Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Undersøge effekterne af probiotika på Pneumokok Colonization Brug af en Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

In vitro kan anvendes adhærens assays for at undersøge binding af Streptococcus pneumoniae til epitel cellemonolag og undersøge potentielle indgreb såsom anvendelse af probiotika til inhibering af pneumokok-kolonisering.

Abstract

Vedhæftning af Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) til epitelforingen af nasopharynx kan resultere i kolonisering og betragtes som en forudsætning for pneumokokinfektioner såsom lungebetændelse og otitis media. In vitro adhærens assays kan anvendes til at undersøge bindingen af pneumokokker til epitelcelle monolag og undersøge potentielle interventioner, såsom anvendelse af probiotika, at inhibere pneumokok kolonisering. Protokollen beskrevet her anvendes til at undersøge virkningerne af den probiotiske Streptococcus salivarius på vedhæftningen af pneumokokker til den humane epiteliale cellelinje CCL-23 (undertiden benævnt HEp-2-celler). Analysen omfatter tre trin: 1) Fremstilling af epitel og bakterielle celler, 2) tilsætning af bakterier til epitelceller monolag, og 3) påvisning af klæbende pneumokokker ved kimtal (seriel fortynding og pletteringsudstyr) eller kvantitativ real-time PCR (qPCR ). Denne technique er forholdsvis enkel og ikke kræver specialiseret udstyr, bortset fra en vævskultur setup. Analysen kan anvendes til at teste andre probiotiske arter og / eller potentielle hæmmere af pneumokok kolonisering og kan let ændres til at løse andre videnskabelige spørgsmål vedrørende pneumokok vedhæftning og invasion.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) er en grampositiv bakterie, der kan forårsage infektioner, herunder lungebetændelse, otitis media, og meningitis. Det er en væsentlig årsag til sygdom hos børn i lavindkomstlande og ansvarlig for anslået 800.000 dødsfald blandt børn under fem år hvert år 1. Pneumokokker foregår ofte i nasopharynx af unge børn. Selv om denne kolonisering generelt betragtes asymptomatisk det forud pneumokokinfektion og tjener som et reservoir for bakterier i humane populationer 2. Pneumokok konjugat vaccination effektivt reducerer transporten af ​​serotyper indeholdt i vaccinen. Men der er over 90 pneumokok serotyper, og vaccination kan føre til serotype udskiftning, hvorved fjernelsen af vaccine serotyper er efterfulgt af en stigning i vogn og sygdom forårsaget af nonvaccine serotyper 3. Også i nogle høj-risiko populationer, pneumokokkolonisering ofte forekommer meget tidligt i livet, før indgivelse af den første vaccinedosis 4,5. For nylig er der foreslået anvendelsen af probiotika som en yderligere strategi til at inhibere pneumokok kolonisering 6,7. In vitro adhærens assays er blevet anvendt til at undersøge pneumokok vedhæftning 8,9. Disse analyser er blevet tilpasset for at undersøge effekten af den probiotiske Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) på pneumokok vedhæftning 10..

Ud over LGG og andre mælkesyrebakterier, Streptococcus salivarius, en fælles hjemmehørende i mundhulen, er blevet undersøgt som en potentiel probiotisk til luftvejene på grund af sin kolonisering potentiale og evne til at inhibere pneumokokker og andre respiratoriske patogener in vitro 11 - 13.. Protokollen præsenteres her beskriver en adhærenceprøve anvendes til at undersøge virkningerne af S. salivarius K12 om pneumokok vedhæftningtil det humane epiteliale cellelinje CCL-23. Inden brug i analysen, blev pneumokokisolater evalueret for compliance kapaciteter, som vækst og overholdelse egenskaber kan variere betydeligt blandt isolater 10,14. Vækstkurver pneumokokker og S. salivarius blev udført for at bestemme mid-log-fase og koncentration estimatet (kolonidannende enheder eller CFU / ml) ved optisk tæthed (OD, figur 1). Det anbefales at undersøge vækst ved kimtal og OD for hvert isolat inden anvendelse i assayet. Dette assay kan udføres i alle laboratorier med standard vævskultur faciliteter og udstyr. I denne protokol, effekten af tre doser af S. salivarius administreret 1 time før tilsætningen af pneumokokker på vedhæftningen af S. pneumoniae PMP843 en serotype 19F transport isolat afledt fra en nasopharyngeal podepind, er undersøgt. To forskellige måder at kvantificere klæbende pneumokokker præsenteres: plating på blodagar at afskrækkemine levedygtighedstællinger, og DNA-ekstraktion og afsløring af pneumokok LytA genet ved qPCR 15. Den grundlæggende adhærenceprøve protokol kan let modificeres til at teste forskellige doser eller tidspunktet for indgivelse af probiotika og kan også anvendes sammen med andre bakterielle stammer eller arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Udarbejdelse af Epithelial og bakterieceller

  1. Optøning af CCL-23 epitelceller
    1. Forvarm Minimum Essential Media (MEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) i et 37 ° C vandbad i ~ 30 minutter.
    2. Steriliser vævskultur godkendt biosikkerhed kabinet med UV-lys i mindst 10 minutter før brug, og tør ned arbejdsområde med 70% ethanol. Tør varmede medier flaske med 70% ethanol og plads i biosikkerhed kabinet.
    3. Anvendelse af en 25 ml pipette 14 ml medium i en T-75-kolbe. Placer kolben i 37 ° C inkubator mens celler optøning (afsnit 1.1.4).
    4. Fjern et hætteglas af CCL-23 celler fra flydende nitrogen opbevaring ved hjælp af passende sikkerhedsforanstaltninger og varm i et 37 ° C vandbad, indtil ~ 80% optøet.
    5. Kolben udarbejdet i punkt 1.1.3 til biosikkerhed kabinet returnere. Tør ydre overflade af hætteglas af CCL-23 celler med 70% ethanol og overføre indholdet (1 ml) i T-75 Kolbe ved hjælp af en P1000 pipette.
    6. Inkuberes kolben på sin side i et 37 ° C, 5% CO2, 95% relativ fugtighed vævskultur inkubator natten over (16-20 timer).
    7. Kontroller cellerne under et mikroskop for at bekræfte en sund morfologi, fjerne medier, og erstat med 15 ml frisk, forvarmet MEM + 10% FBS.
  2. Vedligeholdelse af CCL-23 epitelceller
    1. Når cellerne er ~ 80% sammenflydende (1-2 dage), passage ved fjernelse af medier ved anvendelse af en 25 ml pipette og forsigtigt vaske cellerne to gange med 8-10 ml forvarmet phosphatpufret saltopløsning (PBS) under anvendelse af en 10 ml pipette.
    2. Fjern PBS og tilsættes 1 ml sterilt 0,25% trypsin-EDTA (0,25% (w / v) trypsin, 0,1 mM EDTA). Drej kolbe på sin side, rotere for at sikre trypsin dækker sammenflydende lag af celler og inkuberes kolben i 2-3 minutter i 37 ° C, 5% CO 2-inkubator.
    3. Retur kolbe til biosikkerhed kabinet, tilsættes 9 ml forvarmet MEM + 10% FBS, og pipette op og ned 6 -8x at resuspendere cellerne skubbe væske ned langs siden af ​​kolben for at fjerne celler.
    4. Split-celler 1:15 (1 ml + 14 ml MEM + 10% FBS) eller 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml MEM + 10% FBS), kasseres overskydende celler og returnere kolben til 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
    5. Passage celler mindst to gange før anvendelse i adhærenceprøven. Typisk celler er delt hver 3-4 dage.
  3. Såning af CCL-23 epitelceller (en dag før adhærenceprøven, protokol 2)
    1. Split konfluente celler som beskrevet i afsnit 1.2.1-1.2.3, resuspendering i forvarmet MEM + 5% FBS (FBS koncentrationen sænkes for at mindske sandsynligheden for serumkomponenter interfererende i assayet). Fjern 20 pi celler og tælle ved hjælp af trypan blue-farvning og et hæmocytometer.
    2. Fortynd celler i forvarmet MEM + 5% FBS til en koncentration på 1,5 x 10 5 celler / ml i et sterilt 50 ml rør.
    3. Seed 1 ml celler / brønd i et væv-Kultur behandlet 24-brønds plade.
  4. Fremstilling af bakterier
    Denne procedure kan følges til fremstilling af pneumokokker og S. salivarius. Bakterievækstmedier typisk opbevares i en 37 ° C inkubator natten over til forvarm og testen for sterilitet (generelt vises uklar hvis kontamineret).
    1. To dage før adhærenceprøve afsætter bakterier på hesteblod agar (HBA) plader og inkuberes ved 35-37 ° C og 5% CO2 i 18-24 timer. Får blodagar kan anvendes som et alternativ.
    2. Den følgende dag, forberede en overnatskultur for hver bakteriearter ved at pipettere 10 ml Todd-Hewitt bouillon med 0,5% gærekstrakt (THB + YE)-medium i en steril 30 ml rør. Ved hjælp af en 10 ul loop, pode ca 10-12 godt adskilte kolonier. Kort vortex og inkuberes ved 35-37 ° C og 5% CO2 i 14-16 timer. Bemærk, at pneumokokker vil autolyze hvis venstre for længe i bouillon kultur.

    2. Adhæsion assay:. Tilsætning af bakterier til epitelcelle Encellelag

    1. Udarbejdelse af mid-log bakteriekulturer af pneumokokker og S. salivarius
      1. Afpipetteres 10 ml forvarmet THB + YE i hver af to sterile 30 ml rør, en mærket pneumokokker, og den anden S. salivarius.
      2. For at nå midt-log-fase, pneumokokker kræver ~ 3 timer og S. salivarius kræver ~ 2 timers inkubation (se figur 1). Start begge kulturer samtidigt. Vortex (3-5 sek) natten bakteriekulturer og tilsæt 100 ul pneumokokker og 100 ul S. salivarius i tilsvarende rør.
      3. Kort vortex og inkuberes kulturerne ved 37 ° C i cirka 2 timer for S. salivarius og 3 timer for pneumokokker.
    2. Fremstilling af CCL-23 celler til adhærenceprøve
      1. Anvendelse af et omvendt mikroskop, kontrollere 24-brønds plade til confluent monolag med sund celle morfologi. Monolag skal være> 80% sammenflydende, uden tegn på celle sammenklumpning eller cytopatiske virkninger såsom celle afrunding eller tab af vedhæftning (se figur 2).
      2. Fjern mediet i hver brønd med en overførsel pipette vippe pladen lidt for at undgå at forstyrre cellemonolaget.
      3. At forsigtigt vaske cellerne, tilføje ~ 500 pi forvarmet PBS i hver brønd med en serologisk pipette og fjerne det med en overførsel pipette vippe pladen en smule. Kassér PBS. Gentag vasketrin gang.
      4. Tilsæt 500 pi forvarmet MEM + 5% FBS i hver brønd. 24-brønds plade Retur til CO 2 inkubator ved udarbejdelsen af de bakteriekulturer.
        Bemærk: For at bestemme den nøjagtige CCL-23 celle nummer for multiplicitet af infektion (MOI), kan to brønde blive trypsineret og tælles på dagen for infektion.

    3.. Adhærenceprøve

    1. Tilføj pneumokokker tilde CCL-23 celler i en MOI ~ 10:1. Test betingelserne anført i tabel 1 i duplikatbrønde.
      1. Mål den optiske densitet ved A 600 (OD) af 1 ml S. salivarius kultur. OD skal være mellem 0,3-0,6.
      2. Overfør 5 ml af S. salivarius kultur i en 10 ml rør og centrifugeres ved 1.870 xg i 4 min.
      3. Supernatanten fjernes, og baseret på OD-aflæsning i afsnit 3.1.1, resuspenderes S. salivarius i 200-1000 pi 0,85% NaCl (slutkoncentration ~ 1,5 x 10 9 CFU / ml). Som en generel retningslinje vil en OD på 0,375 resuspenderes i 260 ul. Forbered 1:10 og 1:100 fortyndinger af S. salivarius hjælp 0,85% NaCl.
        Bemærk: I alt tre koncentrationer (der repræsenterer høj, middel og lave doser) af S. salivarius vil blive testet i analysen. Den høje dosis er et forhold på ~ 10 S. salivarius: 1 pneumokokker, mediet er ~ 1 S. salivarius: 1 pneumokokker, og den lave er ~ 1 S. salivarius: 10 pneumokokker.
      4. Tag 24-brønds plade fra inkubatoren.
      5. Fra heparin kontrolbrønde, fjernes 40 pi medier og tilsættes 50 pi heparin (1,000 U / ml stamopløsning koncentration) til en endelig koncentration på 100 U / ml.
      6. Tilsæt 10 ul 0,85% NaCl til brønde, der indeholder CCL-23-celler kun og brønde, der indeholder CCL-23 celler og pneumokokker (ingen S. salivarius).
      7. Der tilsættes 10 ul af ufortyndet, 1:10 og 1:100 S. salivarius til respektive brønde.
        Bemærk: S. salivarius kan også tilføjes på samme tid som pneumokokker (coaddition) eller 1 time efter pneumokokker (post-tillæg) for at undersøge effekten af tidspunktet for probiotiske administration.
      8. Centrifuger plade med 24 brønde ved 114 g i 3 min for at fremme bakteriel kontakt med cellelaget og inkuberes i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2.
      9. Udføre seriel fortynding af S. salivarius lager i 0,85% NaCl og plade på eksemplarer HBAplader til kimtal. Først tilsættes 50 ul lager til 450 pi 0,85% NaCl til at lave en 10 -1 fortynding, så puls vortex (5 sek), ændre tips, og der tilsættes 50 ul af 10 -1 fortynding til 450 pi 0,85% NaCl at gøre en 10 -2 fortynding og så videre op til 10 -7.
      10. Plade 100 ul af 10 -5, 10 -6, og 10 -7 fortyndinger i to eksemplarer på HBA plader og spredes med en steril spreder. Inkubér HBA-plader omvendte natten over ved 37 ° C, 5% CO2.
      11. Mod slutningen af ​​1 times inkubation, gentag sektioner 3.1.1-3.1.3 for pneumokokker. OD'erne skal være mellem 0,2-0,7. Spin down 1 ml pneumokok kultur og pellet resuspenderes i 300-2,000 pi 0,85% NaCl (baseret på OD-aflæsning) til en koncentration på ~ 1,5 x 10 8 CFU / ml. Som en generel retningslinje, vil en OD på 0,3 resuspenderes i 500 pi.
      12. Efter 1 times inkubation med S. salivarius tilsættes 10 μ; (Kun indeholder celler) l ufortyndet pneumokokker til alle brønde undtagen negative kontrolbrønde.
      13. Centrifuger 24-brønds plade ved 114 x g i 3 minutter og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 timer. Udfør seriel fortynding af pneumokokker lager i 0,85% NaCl som beskrevet i afsnit 3.1.9 og plade fortyndinger 10 -4, 10 -5 og 10 -6 om dublerede HBA plader for kimtal.
    2. Efter 3 timer, kontrollere cellerne under et mikroskop for at sikre, at monolag ser sunde (se figur 2). Fjern mediet fra hver brønd og forsigtigt vaske cellerne 3x som beskrevet i afsnit 2.2.3. ved hjælp af en anden pipette til hver tilstand. Dette trin er vigtigt at fjerne non-adhærente pneumokokker. Monolagene bør ikke komme fra hinanden under vaskeprocessen dette kan bekræftes ved at kontrollere igen under et mikroskop.

    Bemærk: Medier fjernes under dette trin kan opbevares ved -20 ° C i yderligere analyser (<em> fx måling af cytokinniveauer).

    1. Tilsæt 200 pi 0,1% digitonin (en blid detergent) til hver brønd og inkuberes i 7 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
    2. Tilføj 800 pi THB medier til hver brønd. Lyse celler ved pipettering op og ned, og om nødvendigt, skrab brønde 3-4x med pipettespidsen for at sikre cellemonolaget helt fjernet. Skift tip mellem brønde.
    3. Fjern indholdet fra hver brønd med en P1000 pipette og overføres til mærkede mikrocentrifugerør.

    4.. Kvantificering af Adherent Pneumokokker

    Adherent pneumokokker kan kvantificeres ved bestemmelse af kimtal (seriel fortynding og udpladning på blodagar) eller ved kvantitativ real-time PCR.

    1. Levedygtige tællemetode
      Denne metode skal udføres umiddelbart efter trin 3.5 af adhærenceprøven.
      1. For hvert assay godt, forberede seriefortyndinger af prøver indsamlet itrin 3.5 i adhærenceprøven ved tilsætning af 50 pi prøver til 450 pi af 0,85% NaCl, puls hvirvelbehandling og seriefortynding som beskrevet i afsnit 3.1.9 op til 10 -6 fortynding.
      2. Plate 100 pi af 10 -3, 10 -4, 10 -5 og 10 -6 fortyndinger i to eksemplarer på blodagar, fordelt med en steril spreder, og inkuberes inverterede plader natten over ved 37 ° C, 5% CO2. Bemærk at brøndene indeholdende CCL-23 celler alene ikke indeholder nogen bakterier og kan være belagt pæn (100 pi ufortyndet) som en sterilitet kontrol.
      3. Den følgende dag, fastlægge pneumokok inokula ved at tælle kolonier på passende fortynding plader (indeholdende 30-300 kolonier) fremstillet i afsnit 3.1.13 i adhærenceprøven. Beregn CFU / ml af inokula hjælp af gennemsnittet fra to plader. Tilsvarende bestemme S. salivarius inokula ved at tælle kolonier på pladerne fremstilleti afsnit 3.1.10.
        Bemærk: Plader bør kun indeholde pneumokokker; tilstedeværelsen af ​​andre arter viser, at assayet blev forurenet, og resultaterne er ugyldige.
      4. For at bestemme de pneumokok compliance niveauer, tælle den passende fortynding plade (indeholdende 30-300 pneumokok kolonier) for hver prøve fremstillet i afsnit 4.1.1. Bemærk, at S. salivarius kolonier vil være lille og hvid, mens pneumokokker vil være flad og grønlig grund α-hæmolyse, som vist i fig. 3. Til beregning af pneumokok-tilslutning, normalisere antallet af adhærerende pneumokokker fra betingelse b. CCL-23 celler + pneumokokker til 100%, og sammenligne klæbende pneumokokker fra andre forhold til denne betingelse.
    2. qPCR metode
      Prøver indsamlet i adhærenceprøven trin 3.5 kan opbevares ved -20 ° C indtil DNA-ekstraktion. DNA-ekstraktion udføres ved hjælp af et kommercielt kit og beskrevet i afsnit 4.2.1-4.2.9 og qPCR somsige i afsnit 4.2.10-4.2.20.
      1. Forbered Enzymatisk Lysis Buffer (50 mM phosphatbuffer pH 6,7 indeholdende 1 mg / ml lysozym, 0,075 mg / ml mutanolysin og 2 mg / ml proteinase K). Den følgende opskrift kan bruges lave 10 ml (nok til 50 ekstraktioner). Enzymatisk lysisbuffer bør være frisklavet før brug.

        7,25 ml 50 mM fosfatbuffer (pH 6,7)
        1,00 ml af 10 mg / ml lysozym lager endelig [1 mg / ml]
        0,75 ml af 1 mg / ml mutanolysin lager endelig [0,075 mg / ml]
        1,00 ml af 20 mg / ml Proteinase K lager til en endelig [2 mg / ml]
      2. Optø prøverne på is eller ved 4 ° C. Vortex og overførsel 100 ul portioner af hver prøve i mærkede mikrocentrifugerør. Retur oprindelige prøver tilbage i -20 ° C fryseren.
      3. Centrifuger prøverne ved 6.700 xg i 10 min.
      4. Fjern og kassér supernatanten. Tilsæt 200 ul enzymatisk lysis buffer til pillen og vortex for at resuspendere. Incubspiste prøverne ved 56 ° C i 30 minutter. Centrifugeres kortvarigt (5 sek) ved 6.700 xg at indsamle væsken ved bunden af ​​røret.
      5. Der tilsættes 10 ul af 20% SDS at fuldføre cellelyse og blandes forsigtigt ved stuetemperatur i 2 minutter.
      6. Tilsæt 4 pi RNase A (100 mg / ml stamopløsning) og blandes forsigtigt (på en rocker eller ved at vende rørene) ved stuetemperatur i 2 minutter.
      7. Tilsæt 200 pi buffer AL (fra sættet) og vortex i 15 sek. Inkuber prøverne ved 70 ° C i 10 min. Centrifugeres kortvarigt (5 sek) ved 6.700 xg at indsamle væsken ved bunden af ​​røret.
      8. Tilsæt 200 pi 100% EtOH og vortex i 15 sek. Centrifuger kortvarigt at opsamle væsken ved bunden af ​​røret, som derefter overføres blandingen (herunder eventuelt bundfald) til spin søjle (i en 2 ml opsamlingsrør) uden at fugte fælgen. Følg vasketrin ifølge fabrikantens protokol (ikke vist her).
      9. At eluere DNA overføre kolonne i et mærket mikrofugeglas, tilsættes 50 ul buffer AE (frabout kit), og der inkuberes ved stuetemperatur i 2 minutter. Centrifuger ved 4.300 xg i 1 min. Gentag én gang for en endelig elueringsvolumen på 100 ul. DNA kan opbevares ved -20 ° C indtil brug.
      10. For at udføre qPCR, sterilisere emhætter med UV-lys i 15 min før start. Det anbefales at forberede en 96-brønds plade map regneark til at registrere såvel steder for hver prøve.
      11. Forbered standardkurve ved hjælp af en 10 ng / ul bestand af genomisk pneumokok DNA (udvundet fra henvisning stamme ATCC 6305).
        1. Tø pneumokok lager DNA og centrifuger kortvarigt (5 sek) i en bordplade centrifuge.
        2. Udfør 01:10 seriefortyndinger i 6 prelabeled mikrocentrifugerør ved tilsætning af 3 pi DNA til 27 pi nuclease-free H2O, skiftende tips og vortexing mellem hver fortynding. Den endelige fortynding serien består af 6 rør: 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 og 0,00001 ng / ul.
          Bemærk: Disse kan opbevares ved 4 ° C i op til én uge.
      12. Prepare LytA MasterMix således i en steril 15 ml konisk rør i et sterilt PCR hætte. Optø komponenter på is og vortex umiddelbart før brug. et al.15 og vises i listen over materialer.
      13. Vortex og belastning 23 gl / brønd af LytA blande i de relevante brønde. Se pladediagram.
      14. Transport plade til skabelon tilføjelse område (helst en steril skab i et særskilt rum) for prøve læsning.
      15. Brug en P2 pipette til at indlæse prøver, skiftende tips til hver brønd. Alle prøver kørt in duplo. Se pladediagram for placering.
      16. For standard curve brønde tilsættes 1 ul / brønd af en passende fortynding af standardkurve DNA plus 1 gl / brønd H2O for at bringe slutvolumenet op på 25 ul.For ingen skabelon kontrolbrønde, tilsættes 2 ul H 2 O.
      17. Tilsæt 2 gl / brønd af prøve-DNA i passende brønde.
      18. Cap alle brønde i brug. Sørg hætter er lukket stramt. Hurtigt dreje PCR-plade (5 sek), før du lægger pladen i en real-time PCR-maskine.
      19. Load plade ind i PCR-maskine og køre qPCR i henhold til anvisningerne fra maskinfabrikanten. Følgende hydrolysebetingelser sonde cyklisternes forhold anbefales:
        20. komponent per reaktion x 102 (fuld plade)
        LytA F 0,25 pi 10 pM lager 25.5 pi
        LytA R 0,25 pi 10 pM lager 25.5 pi
        LytA sonde 0,5 pi 10 pM lager 51 pi
        H2O 9.5 pi 969 pi
        Master mix 12.5 pi 1.275 pi
        Slutvolumenet 23 pi 2.346 pi
        Trin 1 (1x): 3 min ved 95 ° C
        Trin 2 (40x): 20 sek ved 95 ° C
        20 sek ved 60 ° C
      20. Indsamle data og kvantificere pneumokok-DNA ved hjælp af standardkurven. Bakterielle belastninger beregnes som tidligere beskrevet 17, anslår, at 1 pg af genomisk DNA svarer til 447,4 celler, og rapporteret som CFU / ml (forudsat one genom per CFU, og en kopi af LytA per genom; se figur 4). For en vellykket assay bør R2 værdi ≥ 0,98, og alle positive resultater inden for området fra standardkurven (Ct-værdier mindre end den opnået for 0,00001 ng / ul standardkurve punkt anses baggrund / Lyta negativ).
        Bemærk: Nogle real-time PCR-systemer kommer med analyse software, der kan bruges til at konstruere standard kurver og beregne ubekendte. Ellers kan disse beregninger udføres i Excel eller lignende programmer. Et eksempel standardkurve er vist i figur 4.
      21. Til beregning af pneumokok vedhæftning, normalisere antallet af klæbende pneumokokker fra betingelse B. CCL-23 celler + pneumokokker til 100%, og sammenligne klæbende pneumokokker fra andre forhold til denne betingelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultater fra et repræsentativt eksperiment, hvor pneumokokker (S. pneumoniae PMP843 en koloniserende 19F isolat) blev tilsat til CCL-23 celler i 1 time efter tilsætning af S. salivarius og pneumokok vedhæftning blev kvantificeret ved både kimtal og Lyta qPCR er vist i tabel 2.. Resultaterne var konsistent mellem de to metoder til både det absolutte antal af bakterier (præsenteret som CFU / ml), og% tilslutning, normaliseret til det antal for vedhængende pneumokokker i brøndene indeholdende pneumokokker alene. Heparin anvendes som en kontrol, som det er kendt for at hæmme pneumokok vedhæftning og derfor reduceret vedhæftning i pneumokokker + heparin tilstand (typisk <40% sammenlignet med pneumokokker alene) er indikativ for et vellykket assay. S. salivarius hæmmer pneumokok vedhæftning på en dosis-afhængig måde, som vist i tabel 2, hvor den høje koncentration af S. salivarius (ca.ly 10 S. salivarius: 1 pneumokokker) resulterede i den laveste pneumokok vedhæftning.

Figur 5 viser overholdelse af pneumokokker til CCL-23 celler, når S. salivarius tilsættes 1 time før pneumokokker (preaddition), sideløbende (coaddition) eller 1 time efter pneumokokker (post-tilføjelse). S. salivarius er mere effektive til at hæmme pneumokok vedhæftning når tilsat før pneumokokker, da både den høje og mellemstore doser af S. salivarius væsentligt reduceret pneumokok vedhæftning i preaddition assay (figur 5A), mens kun den høje dosis på S. salivarius inhiberede pneumokok vedhæftning i coaddition og post-additionssalte assays (figurerne 5B og 5C).

De i tabel 2 og figur 4 og 5 data blev opnået ved anvendelse af en tidligere version af LytA qPCR primere og sonden 17. Den nuværende protokol beskriver den opdaterede qPCR analysen.

Figur 1
Fig. 1. Repræsentative vækstkurver S. pneumoniae PMP843 (A) og S. salivarius K12 (B). For hver art, CFU / ml som bestemt ved levedygtig tælling vises i sort (venstre y-akse), og optisk densitet (OD) ved 600 nm er gråt (højre y-akse). Mid-log fase blev estimeret ved levedygtig tælling til at være 3 timer for S. pneumoniae PMP843 og 2 timer for S. salivarius K12. Klik her for at se større billede .

fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51069/51069fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figur 2. Eksempler på raske CCL-23 celler og CCL-23 celler med cytopatiske virkninger (CPE). A) Eksempel på en sund, sammenflydende monolag af CCL-23 celler. B) CCL-23 celler med cytopatiske virkninger. Bemærk afrunding af celler, lyse intracellulære regioner og områder af forstyrret monolag hvor cellerne har løftet fra pladen. Billeder blev taget med et omvendt lysmikroskop ved 200X forstørrelse. Klik her for at se større billede .

Figur 3
Figur 3. S. salivarius og pneumokok kolonier på hesteblod agar. S. salivarius kolonier er små og hvid, som angivet ved den hvidepil og bogstavet A. Pneumokok (S. pneumoniae) kolonier er typisk større, fladere, og grønlig farve, som angivet af den hvide pil og bogstavet B. Klik her for at se større billede .

Figur 4
Fig. 4. Eksempel S. pneumoniae standardkurve for qPCR. er Genomiske DNA vist beregninger sammen med Ct-værdier (* gennemsnit af dobbelte standardkurve brønde fra et repræsentativt qPCR assay), og den resulterende standardkurve, ligning og R2 værdi vises på grafen. Klik her se større billede .

Figur 5 indhold-width = "6tommer" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" width = "600" />
Fig. 5. Virkning af S. salivarius om pneumokok tilslutning til CCL-23 celler Pneumokok overholdelse CCL-23 cellemonolag når celler blev inkuberet med pneumokokker alene. (Pnc, normaliseret til 100%), med pneumokokker og 100 U / ml heparin (heparin), eller med pneumokokker og S. salivarius tilsat i et forhold på 10: S. salivarius: 1 pneumokokker (høj), ~ 1 S. salivarius: 1 pneumokokker (medium), eller ~ 1 S. salivarius:. 10. pneumokokker (lav) S. salivarius blev tilsat 1 time før (A), på samme tid som (B) eller 1 time efter pneumokokker (C). n ≥ 3, * angiver p <0,05 sammenlignet med pneumokokker alene (Students t-test). Klik her for at se større billede .

"Fo: keep-together.within-side =" altid ">

Gruppe Assay tilstand Noter
A CCL-23 celler alene
B CCL-23 celler + pneumokoktyper
C CCL-23 celler + pneumokokker + heparin Heparin blokke pneumokok tilslutning til celleoverfladen glycosylaminoglycans 16 og er anvendt som en kontrol
D CCL-23 celler + pneumokokker + S. salivarius [høj] Ca. 1 pneumokokker: 10 S. salivarius
E CCL-23 celler + pneumokokker + S. salivarius [med] Ca. 1 pneumokokker: 1 S. salivarius
F CCL-23 celler + pneumokokker + S. salivarius [lav] Ca. 10 pneumokokker: 1 S. salivarius


Tabel 1. Testet i pneumokok adhærenceprøve betingelser. De seks grundlæggende assaybetingelser er beskrevet her.

6
Assay stand * CFU / ml Pnc (qPCR) % Tilslutning (qPCR) CFU / ml Pnc (kimtal) % Tilslutning (kimtal)
Pnc alene 1,1 x 10 7 100 9,1 x 10 6 100
Pnc + heparin 1,5 x 10 6 14 7,6 x 10 5 8.
Pnc + Sal [høj] 6,1 x 10 5 6 3,2 x 10 5 4.
Pnc + Sal [med] 3,6 x 10 6 33 2,7 x 10 6 29
PNC + Sal 9,8 x 10 6 92 90

Tabel 2: Pneumokok tilslutning til CCL-23-celler efter tilsætning af S. salivarius som bestemt ved LytA qPCR og levedygtig tællemetode * Pnc = pneumokokker.; Sal = S. salivarius; [Høj] = cirka 10 Sal: 1 Pnc; [Med] = cirka 1 Sal: 1 Pnc; [Lav] = cirka 1 Sal: 10 Pnc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En kritisk del af dette assay er at tilføje de passende koncentrationer af S. salivarius og pneumokokker i afsnit 3.1.7 og 3.1.12. Koncentrationerne estimeres ved brug OD aflæsninger men den nøjagtige inocula er ikke fastsat indtil pladerne tælles den følgende dag. Af denne grund anbefaler vi udfører vækstkurver at måle OD og kimtal (CFU / ml) over tid for alle anvendte bakteriestammer i analysen at identificere de midt-log-fase og hjælpe med at estimere koncentrationen af ​​OD. Derudover kan pneumokokstammer væsentligt forskellige i deres adhærensegenskaber. Stammer med god vedhæftning (> 10% af podestoffer klæber til epitelceller efter en 3 timers inkubation) anbefales til assays der undersøger evnen af ​​probiotika til at inhibere pneumokok vedhæftning. Selv når de udføres af en erfaren operatør kan adhærens varierer assay til analyse, som det fremgår af de relativt store fejlsøjler ses i figur 5.. ForDerfor anbefaler vi mindst tre gentagelser for hvert forsøg, med dobbelte brønde for hvert assay tilstand. Tilsvarende variation er blevet rapporteret i compliance-analyser ved hjælp af Escherichia coli 18. I denne protokol, er cellerne inkuberes i 3 timer efter tilsætning af pneumokokker. Inkubationstiden kan afkortes, hvis overholdelse tidsforløbet eksperimenter udføres, og viser, at størstedelen af ​​bakterier klæbe i løbet af den første times inkubation.

Denne protokol præsenterer to metoder til at kvantificere pneumokok tilslutning, qPCR og levedygtig tælling. Begge metoder er egnede, og valget afhænger af operatørens præference og tilgængelige lab udstyr (f.eks adgang til en real-time PCR-maskine). Kvantificering af levedygtige optælling er en billig metode, der ikke kræver yderligere reagenser eller en real-time PCR-maskine. Men bruger det mange plader (typisk 80 plader til en 12-brønds assay) og skal udføres omgåendely ved afslutningen af assayet og tælle pneumokok kolonier kan være vanskeligt på plader, der indeholder en stor mængde af S. salivarius. Kvantificering af qPCR er dyrere og kræver en langvarig dna-ekstraktion skridt, men prøver kan opbevares frossen og behandles i partier, øge effektiviteten. Det ekstraherede DNA kan også anvendes til andre formål, såsom qPCR detektion af vedhængende S. salivarius. Hvis efterforske S. salivarius tilslutning, anbefales det at omfatte brønde med CCL-23 celler plus S. salivarius (uden pneumokokker) og brønde med CCL-23 celler plus S. salivarius og heparin som ekstra kontroller.

Den grundlæggende analyse kan også tilpasses for at undersøge andre videnskabelige aspekter af kolonisering. For eksempel kan effekten af ​​probiotika på cytokinproduktion vurderes ved at lagre og analysere cellesupernatanter. Assayet kan også modificeres til at undersøge bakteriel invasion snarere end vedhæftning afinkubere cellerne med cellemembran uigennemtrængelige antibiotika for at dræbe ekstracellulære bakterier inden høst og lyserende celler. Som beskrevet her, ikke skelner analysen mellem vedhængende og invasive (internaliseret) pneumokokker. Imidlertid har tidligere undersøgelser vist, niveauerne af internaliseret pneumokokker at være meget lille (typisk ≤ 0,01% af podestoffer) 10, så for de fleste isolater (herunder PMP843) størstedelen af celleassocieret pneumokokker er klæbende snarere end internaliseret. Yderligere anvendelser omfatter testning af andre probiotiske arter for evnen til at inhibere kolonisering og / eller ser på mutante bakteriestammer for at undersøge den rolle, som specifikke gener af interesse.

En indlysende begrænsning af denne in vitro-assay er, at det ikke omfatter en etableret epitel immunceller normale flora, eller andre faktorer, der sandsynligvis påvirker pneumokok kolonisering in vivo. For fuldt ud at vurdere, om probiotika could være nyttige i at forebygge patogen kolonisering i luftvejene, in vivo undersøgelser med dyremodeller og humane kliniske forsøg er berettiget. Ikke desto mindre, in vitro adhærens analyser tjene som en nyttig skærm til at identificere probiotika med potentiale til at hæmme pneumokok vedhæftning og kan give oplysninger om præferentielle dosering strategier, samt give en eksperimentel model, der kan bruges til mekanistiske undersøgelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet med midler fra Murdoch Childrens Research Institute og Victorias regerings operationelle infrastruktur Support Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

Tags

Immunologi Gram-positive bakterielle infektioner lungebetændelse bakterielle lungesygdomme luftvejsinfektioner, Overholdelse kolonisering probiotika,
Undersøge effekterne af probiotika på Pneumokok Colonization Brug af en<em&gt; In Vitro</em&gt; Adhærenceprøven
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter