animale rimane pienamente cosciente e consapevole of dintorni.

Zebrafish (Danio rerio) attualmente gioca un ruolo fondamentale come modello per studi genetici, tossicologici, farmacologici e fisiopatologici 3. Zebrafish hanno guadagnato visibilità all'interno del campo delle neuroscienze perché condividono ampia omologia con i mammiferi a livello genetico, nervosi ed endocrini livelli 8. Negli ultimi dieci anni, sono state utilizzate tecniche di neuroanatomici e immunoistochimica standard per determinare l'organizzazione caratteristici dettagliata del sistema nervoso zebrafish 9-12 e della distribuzione di diversi neurotrasmettitori 3,8,13. Più di recente, i ricercatori hanno spostato la loro attenzione per studi funzionali 14,15, molti dei quali si incentrano sui processi comportamentali 16-19 e le caratteristiche elettrofisiologiche dei sistemi sensoriali 2,13,20. Un piccolo numero di questi studi si sono concentrati sull'attività elettrica di specifiche aree del adult cervello zebrafish 21-23, ma non sono stati eseguiti utilizzando un approccio in vivo.

Questo protocollo può essere adattato per studi elettrofisiologici sia attività spontanea ed evocata all'interno del sistema nervoso zebrafish per descrivere i modelli di attività in specifiche regioni cerebrali. L'uso di questa tecnica permette di effettuare confronti tra l'attività neurologica dei giovani stadi larvali e adulti. Inoltre, il nostro protocollo consente confronti tra alterazioni genetiche o farmacologici. Insieme ad altri approcci, come l'ingegneria genetica o prove farmacologiche, questo metodo offre una nuova possibilità per l'analisi funzionale di comunicazione neuronale e la plasticità nel intatta animali adulti, nonché per potenziali applicazioni, come studiare epilessia insorgenza tardiva o processi neurodegenerativi.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in stretta conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio e seguiti protocollo # A2011 09-003, che è stato esaminato, approvato e supervisionato dalla University of Georgia Institutional Animal Care ed uso Comitato. 1. Setup Equipaggiamento Sistema di perfusione per la craniotomia Immobilizzazione dell'adulto richiede un sistema intubazione per…

Representative Results

Questo protocollo è stato utilizzato per misurare l'attività neurale di zebrafish adulti in vivo. Queste registrazioni elettrofisiologiche sono costantemente e riproducibile ottenuti. Figura 5 mostra un esempio rappresentativo di alterazioni nativi e indotti dell'attività neurale di zebrafish adulto quando pentylenetetrazol (PTZ), una chemoconvulsant comune 6,7,25,26, è stato introdotto in intubazione setup. L'attività neurologica nativo …

Discussion

Questo protocollo è stato utilizzato per misurare l'attività neurale di zebrafish adulti in vivo. Con la pratica, l'attività neurale può essere osservato in modo coerente, anche se le caratteristiche (ampiezza e forma degli eventi) dell'attività registrata possono variare tra individui. L'utilizzo della tecnica di registrazione extracellulare può spiegare questa osservazione. Il metodo fornisce il monitoraggio simultaneo di un numero elevato di celle all'interno di una regione 1,<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NINDS di Grant R01NS070159 (a TMD, JDL e ATS).

Materials

70% Ethanol Decon Laboratories 2750HC Dilute 100% to 70% with DI water
2 M Potassium Chloride J.T. Baker
2 M Sodium Chloride J.T. Baker 3624-05
0.4% Tris-Buffered Tricaine Sigma-Aldrich E10521 pH 7.2-7.4; stored at -20 oC
Pancuronium Bromide Sigma-Aldrich P1918 Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline
Habitat water pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate
Pentylenetetrazol Sigma-Aldrich P6500 Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline
Nanofil syringe World Precision Instruments, Inc. 06A
34 G Beveled needle World Precision Instruments, Inc. NF34BV
Sponge Small pore and chemical-free
Foam-backed fine sand paper 5 x 5 cm2 is large enough
9 V Battery
Wires with alligator clips Need 2
37 cm x 42 cm Kimwipe Kimberly-Clark Professional TW31KEM
11 cm x 21 cm Kimwipe Kimberly-Clark Professional TW31KWP
1/8 in diameter tube
1 cm diameter tube
1 mm diameter tube
Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule Qosina 51505
Microscope (Leica MZ APO) Another microscope can be used
Vanna scissors Roboz Surgical Instruments Co., Inc. 15018-10
60 ml Luer lock syringe tubes Becton, Dickinson and Company 309653
3-way Stopcocks with Luer connections
1-way Stopcock with Luer connection
Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish Fisher Scientific NC9299146
Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish Fisher Scientific S67961
4 in Borosilicate capillary tube World Precision Instruments TW100F-4 Can contain a filament to aid in filling with solution
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller Sutter Instrument Co.
Digidata 1440 Molecular Devices
Axon Aloclamp 900A Molecular Devices
Axoclamp software Molecular Devices
HS-9Ax 1U headstage Molecular Devices
0.010 in Silver wire A-M Systems, Inc.
Q-series electrode holder Warner Instruments QSW-A10P
10 ml Luer lock syringe
1 mm x 15 in Tubing Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder
Micromanipulator Warner Instruments Need 2
Microsoft-based PC Dell
Faraday Cage
Air Table
Dissecting Microscope

References

  1. Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
  2. Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
  3. Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
  4. Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
  5. Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
  6. Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
  7. Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
  8. Maximino, C. . Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , (2012).
  9. Bally-Cuif, L., Vernier, P., Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. . Fish Physiology: Zebrafish. 29, (2010).
  10. Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
  11. McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
  12. Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
  13. Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
  14. Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
  15. Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
  16. Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).
  17. Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
  18. Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
  19. Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
  20. Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
  21. Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
  22. Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
  23. Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
  24. Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
  25. Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
  26. Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
  27. DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
  28. Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).

Play Video

Cite This Article
Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065, doi:10.3791/51065 (2013).

View Video