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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査 Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

インビトロでの付着アッセイは、細胞単層上皮するような肺炎球菌のコロニー形成を阻害するためのプロバイオティクスの使用のような潜在的な介入を調査するために、肺炎連鎖球菌の付着を研究するために使用することができる。

Abstract

鼻咽頭の上皮層への肺炎球菌 （肺炎球菌）の付着が植民地になることができます。 インビトロ接着アッセイは、細胞上皮する肺炎球菌の付着を研究するために使用することができ、肺炎や中耳炎などの肺炎球菌感染症のための前提条件と考えられている単層および、そのようなプロバイオティクスの使用など電位介入を調査するために、肺炎球菌のコロニー形成を阻害すること。ここで説明するプロトコルは、（時にはHEp-2細胞とも呼ばれる）は、ヒト上皮細胞株CCL-23への肺炎球菌の付着に対するプロバイオティックストレプトコッカス·サリバリウスの効果を調査するために使用される。上皮細胞および細菌細胞の1）準備、細胞単層上皮への細菌の2）に加え、3）生菌数（段階希釈およびプレーティング）による接着性の肺炎球菌の検出または定量的リアルタイムPCR（定量PCR：アッセイは、3つの主要な手順が含まれます）。このTEChniqueは比較的簡単であり、組織培養のセットアップ以外の特殊な装置を必要としません。このアッセイは、他のプロバイオティック種および/または肺炎球菌のコロニー形成の潜在的な阻害剤を試験するために使用することができ、容易に肺炎球菌の付着および侵入に関する他の科学的問題に対処するために修飾することができる。

Introduction

肺炎連鎖球菌 （肺炎球菌）は、肺炎、中耳炎、髄膜炎などの感染症を引き起こす可能性グラム陽性細菌である。これは、低所得国の子供たちと、毎年1 5歳未満の子供の推定80万死亡の原因の病気の主要な原因である。肺炎球菌は、しばしば幼児の鼻咽頭に運ばれる。この植民地は一般的に無症候性と考えられていますが、肺炎球菌感染症に先行し、ヒト集団2中の細菌のための貯蔵所として機能します。肺炎球菌共役ワクチン接種は、効果的なワクチン内に含まれる血清型のキャリッジを低減します。しかし、そこに90以上の肺炎球菌血清型があり、ワクチン接種はワクチン血清型の排除がnonvaccine血清型3に起因するキャリッジと病気の上昇が続いていることにより、血清型の交換、につながることができます。また、一部の高リスク集団において、肺炎球菌植民地化は、多くの場合、前に最初のワクチン用量4,5の投与と、非常に人生の早い段階で発生します。最近では、プロバイオティクスの使用は、肺炎球菌のコロニー形成を阻害する6,7 -付加的な戦略として提案されている。 インビトロ付着アッセイは、肺炎球菌付着8,9を調べるために使用されてきた。これらのアッセイは、肺炎球菌付着10上のプロバイオティックラクトバチルス·ラムノサス GG（LGG）の影響を調査するために適応されている。

LGGおよび他の乳酸菌に加えて、 ストレプトコッカス·サリバリウス 、口腔の一般的な居住者は、潜在的なインビトロおよび11 に肺炎球菌および他の呼吸器病原体を阻害する能力のコロニー形成への気道のための潜在的なプロバイオティクスとして研究されている- 13。ここで紹介するプロトコルは、S.の効果を調査するために使用される接着アッセイを記載肺炎球菌付着に対するサリバリウス K12ヒト上皮細胞株CCL-23へ。成長および付着特性は単離物10,14間で実質的に変化し得るように、アッセイで使用する前に、肺炎球菌分離株は、付着力を評価した。肺炎球菌やブドウの成長曲線サリバリウスを、光学密度（OD、 図1）（コロニー形成単位またはCFU / ml）を中間対数相と推定濃度を決定した。それは、それぞれのアッセイで使用する前に隔離するための生菌数とODにより成長を調べることをお勧めします。このアッセイは、標準的な組織培養施設及び設備を有する任意の実験室で行うことができる。このプロトコルでは、S.の3用量の効果サリバリウス前Sの付着に対する肺炎球菌のほかに1時間投与肺炎球菌 PMP843、鼻咽頭スワブから派生した血清型19Fキャリッジ分離株は、検査されます。付着性肺炎球菌を定量化するには、2つの異なる方法が提示されています。抑止する血液寒天上で平板鉱山生菌数、およびDNA抽出および定量PCRによる肺炎球菌15 LYTA遺伝子の検出。基本的な接着アッセイプロトコルは容易に異なる用量又はプロバイオティクスの投与時間を試験するために修飾することができ、また、他の細菌株又は種を用いることができる。

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Protocol

1。上皮の調製および細菌細胞

  1. CCL-23上皮細胞の解凍
    1. 〜30分間37℃の水浴中で10％ウシ胎児血清（FBS）を含有する予熱し最小必須培地（MEM）。
    2. 使用前に少なくとも10分間、UV光で組織培養が承認したバイオセーフティキャビネットを殺菌し、70％エタノールで作業領域を拭う。バイオセーフティキャビネット内の70％エタノールと場所を温めメディア瓶を拭きます。
    3. を25mlピペットを用いて、T-75フラスコに14mlの培地を移す。細胞ながら37℃のインキュベーターにフラスコを置き（セクション1.1.4）を解凍している。
    4. 〜80％を解凍するまで37℃の水浴中で、適切な安全上の注意と暖かいを使用して液体窒素貯蔵からCCL-23細胞のバイアルを取り外します。
    5. バイオセーフティキャビネットにセクション1.1.3で作成フラスコを返します。 Tへの70％エタノールと転写内容（1ml）でCCL-23細胞のバイアルの外面を拭き取るP1000ピペットを用いて-75フラスコ。
    6. 37℃で、5％CO 2、相対湿度95％の組織培養インキュベーターで一晩（16-20時間）にその側面にフラスコをインキュベートする。
    7. 健康的な形態を確認するために、顕微鏡下で細胞を確認して、メディアを取り出し、新鮮な15ミリリットルと交換し、MEM +10％FBSを予め温め。
  2. CCL-23上皮細胞の維持
    1. 細胞が約80％コンフルエント（1〜2日）、25 mlピペットを用いて培地を除去し、穏やかに8-10​​で細胞を2回洗浄することにより通路たらmlの10 mlピペットを用いて予め温めたリン酸緩衝生理食塩水（PBS）。
    2. PBSを削除し、滅菌0.25％トリプシン-EDTA（0.25％（w / v）のトリプシン、0.1mMのEDTA）の1ミリリットルを加える。その側にフラスコを回し、トリプシンは細胞の融合層をカバーし、37℃、5％CO 2インキュベーター内で2〜3分間、フラスコを培養することを確認するために回転させます。
    3. バイオセーフティキャビネットにフラスコを返し、あらかじめ温めておいたMEM +10％FBS 9ミリリットルを追加し、ピペットを上下に6 -8X細胞を取り除くために、フラスコの側面下に液体を噴射、細胞を再懸濁する。
    4. 分割細胞1:15（1ミリリットル+た14ml MEM + 10％FBS）又は1時3​​0分（0.5ミリリットル+ 14.5ミリリットルMEM + 10％FBS）は、過剰の細胞を廃棄し、37℃、5％COにフラスコを返す2インキュベーター。
    5. 継代倍以上の接着アッセイで使用する前に細胞。通常、細胞は3〜4日ごとに分割されます。
  3. CCL-23上皮細胞の播種 （アッセイを遵守する前に1日、プロトコル2）
    1. 予め温めておいたMEM中に再懸濁セクション1.2.1-1.2.3に記載されているようにコンフルエントの細胞を分割+ 5％FBS（FBS濃度はアッセイにおいて血清成分の干渉の可能性を低減するために下げられる）。細胞の20μLを削除して、トリパンブルー染色し、血球計数器を用いてカウントします。
    2. 無菌50mlチューブ中に1.5×10 5細胞/ mlの濃度まで予め温めMEM + 5％FBSで細胞を希釈する。
    3. 種子組織中の細胞/ウェルの1ミリリットル培養は、24ウェルプレートを処理した。
  4. 細菌の作製
    この手順では、肺炎球菌やブドウの製造のために続けることができますサリバリウス 。細菌の増殖培地は、典型的には、（汚染された場合、一般的に曇って表示されます）予熱し及び無菌性をテストするために、一晩37℃のインキュベーター内に保持されている。
    1. ウマ血液寒天（HBA）のプレート上で分析、ストリーク細菌を遵守し、35〜37℃および18〜24時間、5％CO 2でインキュベートする前に二日。ヒツジ血液寒天培地は、代替として使用することができる。
    2. 次の日、無菌30ミリリットルチューブに0.5％酵母エキス（THB + YE）培地で10ミリリットルトッドヒューイットブロスをピペッティングすることにより、各細菌種のために一晩培養を準備します。 10μLループを使用して、約10から12よく分離したコロニーを接種する。簡単に言うと渦と14〜16時間、35〜37℃、5％CO 2でインキュベートする。ブロス培養に長すぎる放置しておく肺炎球菌が自己分解することに注意してください。

    2接着性アッセイ：細胞単層上皮への細菌の追加

    1. 肺炎球菌とSの中間対細菌培養の準備サリバリウス
      1. ピペット2の滅菌30ミリリットルチューブ、1つの標識肺炎や他のSのそれぞれに予め温めバーツ+ YEの10ミリリットルサリバリウス 。
      2. 対数中期に到達するために、肺炎球菌は、〜3時間、およびSを必要とするサリバリウスは、〜2時間のインキュベーションを必要とする（ 図1を参照）。同時に両方の文化を起動します。ボルテックス（3-5秒）で一晩細菌培養し、100μlの肺炎球菌および100μlのSを追加対応するチューブにサリバリウス 。
      3. 簡単に言うと渦とS.約2時間、37℃で培養物をインキュベートサリバリウスと肺炎球菌のための3時間。
    2. 接着アッセイのためのCCL-23細胞の調製
      1. 倒立顕微鏡を用いて、confluenための24ウェルプレートをチェックする健康的な細胞形態を持つT単層。単層細胞凝集や、細胞の丸めや接着の損失などの細胞変性効果（ 図2を参照）の証拠なしで、> 80％コンフルエントにする必要があります。
      2. 各ウェルの細胞単層を乱さないようするために、わずかにプレートを傾け、トランスファーピペットを使用してメディアを取り出します。
      3. 優しく細胞を洗浄するために、〜500μlの血清学的ピペットを用いて各ウェルにPBSを予め温め、わずかにプレートを傾け、トランスファーピペットで取り除いて追加します。 PBSを捨てます。一回の洗浄ステップを繰り返します。
      4. 各ウェルに予め温めたMEM500μlの+5％FBSを追加します。細菌培養の準備中のCO 2インキュベーターに24ウェルプレートを返します。
        注意：感染多重度の正確なCCL-23細胞数（MOI）を決定するために、2つの井戸をトリプシン処理し、感染の日にカウントすることができます。

    3。接着アッセイ

    1. に肺炎球菌を追加MOI〜10時01分で、CCL-23細胞。二連のウェル中に、表1に示す条件をテストします。
      1. S.を1mlの600（OD）での光学密度を測定するサリバリウス文化 。 ODは0.3〜0.6の間であるべきである。
      2. Sの5ミリリットルを転送4分間1870×gで10ミリリットルチューブ遠心にサリバリウス文化 。
      3. 上澄み液を捨て、セクション3.1.1におけるOD読み取りに基づいて、Sを再懸濁0.85％のNaCl（最終濃度約1.5×10 9 CFU / ml）を200〜1,000μlの中サリバリウス 。一般的なガイドラインとして、0.375のODは、260中に再懸濁されます。 S.の1:10と1:100の希釈液を調製するサリバリウスを NaCl 0.85％を用いて。
        注：合計で、Sの（高、中、低用量を表す）を3つの濃度サリバリウスアッセイで試験する。高用量は、約10の比であるS.サリバリウス ：1肺炎球菌、媒体は〜1 Sである。 サリバリウス ：1肺炎球菌、および低いが〜1 Sで。サリバリウス：10肺炎球菌。
      4. インキュベーターから24ウェルプレートを取り出します。
      5. ヘパリン対照ウェルから、メディアを40μlを除去し、100 U / mlの最終濃度のためにヘパリンを50μl（1,000 U / mlのストック濃度）を追加します。
      6. CCL-23細胞のみとCCL-23細胞および肺炎球菌（NO S.サリバリウス ） を含むウェルを含むウェルに0.85％のNaCl 10μlを加える。
      7. 、Sの1:10〜1:100に希釈されていないの10 ULを追加各ウェルにサリバリウス 。
        注：S.サリバリウスはまた、プロバイオティクス投与時間の影響を調べるために、肺炎球菌（後添加）後の肺炎球菌（coaddition）または1時間と同時に添加することができる。
      8. 細胞層を有する細菌の接触を促進し、37℃、5％CO 2で1時間インキュベートし、3分間114×gで24ウェルプレートを遠心分離する。
      9. Sの段階希釈を行う重複したHBA上の0.85％NaClおよびプレートのサリバリウス株生菌数のためのプレート。まず、10 -1希釈し、パルス渦（5秒）、変更のヒントを行い、0.85％NaClを450μlに10 -1希釈液50μlを追加するには、0.85％NaClを450μlに株式の50μLを追加10 -2希釈をするなど10 -7までです。
      10. プレート100 10 -5のμL、10 -6、およびHBAプレート上の重複での10 -7の希釈し、滅菌スプレッダーで広げた。 37℃、5％CO 2で一晩反転HBAプレートをインキュベートする。
      11. 1時間のインキュベーションの終わりに向かって、肺炎球菌のためのセクション3.1.1-3.1.3を繰り返します。 ODを0.2から0.7の間であるべきである。ダウン肺炎球菌培養物1mlをスピン〜1.5×10 8 CFU / mlの濃度まで（OD読み取りに基づいて）0.85％NaClを300〜2,000μlにペレットを再懸濁します。一般的なガイドラインとして、0.3のODを500μlに再懸濁されます。
      12. S.と1時間インキュベートした後サリバリウスは 、10μを追加、陰性対照ウェル（細胞のみを含む）を除く全てのウェルにL希釈していない肺炎球菌。
      13. 3分間114×gで遠心分離を24ウェルプレートで3時間、37℃、5％CO 2でインキュベートする。セクション3.1.9とプレート希釈液10 -4、生菌数の重複のHBAプレート上10 -5、および10 -6で説明したように、0.85％NaCl中の肺炎球菌株の連続希釈を行う。
    2. 3時間後、単層（ 図2を参照）、健康に見えることを保証するために、顕微鏡下で細胞を確認してください。各ウェルから培地を除去し、穏やかにセクション2.2.3で説明したように、細胞を3回洗浄します。各条件ごとに異なる​​ピペットを用いてこのステップは、非付着性肺炎を除去することが不可欠である。単層を洗浄工程中に離れて来るべきではありません。これは、顕微鏡下で再度チェックすることによって確認することができる。

    注記：このステップの間に除去メディア（追加分析のために-20℃で保存することができます<EM>例えばサイトカインレベルの測定）。

    1. 各ウェルに0.1％ジギトニン（優しい洗剤）を200μlを加え、37℃で7分間インキュベート、5％のCO 2。
    2. 各ウェルにTHBへのメディアの800を添加する。必要に応じて、細胞単層が完全に除去されることを確認するためにピペットチップでウェルを3〜4倍をこすり溶解する上下にピペッティングとすることにより、細胞、および、。ウェル間のヒントを変更します。
    3. 各ウェルP1000ピペットを使用してからコンテンツを削除し、ラベルされたマイクロチューブに移す。

    付着性肺炎球菌の4。定量

    接着性の肺炎球菌の生菌数を決定する（段階希釈し、血液寒天培地上にプレーティング法）により、または定量的リアルタイムPCRによって定量化することができる。

    1. 生菌数法
      このメソッドはすぐに接着アッセイのステップ3.5の後に実行する必要があります。
      1. 各アッセイのためによく、中に採取された試料の希釈系列を用意0.85％NaClを450μL、パルスボルテックスにサンプルを50μlを加え、10 -6希釈までのセクション3.1.9で説明したように連続的に希釈することにより、接着アッセイのステップ3.5。
      2. 100μlの10 -3、10 -4、10 -5、およびプレート 血液寒天上で二連で10 -6希釈液を滅菌スプレッダーで広げ、37℃で一晩、反転プレートをインキュベート、5％のCO 2。だけではCCL-23細胞を含むウェルは、任意の細菌を含むべきではないとメッキすることができることに注意してくださいきちんとした（100μlを原液）無菌性制御など。
      3. 次の日（30〜300コロニーを含む）適切な希釈プレート上のコロニーを計数することにより肺炎球菌接種を決定する接着アッセイのセクション3.1.13に調製。二つのプレートから平均値を使用して接種物のCFU / mlのを計算します。同様に、Sを決定する準備プレート上のコロニーをカウントしてサリバリウス種菌セクション3.1.10における。
        注意：プレートのみ肺炎球菌が含まれている必要があり;他の種の存在は、アッセイは、汚染されたことを示し、結果は無効となります。
      4. 肺炎球菌付着レベルを決定するために、セクション4.1.1で調製した各試料について、（30〜300肺炎球菌コロニーを含む）は、適切な希釈プレートをカウントします。尚、S. 図3に示すように、肺炎球菌は、α-溶血をする平らで緑がかった原因となるのに対し、 サリバリウスコロニーは小さく、白になります。、肺炎球菌の付着を計算条件Bから付着した肺炎球菌の数を正規化する。 CCL-23細胞は+ 100％に肺炎球菌などの条件から、この条件に付着した肺炎球菌と比較します。
    2. 定量PCR法
      接着性アッセイにおいて収集されたサンプルは、3.5 DNA抽出まで-20℃で保存することができる、ステップ。 DNA抽出は、市販のキットを使用して実施し、4.2.1-4.2.9の節で説明しているような定量PCR各項4.2.10-4.2.20で言う。
      1. 酵素溶解液（1 mg / mlのリゾチームを含む50 mMリン酸緩衝液pH 6.7、0.075 mg / mlのムタノリシン、及び2 mg / mlのプロテ​​イナーゼK）を準備します。以下のレシピを使用することができる10ミリリットル（50抽出のための十分な）を作る。酵素溶解緩衝液は、使用前に新たに調製すべきである。

        50 mMリン酸緩衝溶液7.25ミリリットル液（pH6.7）
        最終的な[1 mg / mlの] 10 mg / mlのリゾチーム株式の1.00ミリリットル
        0.75最終的な[0.075 mg / mlの] 1 mg / mlのムタノリシン株式ミリリットルを
        最終的な[2 mg / mlの] 20 mg / mlのプロテ​​イナーゼKの株式の1.00ミリリットル
      2. 氷上または4℃でサンプルを解凍ラベルされたマイクロチューブに各試料100μlアリコートをボルテックスし、転送します。バック-20℃〜冷凍庫に元のサンプルを返します。
      3. 10分間6700×gでサンプルを遠心分離する。
      4. 削除し、上清を捨てる。ペレット再懸濁する渦に酵素溶解緩衝液200μlを加える。 Incub30分間56℃でサンプルを食べました。チューブの底に液体を回収するために6700×gでスピンダウン（5秒）。
      5. 細胞溶解を完了し、2分間室温で穏やかに混合し、20％SDSを10μlのを追加します。
      6. のRNase A（100 mg / mlのストック）の4μLを加え、2分間室温で（ロッカー上またはチューブを反転させて）静かに混ぜる。
      7. （キットから）のBuffer ALを200μlを加え、15秒間ボルテックス。 70℃で10分間、サンプルをインキュベートする。チューブの底に液体を回収するために6700×gでスピンダウン（5秒）。
      8. 15秒、100％のエタノールと渦の200を添加する。縁を濡らさない（の2mlコレクションチューブに）スピンカラムに（任意の沈殿物を含む）の混合物を移送次いで、チューブの底に液体を収集するために簡単にスピン。製造者のプロトコル（ここでは図示していない）が応じて洗浄手順に従ってください。
      9. 、DNAを溶出ラベルマイクロチューブにカラムを転送するには、バッファA〜Eの50μLを加える（FRオムキット）、そして2分間室温でインキュベートする。 1分間4,300×gで遠心分離する。 100μlの最終溶出量に対して一度繰り返します。 DNAは、使用するまで-20℃で保存することができる。
      10. 定量PCRを実行するには、開始前15分間のUV光でフードを殺菌。各サンプルのほかの場所を記録する96ウェルプレートマップのワークシートを準備することをお勧めします。
      11. （参照株のATCC 6305から抽出された）ゲノム肺炎球菌DNAを10 ngの/μLストックを使用して標準曲線を作成。
        1. 肺炎球菌株DNAを解凍し、卓上遠心機で短時間（5秒）をスピンダウン。
        2. 各希釈の間にヒントやボルテックスを変え、27μlのヌクレアーゼフリーのH 2 Oに3μlのDNAを添加することにより、6前標識マイクロチューブで1:10希釈を行う。 1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001 NG /μL：最終希釈シリーズは6管で構成されています。
          注：これらは1週間まで4℃で保存することができる。
      12. た準備次のようにE LYTAは、無菌のPCRフード内の滅菌15ミリリットルコニカルチューブにマスターミックス。使用直前に氷と渦にコンポーネントを解凍する。 らによって発表された。15及び材料のリストに示されている。
      13. LYTAの渦と負荷23μL/ウェルを適切なウェルに混ぜる。プレートマップを参照してください。
      14. サンプルローディングに加えてエリア（別々の部屋で、好ましくは滅菌キャビネット）テンプレートに輸送プレート。
      15. 各ウェルについてのヒントを変更し、サンプルをロードするためのP2ピペットを使用してください。全てのサンプルは、重複して実行されています。場所のプレートマップを参照してください。
      16. 標準曲線ウェルについて、25μlの最終容量を持って来るために1μL/ウェル標準曲線DNAの適切な希釈のプラス1μL/ウェルのH 2 Oを加える。鋳型なしの対照ウェルでは、2μlのH 2 Oを追加
      17. 適切なウェルに2μL/ウェルのサンプルDNAを追加します。
      18. 使用中のすべてのウェルにキャップ。キャップがぴったりと閉じていることを確認します。迅速なリアルタイムPCR装置にプレートをロードする前に、PCRプレート（5秒）をスピン。
      19. 機械メーカーの指示に従って、PCR機と実行定量PCRへのロードプレート。次の加水分解プローブサイクリング条件が推奨されています。
        20. コンポーネント 反応あたり X 102（フル版）
        LYTA F 10μMの株式の0.25μL 25.5μL
        LYTA R 10μMの株式の0.25μL 25.5μL
        LYTAプローブ 10μMの株式の0.5μL 51μL
        H 2 O 9.5μL 969μL
        マスターミックス 12.5μL 1275μL
        最終容量 23μL 2,346μL
        ステップ1（1X）： 95℃で3分間
        ステップ2（40倍）： 95℃で20秒
        60℃で20秒間
      20. データを収集し、標準曲線を用いて肺炎球菌のDNAを定量化する。先にゲノムDNA 1pgのが447.4細胞に相当すると推定17に記載し、CFU / mlの（と仮定Oとして報告されているように、細菌負荷を算出するNEのCFU当りゲノムおよびゲノム当たりLYTAのコピー; 図4を参照）。成功したアッセイでは、R 2の値は0.98を≥すべきであり、標準曲線の範囲内のすべての肯定的な結果（CTは0.00001 NG /標準カーブポイントμLのために得られたものよりも少ない値が負の背景/ LYTA考えられている）。
        注：一部のリアルタイムのPCRシステムは、標準曲線を作成し、未知数を計算するために使用することができます解析ソフトウェアが付属しています。そうでなければ、これらの計算は、Excelまたは同様のプログラムで行うことができる。例えば、標準曲線を図4に示す。
      21. 肺炎球菌付着を計算するために、状態bから接着性肺炎球菌の数を正規化する。 CCL-23細胞は+ 100％に肺炎球菌などの条件から、この条件に付着した肺炎球菌と比較します。

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Representative Results

これ肺炎球菌（ 肺炎球菌 PMP843、植民地19F分離株）の代表的な実験からの結果は、Sの添加後、CCL-23細胞を1時間に追加されましたサリバリウス 、および肺炎球菌の付着を表2に示した生菌数とLYTA定量PCRの両方によって定量した。結果数に正規化細菌の絶対数（CFU / mlとして提示）と％付着の両方のための2つの方法間で一致していた一人で肺炎球菌を含むウェル中の接着性肺炎球菌。ヘパリンは、それが肺炎球菌の付着を阻害することが知られているので、肺炎球菌+ヘパリン状態の付着を低減（典型的に<40％、肺炎球菌単独と比較して）が成功したアッセイの指標であるようにコントロールとして使用する。S. 表2、S.高濃度に示すようにサリバリウスは 、用量依存的に肺炎球菌の付着を阻害するサリバリウス （概算LY 10 S.サリバリウス ：1肺炎球菌）は、最も低い肺炎球菌の接着された。

図5は 、CCL-23細胞への肺炎球菌の付着を示す場合に、S.サリバリウスは 1肺炎球菌には、HR（preaddition）、同時に（coaddition）、または肺炎球菌の1時間後（後添加）を添加する。S.サリバリウス前肺炎球菌に加えられたとき、Sの高、中用量の両方として、肺炎球菌の付着を阻害することで、より効果的であるサリバリウスが大幅にSの唯一の高用量のに対し、preadditionアッセイ（ 図5A）に肺炎球菌の付着を軽減サリバリウスは coadditionと後添加アッセイ（ 図5Bおよび5C）における肺炎球菌の付着を阻害した。

データを表2に示し、4,5は LYTA定量PCRプライマーの以前のバージョンを使用して得られた図と 17をプローブ。現在のプロトコルは、更新された定量PCRアッセイを説明しています。

図1
図1。Sの代表成長曲線肺炎球菌 PMP843（A）およびSサリバリウス K12（B）は、それぞれの種については、生存可能な計数によって決定されるようにCFU / mlを黒色（左y軸）に示し、600nmでの光学密度（OD）を、灰色（右y軸）に示されている。中間対数相はSのための3時間であることが実行可能な計数によって推定された肺炎 PMP843とS.のための2時間サリバリウス K12。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図2。細胞変性効果（CPE）との健全なCCL-23細胞およびCCL-23細胞の例。 CCL-23細胞の健全な、コンフルエント単層のA）の例。細胞変性効果を有するB）CCL-23細胞。細胞、細胞内の明るい領域、および細胞がプレートから浮き上がる中断単分子膜の面積の丸めに注意してください。画像は200Xの倍率で倒立光学顕微鏡を用いて撮影した。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3
図3。S.ウマ血液寒天培地上サリバリウスおよび肺炎球菌コロニー。S.白で示されるようにサリバリウスコロニーは、小さくて白い矢印と白い矢印と文字Bで示すように、文字Aの肺炎球菌（ 肺炎球菌 ）のコロニーは、色が通常、より大きなフラットにし、緑がかっている拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

図4
図4。の例S.定量PCR用肺炎球菌の標準曲線。ゲノムDNAの計算は、結果として得られる標準曲線、数式、グラフに表示されるR 2の値と、Ct値（代表定量PCRアッセイからの重複した標準曲線ウェルの*平均）と一緒に表示されます。 するには、ここをクリックしてください拡大画像を表示 。

図5コンテンツ幅= "6インチ" SRC = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg"幅= "600" />
図5。Sの影響。CCL-23細胞への肺炎球菌の接着 CCL-23細胞単層への肺炎球菌付着に対するサリバリウス細胞が単独で肺炎とインキュベートし、肺炎球菌および100 U / mlのヘパリン（ヘパリン）との、または肺炎球菌で、（PNC 100％に正規化された）とS.サリバリウスは、〜10の割合で添加：S.サリバリウス ：1肺炎球菌（高）、〜1 S.サリバリウス ：1肺炎球菌（中）、または〜1 S.サリバリウス ：10肺炎球菌（低い）S。サリバリウスを、（B）と同時に、（A）1時間前に添加し、または肺炎球菌（C）の後1時間した。 N≥3は、* Pを示し、<0.05だけでは肺炎球菌（スチューデントのt検定）。と比較すると、 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

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グループ検定条件注釈
A 一人でCCL-23細胞
B CCL-23細胞+肺炎球菌
C言語 CCL-23細胞+肺炎球菌+ヘパリン細胞表面へのヘパリンブロック肺炎球菌の付着が16グリコシルアミノグリカンおよびコントロールとして使用され
D CCL-23細胞+肺炎球菌+ Sサリバリウス [高] 約1肺炎球菌：10 S.サリバリウス
E CCL-23細胞+肺炎球菌+ Sサリバリウス [中] 約1肺炎球菌：1 S.サリバリウス
F CCL-23細胞+肺炎球菌+ Sサリバリウス [低] 約10肺炎球菌：1 S.サリバリウス


表1。肺炎球菌付着アッセイで試験条件。6つの基本的なアッセイ条件は、ここに記載されている。

6
アッセイ条件* CFU / mlのPNC（定量PCR） ％アドヒアランス（定量PCR） CFU / mlのPNC（生菌数） ％アドヒアランス（生菌数）
一人でPNC 1.1×10 7 100 9.1×10 6 100
PNC +ヘパリン 1.5×10 6 14 7.6×10 5 8
PNC +サル[高] 6.1×10 5 6 3.2×10 5 4
PNC +サル[中] 3.6×10 6 33 2.7×10 6 29
PNC +サル 9.8×10 6 92 90

表2：Sのほか、次のCCL-23細胞への肺炎球菌の接着LYTA定量PCRおよび生菌数法によって決定されたサリバリウス * PNC =肺炎球菌。 SAL = Sサリバリウス ; [高]約10サル=：1 PNCを; [中] =約1 SAL：1 PNC; 10 PNC：[低]は、約1サルを=。

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Discussion

このアッセイの重要な部分は、Sの適切な濃度を追加していますのセクション3.1.7と3.1.12でのサリバリウスと肺炎球菌。濃度をOD測定値を用いて推定しているが、プレートを次の日にカウントされるまで正確な接種物が決定されていません。この理由から、我々は、対数中期を識別し、ODによって濃度を推定するのを補助するためのアッセイで使用されるすべての細菌株についての経時的なOD及び生菌数（CFU / ml）を測定するために成長曲線を実行することをお勧めします。また、肺炎球菌株は、その接着特性が実質的に異なることができます。良好な接着性（> 3時間インキュベートした後の上皮細胞に付着した接種物の10パーセント）は肺炎球菌の付着を阻害するプロバイオティクスの能力を調査するアッセイのために推奨されていた株。経験豊かなオペレータが実行する場合であっても、図5に見られる比較的大きなエラーバーによって証明されるように、付着レベルは、アッセイアッセイを変化させることができる。についてこの理由は、我々は、各アッセイ条件の連のウェルを、各実験の3反復の最小値を推奨します。同様の可変性は、大腸菌 18を用いて接着アッセイにおいて報告されている。このプロトコルでは、細胞は、肺炎球菌の添加後3時間インキュベートする。付着の時間経過実験を行い、細菌の大部分は、インキュベーションの最初の時間の間に付着していることを示している場合、インキュベーション時間を短縮することができる。

このプロトコルは、肺炎球菌の遵守、定量PCR、生カウントを定量化するための2つの方法を提示します。どちらの方法も適しており、選択は、操作者の好みや利用可能な実験装置（リアルタイムPCRマシンへのアクセスなど ）に依存する。生存可能な計数により定量化は、さらなる試薬またはリアルタイムPCRマシンを必要としない低コストの方法である。しかしながら、多くのプレート（12 - ウェルアッセイについて、典型的には80枚）を使用し、即時実行されなければならないアッセイの終了時LY、および肺炎球菌のコロニーを計数することS.を多量に含有するプレート上で困難であることができるサリバリウス 。定量PCRによる定量化は、より高価であり、長いDNA抽出工程を必要とするが、サンプルは、効率を高める、バッチで凍結保存し、処理することができる。抽出したDNAはまた、接着性のS.定量PCR検出のような他の目的に使用することができるサリバリウス 。 Sを調査した場合サリバリウスの付着は、CCL-23細胞+ Sと井戸を含めることをお勧めしますサリバリウス （肺炎球菌を含まない）とCCL-23細胞+ Sと井戸サリバリウスやヘパリンなどの追加を制御します。

基本的なアッセイは、コロニー形成の他の科学的側面を調査するために適合させることができる。例えば、サイトカイン産生に対するプロバイオティクスの効果は、細胞上清を保存し、アッセイすることによって評価することができる。アッセイはまた、細菌の侵入よりむしろによって付着を検査するために修飾することができる収穫前および溶解細胞に細胞外細菌を殺すために、細胞膜不浸透性抗生物質で細胞をインキュベートする。ここで説明したように、このアッセイは、接着性および（内面化）、侵襲性肺炎球菌を区別しません。しかし、これまでの研究は、（PMP843を含む）のほとんどの分離株のためにそのように10（通常接種物の0.01％≤）内面化肺炎球菌のレベルは非常に小さいことが判明しているが、細胞関連肺炎球菌の大半は内部化するのではなく接着性である。追加のアプリケーションは、コロニー形成を阻害する能力について他のプロバイオティック種をテストし、及び/又は目的の特定の遺伝子の役割を調べるために、変異体​​細菌株を見挙げられる。

このin vitroアッセイの明らかな制限は、確立された上皮、免疫細胞、正常細菌叢、またはおそらくインビボでの肺炎球菌のコロニー形成に影響を与える他の要因が含まれていないことである。完全かどうかをプロバイオティクスのカップを評価するために、ldは、 インビボで動物モデルおよびヒト臨床試験を用いた研究が保証され、気道内の病原体のコロニー形成を防止するのに有用である。それにもかかわらず、 インビトロ付着アッセイは、肺炎球菌の付着を阻害するために可能性を有するプロバイオティクスを同定するのに有用なスクリーンとして機能し、優先的な投薬戦略に関する情報、ならびに機構的研究のために使用することができる実験モデルを提供することを提供することができる。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

この作品は、マードック子供研究所、ビクトリア州政府の業務インフラ支援プログラムからの資金によってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

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References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

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免疫学、発行86、グラム陽性細菌感染、肺炎、細菌、肺疾患、気道感染症、
使用肺炎球菌植民に対するプロバイオティクスの影響を調査<em&gt;体外</em&gt;接着アッセイ
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Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

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