Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

In vitro assays tilslutning kan brukes til å studere festingen av Streptococcus pneumoniae til epitel cellemonolagene og for å undersøke mulige intervensjoner slik som bruk av probiotika for inhibering av pneumokokk kolonisering.

Abstract

Overholdelse av Streptococcus pneumoniae (pneumococcus den) til epiteliale slimhinnen i nasopharynx kan resultere i koloniseringen, og er ansett som en forutsetning for pneumokokkinfeksjoner som lungebetennelse og otitis media. In vitro tilslutning assays kan anvendes for å studere festingen av pneumokokker til epitel celle monolag, og for å undersøke mulige intervensjoner, slik som bruk av probiotika, for å inhibere pneumokokk-kolonisering. Den protokoll som er beskrevet her, brukes for å undersøke effekten av probiotisk Streptococcus salivarius på vedheftningen av pneumokokker til human epitelial cellelinje CCL-23 (noen ganger referert til som HEp-2-celler). Analysen omfatter tre hovedtrinn: 1) Fremstilling av epitel-og bakterieceller, 2) tilsetningen av bakterier til epiteliale cellemonolagene, og 3) påvisning av vedheftende pneumokokker av levedyktige tellinger (seriell fortynning og plating) eller kvantitativ real-time PCR (qPCR ). Dette technique er relativt enkel og krever ikke spesialutstyr annet enn et oppsett vev kultur. Analysen kan brukes til å teste andre probiotiske arter og / eller potensielle hemmere av pneumokokk kolonisering og kan enkelt endres for å løse andre vitenskapelige spørsmål om pneumokokk etterlevelse og invasjon.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (den pneumococcus) er en Gram positiv bakterie som kan forårsake infeksjoner, inkludert lungebetennelse, ørebetennelse media, og hjernehinnebetennelse. Det er en viktig årsak til sykdom hos barn i lavinntektsland og ansvarlig for anslagsvis 800 000 dødsfall av barn under fem år hvert år en. Pneumokokker blir ofte utført i nasopharynx av små barn. Selv om denne kolonisering er generelt ansett asymptomatisk, forut for det pneumokokkinfeksjon, og tjener som et reservoar for bakteriene i humane populasjoner 2. Pneumokokk konjugatvaksine vaksinasjon reduserer effektivt tang av serotyper som finnes i vaksinen. Det er imidlertid mer enn 90 pneumokokk-serotyper, og vaksinering kan føre til serotype utskifting, hvorved eliminering av vaksineserotypene er etterfulgt av en økning i vognen og sykdom forårsaket av nonvaccine serotyper 3. Også i enkelte høyrisikopopulasjoner, pneumokokkkolonisering ofte oppstår svært tidlig i livet, før administrasjon av den første vaksinedosen 4,5. Nylig har anvendelse av probiotika vært foreslått som en ytterligere strategi for å inhibere pneumokokk-kolonisering 6,7. In vitro assays tilslutning er blitt brukt til å undersøke pneumokokk tilslutning 8,9. Disse analysene har blitt tilpasset for å undersøke virkningen av probiotiske Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) på pneumokokk etterlevelse 10.

I tillegg til LGG og andre melkesyrebakterier, Streptococcus salivarius, en vanlig person bosatt i munnhulen, er blitt undersøkt som en potensiell probiotisk for luftrøret på grunn av sin kolonisering potensial og evne til å hemme pneumokokker og andre respiratoriske patogener in vitro 11 - 13. Protokollen presenteres her beskriver en tilslutning test som benyttes for å undersøke effektene av S. salivarius K12 på pneumokokk etterlevelsetil human epitelial cellelinje CCL-23. Før bruk i analysen, ble pneumokokkisolatene evaluert for etterlevelse evner, som vekst og overholdelse egenskaper kan variere betydelig mellom isolatene 10,14. Vekstkurver av pneumokokker og S. salivarius ble utført for å bestemme mid-log-fase-og estimat-konsentrasjon (kolonidannende enheter eller CFU / ml) av optisk tetthet (OD, fig 1). Det anbefales å undersøke veksten av levedyktig telling og OD for hver isolere før anvendelse i analysen. Denne analysen kan utføres i ethvert laboratorium med standard vevskultur anlegg og utstyr. I denne protokollen, effekten av tre doser av S. salivarius administrert 1 time før tilsetning av pneumokokker på vedheftningen av S. pneumoniae PMP843, en serotype 19F vogn isolat avledet fra en nasofaryngeal pinne, blir undersøkt. To forskjellige måter å kvantifisere tilhenger pneumokokker presenteres: plating på blodagar å avskrekkegruven levedyktige teller, og DNA-ekstraksjon og påvisning av pneumokokk Lyta genet ved qPCR 15. Den grunnleggende tilslutning analyseprotokollen kan enkelt endres til å teste forskjellige doser eller tidspunkt for inntak av probiotika og kan også brukes med andre bakteriestammer eller arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Utarbeidelse av epithelial og bakterieceller

  1. Tining av CCL-23 epitelceller
    1. Prewarm Minimum Essential Media (MEM) inneholdende 10% kalvefosterserum (FBS) i et 37 ° C vannbad i ~ 30 min.
    2. Steril vevet kultur-godkjent biosikkerhet kabinett med UV-lys i minst 10 minutter før bruk, og tørk av arbeidsområdet med 70% etanol. Tørk den varmet media flaske med 70% etanol og sted i biosikkerhet kabinett.
    3. Ved hjelp av en 25 ml pipette, overføre 14 ml av media inn i en T-75 kolbe. Plasser kolben i 37 ° C inkubator mens cellene er tining (avsnitt 1.1.4).
    4. Ta en ampulle med CCL-23 celler fra flytende nitrogen oppbevaring bruker sikkerhetsregler og varm passende i et 37 ° C vannbad til ~ 80% tint.
    5. Returnere flasken utarbeidet i avsnitt 1.1.3 til biosikkerhet kabinett. Tørk ytre overflaten av ampulle CCL-23-celler med 70% etanol og overføre innholdet (1 ml) i T-75 Kolbe med en P1000 pipette.
    6. Inkuber i kolben på sin side i en 37 ° C, 5% CO2, 95% relativ fuktighet vevskultur-inkubator over natten (16-20 timer).
    7. Sjekk cellene under et mikroskop for å bekrefte et sunt morfologi, fjerne media, og erstatte med 15 ml frisk, forvarmet MEM + 10% FBS.
  2. Vedlikehold av CCL-23 epitelceller
    1. Når cellene er 80% konfluent ~ (1-2 dager), passasje ved å fjerne mediet ved hjelp av en 25 ml pipette og forsiktig vaske cellene to ganger med 8-10 ml forvarmet fosfatbufret saltvann (PBS) under anvendelse av en 10 ml pipette.
    2. Fjern PBS og tilsett 1 ml steril 0,25% trypsin-EDTA (0,25% (vekt / volum) trypsin, 0.1 mM EDTA). Slå kolbe på sin side roterer for å sikre trypsin dekker konfluent lag av celler og inkuber i kolben i 2-3 min i 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
    3. Returner kolbe til biosikkerhet kabinett, tilsett 9 ml forvarmet MEM + 10% FBS, og pipette opp og ned 6 -8x å resuspendere cellene, å mate ut væske ned på siden av kolben for å løsne cellene.
    4. Split-celler 01:15 (1 ml + 14 ml MEM + 10% FBS) eller 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml MEM + 10% FBS), kastes overskytende celler, og returnere kolbe til 37 ° C, 5% CO 2 inkubator.
    5. Passasje cellene minst to ganger før anvendelse i tilslutning assay. Vanligvis celler er delt hver 3-4 dager.
  3. Seeding av CCL-23 epitelceller (en dag før til etterlevelse analysen, protokoll 2)
    1. Split konfluente celler, som beskrevet i avsnittene 1.2.1-1.2.3, resuspendere i forvarmet MEM + 5% FBS (FBS konsentrasjon senkes for å redusere sannsynligheten av serumkomponenter interfererende i analysen). Fjern 20 ul av celler og telle ved hjelp av trypan blå farging og et hemocytometer.
    2. Fortynn cellene i forvarmet MEM + 5% FBS i en konsentrasjon på 1,5 x 10 5 celler / ml i et sterilt 50 ml rør.
    3. Seed 1 ml av celler / brønn i en vev-Kultur behandlet 24-brønns plate.
  4. Fremstilling av bakterie
    Denne prosedyren kan følges for utarbeidelse av pneumokokker og S. salivarius. Bakterievekst medier er typisk holdt i en 37 ° C inkubator over natten for å prewarm og teste for sterilitet (generelt vises regn hvis brukt).
    1. To dager før til etterlevelse analyse, strek bakterier på hesteblod agar (HBA) plater og inkuberes ved 35-37 ° C og 5% CO 2 for 18-24 hr. Saueblodagar kan brukes som et alternativ.
    2. Dagen etter, forberede en overnatting kultur for hver bakteriearter ved å pipettere 10 ml Todd-Hewitt buljong med 0,5% gjærekstrakt (THB + YE) medium i en steril 30 ml tube. Ved hjelp av en 10 mL sløyfe, vaksinere ca 10-12 godt atskilt kolonier. Kort vortex og inkuberes ved 35-37 ° C og 5% CO2 i 14-16 timer. Merk at pneumokokker vil autolyze hvis igjen for lenge i buljongkultur.

    2 Overholdelse analysen:. Tilsetting av bakterier for å epitelcelle Monolag

    1. Utarbeidelse av mid-log bakteriekulturer av pneumokokker og S. salivarius
      1. Pipetter 10 ml forvarmet THB + ut i hver av to sterile 30 ml rør, en merket pneumokokker og den andre S. salivarius.
      2. For å nå mid-log fase, pneumokokker krever ~ 3 timer og S. salivarius krever ~ 2 timers inkubering (se figur 1). Begynn begge kulturer samtidig. Vortex (3-5 sek) overnattingsbakteriekulturer og tilsett 100 mL pneumokokker og 100 mL S. salivarius inn tilsvarende rør.
      3. Kort vortex og inkubere kulturene ved 37 ° C i omtrent 2 timer for S. salivarius og tre timer for pneumokokker.
    2. Utarbeidelse av CCL-23 celler for etterlevelse assay
      1. Ved hjelp av en invertert mikroskop, sjekk den 24-brønns plate for confluent monolayers med sunn celle morfologi. Monolag bør være> 80% konfluent, uten tegn på celle klumper eller cytopatiske virkninger slik som celleavrunding eller tap av vedheft (se figur 2).
      2. Fjern materialet i hver brønn med en overføring pipette, vippe platen litt for å unngå å forstyrre cellemonolag.
      3. Å forsiktig vaske cellene, legge ~ 500 mL forvarmet PBS i hver brønn ved hjelp av en serologisk pipette og fjern den med en overføring pipette, vippe platen litt. Kast PBS. Gjenta vasketrinn én gang.
      4. Legg 500 mL av prewarmed MEM + 5% FBS i hver brønn. Returner 24-brønns plate til CO 2 inkubator ved utarbeidelsen av bakteriekulturer.
        Merk: For å fastslå den eksakte CCL-23 celle nummer for mangfold av infeksjon (MOI), kan to brønner bli trypsinisert og telles på dagen for smitte.

    Tre. Etterlevelse Assay

    1. Legg pneumokokker tilCCL-23 celler på en MOI ~ 10:01. Test forholdene som er nevnt i tabell 1 i duplikatbrønner.
      1. Måle den optiske tetthet ved 600 A (OD) av 1 ml av S. salivarius kultur. OD skal være mellom 0,3-0,6.
      2. Overfør 5 ml av S. salivarius kultur i et 10 ml rør og sentrifuger ved 1870 xg i 4 min.
      3. Kast supernatanten og basert på OD lesing i pkt. 3.1.1, resuspender S. salivarius på 200-1000 pl av 0,85% NaCl (sluttkonsentrasjon 1,5 x 10 ~ 9 CFU / ml). Som en generell retningslinje, vil en OD på 0.375 resuspenderes i 260 mL. Forbered 1:10 og 1:100 fortynninger av S. salivarius hjelp 0,85% NaCl.
        Merk: I alt tre konsentrasjoner (som representerer høy, middels og lave doser) av S. salivarius vil bli testet i analysen. Den høye dose er et forhold på 10 ~ S. salivarius: 1 pneumokokker, er mediet ~ 1 S. salivarius: 1 pneumokokker, og den lave er ~ 1 S. salivarius: 10 pneumokokker.
      4. Ta ut en 24-brønn plate fra inkubatoren.
      5. Fra heparin kontrollbrønnene, fjerner 40 mL av mediet og tilsett 50 pl av heparin (1000 U / ml stock konsentrasjon) til en sluttkonsentrasjon på 100 U / ml.
      6. Tilsett 10 ul av 0,85% NaCl til brønner inneholdende CCL-23-celler bare og brønner inneholdende CCL-23 celler og pneumokokker (ingen S. salivarius).
      7. Tilsett 10 pl av ufortynnet, 1:10 og 1:100 av S. salivarius til respektive brønner.
        Merk: S. salivarius kan også tilsettes på samme tid som pneumokokker (coaddition) eller 1 time etter at pneumokokker (ettertilsetning) for å undersøke effekten av tiden av probiotiske administrering.
      8. Sentrifuger i 24-brønns plate ved 114 x g i 3 minutter for å fremme bakteriell kontakt med cellelaget og inkuberes i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2.
      9. Utfør serie fortynning av S. salivarius lager i 0,85% NaCl og plate på duplikat HBAplater for levedyktige teller. Først, tilsett 50 pl av lager til 450 pl av 0,85% NaCl for å gjøre en 10 -1 fortynning, og deretter puls vortex (5 s), endre tips, og tilsett 50 pl av 10 -1 fortynning til 450 pl av 0,85% NaCl for å gjøre en 10 -2 fortynning og så videre opp til 10 -7.
      10. Plate 100 mL av 10 -5, 10 -6, og 10 -7 fortynninger i duplikat på HBA plater og spres med en steril sprederen. Inkuber HBA plater invertert over natten ved 37 ° C, 5% CO 2.
      11. Mot slutten av 1 time inkubering, gjentar seksjoner 3.1.1-3.1.3 for pneumokokker. ODS bør være mellom 0,2 til 0,7. Spinn ned 1 ml av pneumokokk kultur og resuspender pelleten i 300-2,000 ul av 0,85% NaCl (basert på OD-verdien) til en konsentrasjon på 1,5 x 10 ~ 8 CFU / ml. Som en generell retningslinje, vil en OD på 0,3 blir resuspendert i 500 pl.
      12. Etter 1 time inkubering med S. salivarius, legger 10 μ, L ufortynnet pneumokokker til alle brønner bortsett fra negative kontrollbrønner som inneholder celler (bare).
      13. Sentrifuger i 24-brønns plate ved 114 x g i 3 minutter, og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 timer. Utfør serie fortynning av pneumokokker lager i 0,85% NaCl som beskrevet i pkt. 3.1.9 og plate fortynninger 10 -4, 10 -5, og 10 -6 på dupliserte HBA plater for levedyktige teller.
    2. Etter 3 timer, kontrollere cellene under et mikroskop for å sikre at monolagene ser sunne (se figur 2). Fjern materialet fra hver brønn og forsiktig vaske cellene 3x som beskrevet i kapittel 2.2.3. ved hjelp av en annen pipette for hver tilstand. Dette trinnet er viktig å fjerne ikke-festede pneumokokker. De monolagene bør ikke falle fra hverandre i løpet av vaskeprosessen; Dette kan bekreftes ved å kontrollere igjen under et mikroskop.

    Merk: Media fjernet i dette trinnet kan bli lagret ved -20 ° C for ytterligere analyser (<em> f.eks måling av cytokin nivåer).

    1. Tilsett 200 ul av 0,1% digitonin (en mild såpe) til hver brønn og inkuber i 7 minutter ved 37 ° C, 5% CO2.
    2. Til 800 mL av THB materiale til hver brønn. Lyses celler ved pipettering opp og ned, og, om nødvendig, skrape brønner 3-4x med pipettespissen å sørge for at cellemonolag er helt fjernet. Endre tips mellom brønnene.
    3. Ta ut innholdet av hver brønn med en P1000 pipette og overfør til merket mikrofugerør.

    4. Kvantifisering av Heft pneumokokker

    Tilhenger pneumokokker kan kvantifiseres ved å bestemme levedyktige tellinger (seriell fortynning og platekledning på blodagar) eller ved kvantitativ real-time PCR.

    1. Levedyktig metode for å telle
      Denne fremgangsmåte må utføres umiddelbart etter trinn 3.5 i tilslutning assay.
      1. For hver analyse godt, forberede serielle fortynninger av prøver samlet inn itrinn 3.5 i tilslutning assay ved å tilsette 50 pl av prøvene til 450 pl av 0,85% NaCl, pulsvortexblanding, og å seriefortynne som beskrevet i seksjon 3.1.9 opp til 10 -6 fortynning.
      2. Plate 100 pl av den 10 -3, 10 -4, 10 -5, samt 10 -6 fortynningene i duplikat på blodagar, spredt med en steril spreder, og inkuber inverterte platene over natten ved 37 ° C, 5% CO2. Legg merke til at brønner inneholdende CCL-23-celler alene ikke bør inneholde noen bakterier og kan være belagt pen (100 pl ufortynnet) som en steril kontroll.
      3. Dagen etter, bestemme pneumokokk inokulater ved å telle koloniene på de passende fortynning plater (som inneholder 30-300 kolonier) utarbeidet i avsnitt 3.1.13 av etterlevelse analysen. Beregn CFU / ml av inokula ved hjelp av den gjennomsnittlige verdi fra to plater. Likeledes bestemmer S. salivarius inokula ved å telle de kolonier på platene fremstilti avsnitt 3.1.10.
        Merk: Plater bør inneholde pneumokokker bare; tilstedeværelse av andre arter viser at analysen var forurenset, og resultatene er ugyldig.
      4. For å bestemme pneumokokk etterlevelse nivåer, telle riktig fortynningsplate (som inneholder 30-300 pneumokokk kolonier) for hver prøve utarbeidet i avsnitt 4.1.1. Merk at S. salivarius kolonier vil være små og hvitt, mens pneumokokker vil være flat og grønnaktig på grunn av α-hemolyse, som vist i figur 3.. For å beregne pneumokokk tilslutning, normalisere antallet vedheftende pneumokokker fra betingelsen b. CCL-23 celler + pneumokokker til 100%, og sammenligne tilhenger pneumokokker fra andre forhold til denne tilstanden.
    2. qPCR metode
      Prøver samlet inn i Overholdelse analysen steg 3,5 kan oppbevares ved -20 ° C til DNA-ekstraksjon. DNA-ekstraksjon utføres ved hjelp av et kommersielt kit og beskrevet i pkt. 4.2.1-4.2.9 og qPCR somsier i § § 4.2.10-4.2.20.
      1. Forbered Enzymatisk Lysis-buffer (50 mM fosfatbuffer pH 6,7 inneholdende 1 mg / ml lysozym, 0.075 mg / ml mutanolysin, og 2 mg / ml proteinase K). Den følgende oppskrift kan brukes lage 10 ml (nok for 50 ekstraksjon). Enzymatisk lysis buffer bør være tilberedes før bruk.

        7,25 ml 50 mM fosfatbuffer (pH 6,7)
        1,00 ml av 10 mg / ml lysozym-lager for en avsluttende [1 mg / ml]
        0,75 ml av 1 mg / ml mutanolysin lager for en endelig [0.075 mg / ml]
        1,00 ml av 20 mg / ml Proteinase K lager for en endelig [2 mg / ml]
      2. Tine prøvene på is eller ved 4 ° C. Vortex og overfør 100 pl aliquoter av hver prøve til merket mikrofugerør. Retur opprinnelige prøvene tilbake til -20 ° C fryser.
      3. Sentrifuger prøvene ved 6700 xg i 10 min.
      4. Fjern og kast supernatanten. Tilsett 200 ul av enzymatisk lysis buffer til pelleten og vortex å resuspendere. Incubspiste prøvene ved 56 ° C i 30 min. Sentrifuger kort (5 sek) ved 6700 xg til å samle væske i bunnen av røret.
      5. Tilsett 10 ul 20% SDS for å fullføre cellelyse, og bland forsiktig ved romtemperatur i 2 min.
      6. Tilsett 4 mL av RNase A (100 mg / ml stock), og bland forsiktig (på en vippe, eller ved å snu rørene) ved romtemperatur i 2 min.
      7. Tilsett 200 mL buffer AL (fra kit) og vortex i 15 sek. Inkuber prøvene ved 70 ° C i 10 min. Sentrifuger kort (5 sek) ved 6700 xg til å samle væske i bunnen av røret.
      8. Tilsett 200 ul av 100% EtOH og virvle i 15 sek. Spin lett for å samle væsken på bunnen av røret, og deretter overføre blandingen (inkludert eventuelle bunnfall) til spinnkolonne (i en 2 ml samling rør) uten fukting felgen. Følg vasketrinn i henhold til produsentens protokoll (ikke vist her).
      9. For å eluere DNA, overfører en kolonne til en merket mikrosentrifugerør, tilsett 50 pl Buffer AE (frOM kit) og inkuber ved romtemperatur i 2 min. Sentrifuger ved 4300 xg i 1 min. Gjenta en gang for en endelig eluering volum på 100 pl. DNA kan bli lagret ved -20 ° C inntil bruk.
      10. For å utføre qPCR, sterilisere hetter med UV-lys i 15 min før start. Forbereder en 96-brønns plate kartet regneark til å registrere brønnlokasjoner for hver prøve er anbefalt.
      11. Forbered standardkurve ved hjelp av en 10 ng / mL lager av genomisk pneumokokk DNA (hentet fra referanse stamme ATCC 6305).
        1. Tine pneumokokk lager DNA og spinne ned en kort stund (5 sek) i en tabletop sentrifuge.
        2. Utfør 01:10 seriefortynning i seks prelabeled mikrofugerør ved å legge 3 pl DNA til 27 mL nukleasefritt H 2 O, skiftende tips og virvling mellom hver fortynning. Den endelige fortynning serie består av seks rør: 1, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 og 0,00001 ng / mL.
          Merk: De kan lagres ved 4 ° C i opp til en uke.
      12. Prepare Lyta Mastermix som følger i et sterilt 15 ml konisk rør i en steril hette PCR. Tin komponenter på is og vortex umiddelbart før bruk. et al.15 og vises i listen over materialer.
      13. Vortex og last 23 mL / godt av Lyta bland inn de aktuelle brønnene. Referer til plate kartet.
      14. Transport plate til mal tillegg Området (fortrinnsvis en steril skap i et annet rom) for prøve lasting.
      15. Bruk en P2 pipette å laste prøver, endrer tips for hver brønn. Alle prøver blir kjørt i duplikat. Referer til plate kartet for plassering.
      16. For standardkurven brønner, tilsett 1 pl / brønn av den passende fortynning av standard kurve DNA pluss 1 mL / brønn H 2 O for å bringe det endelige volumet til 25 mL.For ingen mal kontrollbrønner, tilsett 2 mL H 2 O.
      17. Tilsett 2 pl / brønn av prøve-DNA inn i passende brønner.
      18. Cap alle brønnene i bruk. Pass på at caps er stengt tett. Raskt snurr PCR-platen (5 sek) før du legger platen inn i en real-time PCR maskin.
      19. Lasteplaten inn PCR maskin og kjøre qPCR i henhold til instruksjonene fra maskinprodusenten. Følgende hydrolyse probe sykkelforholdene anbefales:
        20. komponent per reaksjon x 102 (full plate)
        Lyta F 0,25 mL av 10 mikrometer lager 25,5 mL
        Lyta R 0,25 mL av 10 mikrometer lager 25,5 mL
        Lyta probe 0,5 pl av 10 mM lager 51 mL
        H 2 O 9,5 mL 969 mL
        Master mix 12,5 mL 1275 mL
        Endelig volum 23 mL 2346 mL
        Trinn 1 (1x): 3 min ved 95 ° C
        Trinn 2 (40x): 20 sek ved 95 ° C
        20 sek ved 60 ° C
      20. Samle data og kvantifisere pneumokokk DNA ved hjelp av standardkurven. Bakterielle belastninger er beregnet som tidligere beskrevet 17 og et estimat for at 1 pg av genomisk DNA er ekvivalent med 447,4 celler, og rapportert som CFU / ml (forutsatt at one genom per CFU, og ett eksemplar av Lyta per genom; se figur 4). For en vellykket test, bør verdien R 2 være ≥ 0,98 og alle positive resultater innen området av standardkurven (Ct-verdier lavere enn den som oppnås for 0,00001 ng / mL standardkurve punktet anses bakgrunn / Lyta negative).
        Merk: Noen real-time PCR-systemer kommer med analyse programvare som kan brukes til å konstruere standardkurver og beregne ukjente. Ellers kan disse beregningene bli utført i Excel eller tilsvarende programmer. Et eksempel standardkurve er vist i figur 4..
      21. For å beregne pneumokokk tilslutning, normalisere antall tilhenger pneumokokker fra tilstand b. CCL-23 celler + pneumokokker til 100%, og sammenligne tilhenger pneumokokker fra andre forhold til denne tilstanden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultatene fra et representativt eksperiment hvor pneumokokker (S. pneumoniae PMP843, en kolon 19F isolat) ble tilsatt til CCL-23 cellene i 1 time etter at tilsetningen av S. salivarius, og pneumococcal tilslutning ble kvantifisert ved både levedyktig telling og Lyta qPCR er vist i tabell 2.. Resultatene var i overensstemmelse mellom de to metodene for både den absolutte antall bakterier (presentert som CFU / ml), og% tilslutning, normalisert til antallet av vedheftende pneumokokker i brønnene inneholdende pneumokokker alene. Heparin blir brukt som en kontroll som det er kjent for å hemme pneumokokk tilslutning og dermed den reduserte tilslutning i pneumokokker + heparin tilstand (typisk <40% sammenlignet med pneumokokker alene) er en indikasjon på en vellykket test. S. salivarius hemmer pneumokokk tilslutning på en doseavhengig måte, slik det er vist i tabell 2, der den høye konsentrasjonen av S. salivarius (omtrentligly 10 S. salivarius: 1 pneumokokker) resulterte i den laveste pneumokokk tilslutning.

Figur 5 viser tilslutningen av pneumokokker til CCL-23 cellene når S. salivarius tilsettes en time før pneumokokker (preaddition), samtidig (coaddition), eller en time etter pneumokokker (post-tillegg). S. salivarius er mer effektiv ved å hemme pneumokokk tilslutning da lagt før pneumokokker, som både høy og middels doser av S. salivarius redusert betydelig pneumokokk tilslutning i preaddition analysen (figur 5A), mens bare den høye dose av S. salivarius hemmet pneumokokk tilslutning i coaddition og post-tillegg analyser (Tall 5B og 5C).

Resultatene vist i tabell 2 og figurene 4 og 5 data ble oppnådd ved bruk av en tidligere versjon av Lyta qPCR primere og sondere 17. Den nåværende protokollen beskriver den oppdaterte qPCR analysen.

Figur 1
Figur 1. Representative vekstkurver av S. pneumoniae PMP843 (A) og S. salivarius K12 (B). For hver art, CFU / ml som bestemmes av levedyktig telling er vist i svart (venstre y-aksen), og optisk tetthet (OD) på 600 nm er vist i grått (høyre y-aksen). Mid-log fase ble anslått av levedyktig telling å være tre timer for S. pneumoniae PMP843 og to timer for S. salivarius K12. Klikk her for å se større bilde .

fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51069/51069fig2.jpg "width =" 500px "/>
Figur 2. Eksempler på sunne CCL-23 celler og CCL-23 celler med cytopathic effekter (CPE). A) Eksempel på en sunn, konfluent monolayer av CCL-23 celler. B) CCL-23 celler med cytopathic effekter. Legg merke til avrunding av celler, lyse intracellulære områder, og områder av forstyrret monolag hvor cellene løftet seg opp fra platen. Bildene ble tatt ved hjelp av en invertert lysmikroskop på 200X forstørrelse. Klikk her for å se større bilde .

Figur 3
Figur 3. S. salivarius og pneumokokk kolonier på hesteblod agar. S. salivarius kolonier er små og hvite, som indikert av den hvitearrow og bokstaven A. Pneumokokk (S. pneumoniae) kolonier er vanligvis større, flatere, og grønnaktig i fargen, som indikert av den hvite pilen og brev B. Klikk her for å se større bilde .

Figur 4
Figur 4. Eksempel S. pneumoniae standardkurve for qPCR. genomisk DNA Beregningene er vist sammen med Ct verdier (* gjennomsnitt av dupliserte standardkurve brønner fra en representant qPCR assay), med den resulterende standardkurve, ligninger og R 2 verdien som vises på grafen. Klikk her for å se større bilde .

Figur 5 content-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" width = "600" />
Figur 5. Effekt av S. salivarius på pneumokokk tilslutning til CCL-23 celler Pneumokokk tilslutning til CCL-23 cellemonolagene når cellene ble inkubert med pneumokokker alene. (PNC; normalisert til 100%), med pneumokokker og 100 U / ml heparin (heparin), eller med pneumokokker og S. salivarius tilsatt i en mengde på ~ 10: S. salivarius: 1 pneumokokker (høy), ~ 1 S. salivarius: 1 pneumokokker (medium), eller ~ 1 S. salivarius:. 10 pneumokokker (lav) S. salivarius ble tilsatt 1 time før (A), samtidig som (B), eller i 1 time etter at pneumokokker (C). n ≥ 3, * indikerer P <0,05 sammenlignet med pneumokokker alene (Student t-test). Klikk her for å se større bilde .

"Fo: keep-together.within-page =" always ">

Gruppe Analyse tilstand Merknader
A CCL-23 celler alene
B CCL-23 celler + pneumokokker
C CCL-23 celler + pneumokokker + heparin Heparin blokker pneumokokk tilslutning til celleoverflaten glycosylaminoglycans 16 og blir brukt som en styre
D CCL-23 celler + pneumokokker + S. salivarius [høy] Omtrent en pneumococcus: 10 S. salivarius
E CCL-23 celler + pneumokokker + S. salivarius [Med] Omtrent en pneumococcus: 1 S. salivarius
F CCL-23 celler + pneumokokker + S. salivarius [lav] Omtrent 10 pneumococcus: 1 S. salivarius


Tabell 1. Betingelser testet i pneumokokk tilslutning analysen. De seks grunnleggende analyseforhold er beskrevet her.

6
Analyse tilstand * CFU / ml Pnc (qPCR) % Tilslutning (qPCR) CFU / ml Pnc (levedyktig teller) % Tilslutning (levedyktig teller)
PNC alene 1,1 x 10 7 100 9,1 x 10 6 100
PNC + heparin 1,5 x 10 6 14 7,6 x 10 5 8
PNC + Sal [høy] 6,1 x 10 5 6 3,2 x 10 5 4
PNC + Sal [Med] 3,6 x 10 6 33 2,7 x 10 6 29
PNC + Sal 9,8 x 10 6 92 90

Tabell 2: Pneumokokk tilslutning til CCL-23 celler etter tillegg av S. salivarius som bestemmes av Lyta qPCR og levedyktig metode for å telle * Pnc = pneumokokker.; Sal = S. salivarius; [Høy] = ca 10 Sal: 1 Pnc; [Med] = ca 1 Sal: 1 Pnc; [Lav] = ca 1 Sal: 10 Pnc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En viktig del av denne analysen er å legge de passende konsentrasjoner av S. salivarius og pneumokokker i avsnitt 3.1.7 og 3.1.12. Konsentrasjonene er beregnet ved hjelp av OD-målinger, men den nøyaktige inokulater bestemmes ikke før platene telles neste dag. Av denne grunn anbefales det å utføre vekstkurver for å måle OD og levedyktige tellinger (CFU / ml) over tid for alle bakteriestammer som benyttes i analysen, for å identifisere den mid-log-fase og hjelpe til med å estimere konsentrasjonen av OD. I tillegg kan pneumokokkstammer er vesentlig forskjellig i deres overholdelse egenskaper. Stammer med god etterlevelse (> 10% av inokulater holde epitelceller etter en tre timers inkubasjon) anbefales for analyser som undersøker muligheten av probiotika for å hemme pneumokokk tilslutning. Selv når utført av en erfaren operatør, kan etterlevelse nivåer variere analysen til analysen, noe som gjenspeiles av de relativt store feilfelt sett i figur 5. ForAv denne grunn anbefales et minimum på tre gjentakelser for hvert forsøk, med duplikate brønner for hver analysetilstand. Lignende variabilitet har blitt rapportert i tilslutning analyser ved hjelp Escherichia coli 18. I denne protokoll, blir cellene inkubert i 3 timer etter tilsetning av pneumokokker. Inkubasjonstiden kan forkortes hvis tilslutning tidsforløpet eksperimenter utføres og viser at de fleste bakteriene fester seg i løpet av den første timen med inkubasjon.

Denne protokollen presenterer to metoder for å kvantifisere pneumokokk tilslutning, qPCR og levedyktig telling. Begge metodene er egnet, og valget avhenger av førerens ønsker og tilgjengelig lab utstyr (f.eks tilgang til en real-time PCR maskin). Kvantifisering av levedyktig telling er en rimelig metode som ikke krever ekstra reagenser eller en real-time PCR maskin. Men, bruker den mange plater (typisk 80 plater for en 12-godt-analyse) og må utføres umiddelbartly ved slutten av forsøket, og telle pneumokokk kolonier kan være vanskelig på plater som inneholder en stor mengde av S. salivarius. Kvantifisering av qPCR er mer kostbart og krever en lengre DNA-ekstraksjon trinn, men prøver kan bli lagret i frossen tilstand og behandles i grupper, og øker effektiviteten. Det ekstraherte DNA kan også benyttes til andre formål, for eksempel qPCR påvisning av vedheftende S. salivarius. Hvis etterforsker S. salivarius tilslutning, er det anbefalt å inkludere brønner med CCL-23 celler pluss S. salivarius (uten pneumokokker) og brønner med CCL-23 celler pluss S. salivarius og heparin som ekstra kontroller.

Den grunnleggende analysen kan også tilpasses til å undersøke andre vitenskapelige aspekter av kolonisering. For eksempel kan effekten av probiotika for cytokin produksjon vurderes ved lagring og analysering av celle-supernatanter. Målingen kan også bli modifisert for å undersøke bakteriell invasjon i stedet for tilslutning avruger celler med cellemembran ugjennomtrengelige antibiotika for å drepe ekstracellulære bakterier før høsting og Lysing celler. Som beskrevet her, gjør analysen ikke skille mellom tilhenger og invasiv (internalisert) pneumokokker. Men, har tidligere studier funnet nivåer av internalisert pneumokokker å være svært liten (typisk ≤ 0,01% av inokulater) 10 så for de fleste isolater (inkludert PMP843), det store flertallet av celle-assosiert pneumokokker er tilhenger snarere enn internalisert. Andre anvendelser inkluderer å teste andre probiotiske arter for evnen til å inhibere kolonialisering, og / eller å se på mutante bakteriestammer for å undersøke rollen til spesifikke gener som er av interesse.

En åpenbar begrensning av denne in vitro-analysen er at den ikke inneholder et etablert epitel, immunceller, normale flora, eller andre faktorer som sannsynligvis påvirker pneumokokk kolonisering in vivo. For å fullt ut vurdere om probiotika could være nyttig for å hindre patogen kolonisering i luftveiene, i in vivo-undersøkelser ved hjelp av dyremodeller og kliniske studier er garantert. Likevel in vitro assays tilslutning tjener som en nyttig skjerm for identifisering av probiotika med potensiale for å inhibere pneumokokk tilslutning og kan gi informasjon om preferansedoseringsstrategier, samt gi en eksperimentell modell som kan brukes for mekanistiske undersøkelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler fra Murdoch Childrens Research Institute og den viktorianske regjeringens Operasjonell Infrastruktur Support Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

Tags

Immunologi Gram-positive bakterielle infeksjoner lungebetennelse bakterielle lungesykdommer luftveisinfeksjoner, Etterlevelse kolonisering probiotika,
Gransker effekten av Probiotika på Pneumokokk Colonization Bruke en<em&gt; In Vitro</em&gt; Overholdelse analysen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter