Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

In vitro yapışma deneyleri, hücre mono tabakaları epitel ve bu pnömokokkal kolonizasyonu inhibe etmek için probiyotiklerin kullanımı potansiyel müdahaleler araştırmak için Streptococcus pneumoniae eki incelemek için kullanılabilir.

Abstract

Nazofarenks epitel astar Streptococcus pneumoniae (pnömokok) yapışması kolonizasyonu neden olabilir ve. In vitro deneyler, hücre yapışma epitel pnömokokkinin eki incelemek için kullanılabilir zatürre ve orta kulak iltihabı gibi pnömokok kökenli enfeksiyonları için bir ön koşul olarak kabul edilir ve mono tabakaları, bu tür probiyotiklerin kullanımı potansiyel müdahaleler, araştırmak pnömokokkal kolonizasyonu inhibe. Burada açıklanan protokol (bazen HEp-2 hücreleri olarak da adlandırılır), insan epitel hücre hattı CCL-23, pnömokokkinin yapışması üzerinde, probiyotik Streptococcus salivarius etkilerini incelemek için kullanılır. Deney üç ana adımdan oluşur: epitel ve bakteri hücrelerinin 1) hazırlanması, hücre mono tabakaları epitel bakteri 2) ilavesi ve canlı sayısı (seri seyreltme ve kaplama) ya da kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR yapışık pnömokokkinin 3) tespiti .) Bu technique nispeten basittir ve bir doku kültürü kurulum dışındaki özel ekipman gerektirmez. Deney, diğer probiyotik türler ve / veya kolonizasyon pnömokok potansiyel inhibitörlerini test etmek için kullanılabilir ve kolayca pnömokok yapışma ve yayılım ile ilgili diğer bilimsel soruları için modifiye edilebilir.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pnömokok) pnömoni, otitis media ve menenjit gibi enfeksiyonlara neden olabilen bir Gram pozitif bir bakteridir. Düşük gelirli ülkelerdeki çocukların ve yıllık 1 beş yaşın altındaki çocukların yaklaşık 800.000 kişinin ölümünden sorumlu hastalığın önemli bir nedenidir. Pnömokok sıklıkla genç çocukların nazofarenks yapılmaktadır. Bu kolonileşme genellikle asemptomatik kabul edilir olsa da, bu pnömokok kökenli enfeksiyon takip eder ve insan popülasyonlarında 2'deki bakteriler için bir rezervuar olarak hizmet vermektedir. Pnömokok kökenli konjügat aşısı etkili aşı içinde bulunan serotiplerin taşıma azaltır. Ancak, 90 pnömokok serotipleri üzerinde olan ve aşı serotiplerinin ortadan kaldırılması nonvaccine serotip 3 kaynaklanan taşıyıcı ve hastalık bir artış takip etmektedir, burada serotip değiştirilmesi, yol açabilir. Ayrıca, bazı yüksek riskli popülasyonlarda, pnömokokkolonizasyon genellikle önce ilk aşı dozu 4,5 tatbikatından, çok erken yaşta ortaya çıkar. Son zamanlarda, probiyotiklerin kullanımı pnömokok kolonizasyon 6,7 inhibe etmek için ilave bir strateji olarak teklif edilmiştir. In vitro deneyler, yapışma pnömokokkal yapışmayı 8,9 incelemek için kullanılmıştır. Bu deneyler pnömokok bağlılık 10 probiyotik Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) etkisini araştırmak için adapte edilmiştir.

LGG ve diğer laktik asit bakterileri ek olarak, Streptococcus salivarius, ağız boşluğu, ortak yerleşik nedeniyle potansiyeli ve in vitro 11 pnömokok ve diğer solunum yolu patojenleri inhibe etme yeteneği ile kolonizasyon için solunum yolu için potansiyel bir probiyotik olarak incelenmiştir - 13. Burada sunulan protokol S. etkilerini araştırmak için kullanılan bir bağlılık tahlili tarif Pnömokok bağlılık üzerine salivarius K12insan epitel hücre hattı CCL-23. Büyümesi ve yapışma özellikleri izolatların 10,14 arasında önemli ölçüde değişebilir olarak deneyde kullanılmadan önce, pnömokok izolatı, yapışma özellikleri için değerlendirilmiştir. Pneumococci ve S. büyüme eğrileri salivarius (OD, Şekil 1) optik yoğunluk ile orta log fazı ve tahmini konsantrasyon (koloni oluşturan birim veya CFU / ml) tespit etmek için yapılmıştır. Her deneyde kullanılmadan önce izole edilmesi için uygun bir sayısı ve OD ile büyümesini incelemek için tavsiye edilir. Bu deney, standart doku kültürü tesisleri ve ekipmanları ile herhangi bir laboratuvarda yapılabilir. Bu protokol, S. üç doz etkisi salivarius önce S. uyumda pnömokok ilavesinden 1 saat uygulanmıştır pneumoniae PMP843, bir nazofarenks sürüntü türetilmiş bir serotip 19F taşıma izole incelenmiştir. Yapışık pnömokok ölçmek için iki farklı yol sunulmuştur: caydırmak için kan agar üzerine kaplamamaden canlı sayımları ve DNA ekstraksiyon ve qPCR 15 tarafından pnömokok lytA geninin tespiti. Temel yapışma tahlili protokolü kolay farklı dozlarda ve probiyotik tatbikat süresi test etmek için modifiye edilebilir ve aynı zamanda, diğer bakteri türleri ya da türleri ile kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Epitel hazırlanması ve bakteriyel hücreler

  1. CCL-23 epitel hücrelerinin Çözülme
    1. ~ 30 dakika için bir 37 ° C su banyosu içinde% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ihtiva eden ön ısıtılması Minimum Essential Media (MEM).
    2. Kullanmadan önce en az 10 dakika boyunca UV ışığı ile doku kültürü onaylı biyogüvenlik kabini sterilize ve% 70 etanol ile çalışma alanını silin. Biyogüvenlik kabini içinde% 70 etanol ve yer ile ısındı medya şişe silin.
    3. 25 ml'lik bir pipet kullanarak, bir T-75 balon içine ortam 14 ml aktarın. Hücreleri (bölüm 1.1.4) buzunu iken 37 ° C inkübatör şişesi yerleştirin.
    4. ~% 80 çözülmüş kadar bir 37 ° C su banyosu içinde uygun güvenlik önlemleri ve sıcak kullanılarak sıvı azot depolama CCL-23 hücreleri bir şişe çıkarın.
    5. Biyogüvenlik kabine bölümünde 1.1.3 hazırlanan şişeyi döndürür. T içine,% 70 etanol ve transfer içeriği (1 mi) ile CCL-23 hücrelerinin şişenin dış yüzeyi silinP1000 bir pipet kullanarak şişeye -75.
    6. 37 ° C,% 5 CO2,% 95 nispi nem doku kültürü kuluçka makinesi gece boyunca (16-20 saat) kendi tarafında şişe inkübe edin.
    7. Sağlıklı bir morfoloji onaylamak için bir mikroskop altında hücrelerin kontrol, medya kaldırmak ve taze 15 ml ile değiştirin, MEM +% 10 FBS prewarmed.
  2. CCL-23 epitel hücrelerinin bakımı
    1. Hücreler ~% 80 konfluent (1-2 gün), 25 ml bir pipet kullanılarak ortam kaldırılması ve hafifçe 8-10 arası hücreleri iki kez yıkama ile geçit kez mi, 10 ml bir pipet kullanarak, önceden ısıtılmış, fosfat tamponlu tuzlu su (PBS).
    2. PBS çıkarın ve steril% 0.25 tripsin-EDTA 1 ml (% 0.25 (a / h) tripsin, 0.1 mM EDTA) ekleyin. Yan balon açın, tripsin hücrelerinin konfluent katmanı kapsar garanti eder ve 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde, 2-3 dakika boyunca bir balon içinde inkübe döndürün.
    3. Biyogüvenlik kabine şişeyi dön eklemek, 9 ml yukarı ve aşağı 6 MEM +% 10 FBS ve pipet prewarmed -8x hücreleri çıkarmak için şişenin tarafında aşağı sıvının çıkarılması, hücreler tekrar süspansiyon.
    4. Bölünmüş hücreler, 1:15 (1 ml + 14 ml MEM +% 10 FBS) veya 01:30 (0.5 ml + 14.5 ml MEM +% 10 FBS), aşırı hücreleri atmak ve 37 ° C,% 5 CO için şişeyi geri 2 inkübatör.
    5. Geçiş, en azından iki kat yapışma deneyde kullanmadan önce hücreler. Genellikle hücreler 3-4 gün her bölünür.
  3. CCL-23 epitel hücrelerinin Tohum (bir gün önce deney, Protokolü 2 yapışma için)
    1. Önceden ısıtılmış MEM içinde tekrar askıda bırakılması, 1.2.1-1.2.3 bölümlerinde tarif edildiği gibi birleşik hücreler bölünmüş +% 5 FBS (FBS konsantrasyonu, deneyde müdahale serum bileşenlerinin olasılığını azaltmak için indirilir). Hücrelerin 20 ul çıkarın ve tripan mavi boyama ve Hemasitometre kullanarak saymak.
    2. Bir steril 50 ml tüp içinde 1.5 x 10 5 hücre / ml 'lik bir konsantrasyona kadar önceden ısıtılmış MEM +% 5 FBS içinde hücreleri seyreltin.
    3. Tohum 1 hücreleri ml / oyuk bir dokudaKültür 24 oyuklu plaka işlemden geçirildi.
  4. Bakterilerin hazırlanması
    Bu prosedür, pneumococci ve S. hazırlanması için takip edilebilir salivarius. Bakteriyel büyüme ortamı tipik (kirlenmiş ise genellikle bulanık görünür) Prewarm ve kısırlık testi için bir gecede 37 ° C inkübatör tutulur.
    1. At kanı agar (HBA) plakalar üzerinde deney, çizgi bakteri bağlılığın ve 35-37 ° C ve 18-24 saat süreyle% 5 CO 2 inkübe öncesinde iki gün. Koyun kan agar bir alternatif olarak kullanılabilir.
    2. Ertesi gün, steril bir 30 ml tüp içine% 0.5 maya ekstraktı (THB + YE) ortam ile 10 ml Todd-Hewitt Broth pipetle her bir bakteri türlerinin bir gecelik kültürü için hazırlar. 10 ul döngü kullanarak, yaklaşık 10-12 iyi ayrılmış koloniler aşılamak. Kısaca vorteks ve 35-37 ° C ve 14-16 saat süreyle% 5 CO 2 inkübe. Çorba kültürü çok uzun bırakılırsa pnömokokki autolyze unutmayın.

    2. Yapışma Deneyi:. Epitel hücre mono tabakaları için Bakteri ilavesi

    1. Pneumococci ve S. orta log bakteri kültürlerinin hazırlanması salivarius
      1. Pipet, iki steril 30 ml tüpler, tek etiketli pneumococci ve diğer S. her birine önceden ısıtılmış THB + YE 10 mi salivarius.
      2. Orta-log fazı ulaşmak için pneumococci'ye ~ 3 saat ve S. gerektirir salivarius (bkz. Şekil 1) ~ 2 saat inkübasyon gerektirir. Aynı anda hem kültürleri başlayın. Vortex (3-5 sn) gece bakteri kültürleri ve eklemek 100 ul pnömokokki ve 100 ul S. karşılık gelen tüpler içine salivarius.
      3. Kısaca girdap S. ve yaklaşık 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe kültürleri salivarius ve pnömokoklar için 3 saat.
    2. Yapışma deneyi için CCL-23 hücrelerinin hazırlanması
      1. Içbükey bir mikroskop kullanarak, confluen için 24 oyuklu plaka kontrolsağlıklı hücre morfolojisi ile t tekkatmanları. Monokatmanlar hücre topaklanma veya bu bağlılığın hücre yuvarlanması veya zarar (bkz. Şekil 2) gibi sitopatik etkileri kanıt olmaksızın,>% 80 birleşmiş olmalıdır.
      2. Her bir hücre tek tabaka rahatsız etmemek için hafifçe eğerek plaka, bir transfer pipeti kullanarak Ortamı çıkarın.
      3. Nazikçe, hücreleri yıkayın her iyi bir serolojik pipet kullanarak içine ~ 500 ul önceden ısıtılmış PBS ekleyin ve hafifçe eğerek plaka, bir transfer pipet ile çıkarın. PBS atın. Bir kez yıkama işlemi tekrarlayın.
      4. Her kuyuya, önceden ısıtılmış MEM +% 5 FBS 500 ul ekleyin. Bakteri kültürlerinin hazırlarken CO2 inkübatör 24 oyuklu plaka döndürür.
        Not: enfeksiyon (MOI) çokluğu için kesin CCL-23 hücre sayısını belirlemek için, iki kuyu tripsinize edilmiş ve enfeksiyon gününde sayılabilir.

    3.. Yapışma Deneyi

    1. Pnömokokkinin eklemebir MOI ~ 10:1 CCL-23 hücreleri. Çift kaynaklar içerisinde, Tablo 1 'de listelenen koşullar test edin.
      1. S. 1 ml'lik bir 600 (OD) de optik yoğunluğu ölçmek salivarius kültürü. OD 0.3-0.6 arasında olmalıdır.
      2. S. 5 ml transfer 4 dakika boyunca 1870 x g'de, 10 ml bir tüp ve santrifüj içine salivarius kültürü.
      3. Süpernatantı atın ve bölüm 3.1.1 'de OD okuma dayalı, S. tekrar süspansiyon % 0.85 NaCl (nihai konsantrasyon ~ 1.5 x 10 9 CFU / ml) içinde, 200-1,000 ul salivarius. Genel bir kural olarak, 0.375 bir OD 260 ul içinde yeniden süspanse edilecektir. S. 1:10 ve 1:100 seyreltimler hazırlayın salivarius NaCl 0.85% kullanarak.
        Not: Toplamda, S. (yüksek, orta ve düşük doz temsil eden) üç konsantrasyonları salivarius tahlilde test edilecektir. Yüksek doz, ~ 10 S. oranıdır salivarius: 1 pnömokoklar, ortam ~ 1 S. salivarius: 1 pnömokok ve düşük ~ 1 s'dir. salivarius: 10 pnömokokki.
      4. Inkübatör 24-plaka dışarı atın.
      5. Heparin kontrol kuyuları kaynaktan, ortam, 40 ul çıkarın ve 100 U / ml 'lik bir son konsantrasyon için heparin 50 ul (1.000 U / ml stok konsantrasyonu) ilave edilmektedir.
      6. CCL-23 hücreleri, sadece ve CCL-23 hücreleri ve pnömokok (no S. salivarius) içeren kuyu içeren oyuklara% 0.85 NaCl içinde 10 ul ekle.
      7. 10 sulandırılmamış ul, 01:10 ve S. 1:100 ekle ilgili oyuklara salivarius.
        Not: S. pnömokokki (post-ekleme) probiyotik tatbikat süresi etkisini incelemek sonra salivarius da pnömokok (coaddition) veya 1 saat ile aynı anda ilave edilebilir.
      8. Hücre tabakası ile temas bakteri teşvik etmek ve 37 ° C,% 5 CO2 seviyesinde 1 saat boyunca inkübasyona 3 dakika boyunca 114 x g 'de 24-yuvalı plaka santrifüjleyin.
      9. S. seri seyreltme yapın yinelenen HBA 0.85% NaCl ve plakadaki salivarius hissecanlı sayısı plakalar. İlk olarak, bir 10 -1 seyreltme için% 0.85 NaCI 450 ul stok 50 ul ekle ve sonra vorteks (5 saniye), değişim ipuçları nabız ve% 0.85 NaCl içinde 450 ul seyreltme 10 -1 50 ul ekle benzeri kadar 10 -7 10 -2 seyreltme yapmak ve.
      10. Levha 100 10 -5 ul, HBA plakaları üzerinde iki kez 10 -6, -7 ve 10 seyreltmeler ve steril bir yayıcı ile yayılan. 37 ° C,% 5 CO2, gece boyunca ters HBA inkübe edin.
      11. 1 saat inkübe edildikten sonuna doğru, pnömokoklar için bölümleri 3.1.1-3.1.3 tekrarlayın. ODS 0,2-0,7 arasında olmalıdır. Aşağı pnömokok kültürün 1 ml Spin ve 1.5 x 10 ~ 8 CFU / ml 'lik bir konsantrasyona kadar (OD okuma dayalı olarak)% 0.85 NaCI 300-2,000 ul pelletini. Genel bir kural olarak, 0.3 'lük bir OD 500 ul içinde yeniden süspanse edilecektir.
      12. S ile 1 saat inkübe edildikten sonra salivarius, 10 μ eklemekVe negatif kontrol havuzları dışındaki tüm oyuklara l seyreltilmemiş pnömokokki (hücreleri içeren sadece).
      13. 3 dakika boyunca 114 x g 'de 24-yuvalı plaka santrifüj ve 37 ° C, 3 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edilir. Bölüm 3.1.9 ve plaka seyreltilerde 10 -4, canlı sayısı yinelenen HBA plakaları 10 -5, 10 -6 açıklandığı gibi% 0.85 NaCl pnömokokki stokunun seri seyreltme gerçekleştirin.
    2. 3 saat sonra, tekkatmanları (bkz. Şekil 2) sağlıklı bir görünüm sağlamak için bir mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Her bir gözden Ortamı çıkarın ve yavaşça 2.2.3 bölümünde tarif edildiği gibi hücreler 3 kez yıkayın. her bir durum için ayrı bir pipet kullanarak. Bu adım nonadherent pnömokok kaldırmak esastır. Tek molekül sıraları, yıkama işlemi sırasında ayrı olmamalıdır; Bu mikroskop altında tekrar kontrol ile teyit edilebilir.

    Not: Bu kademe sırasında çıkarılan Media (ek analizler için -20 ° C'de saklanabilir <em> örneğin sitokin düzeylerinin ölçümü).

    1. Her kuyuya% 0.1 digitonin (hafif bir deterjan) 200 ul ilave edin ve 7, 37 ° C'de dakikada,% 5 CO2 inkübe edilir.
    2. Her bir oyuğa THB medya 800 ul ekleyin. Gerekirse, yukarı ve aşağı pipetleme ve ile eritilir hücreleri emin hücre tek tabaka tamamen kaldırılır yapmak için pipet ucu ile kuyu 3-4x kazıyın. Kuyuları arasındaki ipuçları değiştirin.
    3. Her bir P1000 pipet kullanarak içeriğini çıkarın ve etiketli mikrofüj tüplere aktarın.

    Yapışık Pnömokok 4. Kantitasyonu

    Yapışık pnömokokkinin uygun sayılarını belirlemek (seri seyreltme ve kan agarı üzerinde kaplama) ya da kantitatif gerçek zamanlı PCR ile tayin edilebilir.

    1. Canlı sayım yöntemi
      Bu yöntem, hemen yapışma deneyi aşama 3.5 sonra gerçekleştirilmelidir.
      1. Her bir deney için, kuyu, toplanan numunelerin seri seyreltileri hazırlamak% 0.85 NaCl, darbe vorteks 450 ul numune 50 ul ekleyerek ve 10 -6 seyreltme kadar 3.1.9 bölümünde tarif edildiği gibi seri olarak seyreltilmesi ile yapışma deneyinde 3.5 adım.
      2. 100 10 -3 ul, 10, -4, 10, -5 ve Plate Kan agarı üzerinde iki kez 10 -6 dilüsyonlar steril bir yayıcı ile yayılır ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe ters plakalar,% 5 CO2. Tek başına CCL-23 hücreleri içeren çukurlar bir bakteri içermemelidir ve kaplama olabilir unutmayın temiz (100 ul sulandırılmamış) bir sterilite kontrolü olarak.
      3. Ertesi gün, yapışma deneyi bölüm 3.1.13 hazırlanan (30-300 kolonileri ihtiva eden) uygun seyreltme plakaları üzerindeki kolonilerin sayılması suretiyle inokulum pnömokok belirler. İki plaka arasındaki ortalama değeri kullanarak inokulum CFU / ml hesaplanır. Benzer şekilde, S. belirler hazırlanan plakalar üzerinde koloniler sayılarak salivarius inokulabölümünde 3.1.10 içinde.
        Not: Tabaklar sadece pnömokok içermelidir; diğer türlerin varlığı, kirlenmiş ve deney sonuçları geçersiz olduğunu gösterir.
      4. Pnömokok bağlılık düzeylerini belirlemek için, 4.1.1 bölümünde hazırlanan her bir örnek için (30-300 koloni içeren pnömokok) uygun seyreltme plaka saymak. Not S. Şekil 3'te gösterildiği gibi, pnömokoklar, α-hemoliz düz ve yeşilimsi nedeniyle olacak ise salivarius koloniler, küçük ve beyaz olacaktır., pnömokokkal yapışmayı hesaplamak durum b yapışkan pnömokok sayısını normalize edilmesi için. CCL-23 hücreleri,% 100 + pnömokokkinin ve diğer koşullar bu durum yapışkan pnömokok karşılaştırın.
    2. QPCR yöntemi
      Yapışma Tahlili toplanan örnekler 3,5 DNA ekstre kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir nolu aşama. DNA izolasyonu bir ticari kit kullanılarak ve bölümlerde tarif 4.2.1-4.2.9 ve QPCR gibi olduğubölümlerde 4.2.10-4.2.20 söylüyorlar.
      1. Enzimatik Lizis Tamponu (50 mM fosfat tamponu, pH 6.7 ihtiva eden 1 mg / ml lizozim, 0.075 mg / ml mutanolysin ve 2 mg / ml proteinaz K) hazırlayın. Aşağıdaki tarifi kullanılabilir (ekstraksiyon için yeterli 50) 10 ml yapmak. Enzimatik parçalama tamponu taze kullanımdan önce hazırlanmalıdır.

        50 mM fosfat tampon çözeltisi içinde 7.25 ml (pH 6.7)
        Nihai [1 ​​mg / ml] 1.00 ml 10 mg / ml lizozim hazır
        1 mg 0.75 ml / nihai [0.075 mg / ml '] için stok mutanolysin ml
        Nihai [2 mg / ml] 1.00 ml 20 mg / ml proteinaz K hazır
      2. Buz üzerinde ya da 4 ° C 'de örnekleri Çözülme Vorteks ve etiketlenmiş mikrofüj tüplerine aktarma her bir numune 100 ul alikotları. Geri -20 ° C derin dondurucuya özgün örnekleri dönün.
      3. 10 dakika boyunca 6700 x g'de santrifüje örnekleri.
      4. Çıkarın ve süpernatant atın. Ve pelet tekrar süspansiyon vorteks enzimatik lizis tamponu 200 ul ekleyin. Inkubasyon30 dakika boyunca 56 ° C'de numunelerin yedi. Tüpün altındaki sıvıyı toplamak için 6700 x g'de santrifüjleyin kısa bir süre (5 saniye).
      5. Hücre lizizi doldurun ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın,% 20 SDS içinde 10 ul ekle.
      6. RNase A (100 mg / ml stok) ilave edin ve 4 ul (bir rocker veya tüpler ters çevrilerek), 2 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça karıştırın.
      7. 200 tampon AL ul (kit) ve 15 saniye vorteks ekleyin. 10 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe edin. Tüpün altındaki sıvıyı toplamak için 6700 x g'de santrifüjleyin kısa bir süre (5 saniye).
      8. 15 saniye boyunca% 100 EtOH ve girdap 200 ul ekle. Kenar ıslatmadan (2 ml'lik bir toplama tüpü içinde) döndürme kolonuna (herhangi bir çökelti de dahil olmak üzere) karışımı aktarın sonra, tüpün altındaki sıvıyı toplamak için kısa bir süre için Spin. Üreticinin protokolü uyarınca yıkama adımları (burada gösterilmemiştir).
      9. , DNA Zehir etiketli mikrofuj tüpüne sütun aktarmak için, Tampon AE 50 ul ekleyin (from kit) ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. 1 dakika boyunca 4.300 x g'de santrifüj. 100 ul bir son elusyon hacminde bir kez tekrarlayın. DNA, kullanılıncaya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
      10. 15 dakika önce başlamak için qPCR gerçekleştirmek için, UV ışığı ile davlumbaz sterilize edin. Her numune için iyi yerleri kaydetmek için bir 96 oyuklu plaka harita çalışma hazırlanması tavsiye edilir.
      11. (Referans suşu ATCC 6305 ayıklanır) genomik pnömokok DNA 10 ng / ml stok kullanılarak standart bir eğri hazırlayın.
        1. Pnömokok stok DNA çözülme ve bir masaüstü santrifüj kısaca (5 sn) aşağı doğru döndürün.
        2. Her bir seyreltme ile ipuçları ve vorteks değişen, 27 ul nükleaz içermeyen H2O için 3 ul DNA eklenmesi ile 6 prelabeled mikrofüj tüplerinde 01:10 seri dilüsyonları yapın. 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001, 0.00001 ve ng / ul: nihai seyreltme serisi 6 borulardan oluşmaktadır.
          Not: Bu en fazla bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
      12. Preparsteril bir PCR başlığı içinde steril 15 ml konik bir tüp içinde, aşağıdaki gibi e lytA master. Buz ve kullanımdan hemen önce girdap bileşenleri çözülme. et al.15 tarafından yayınlanan ve malzeme listede gösterilmektedir.
      13. LYTA'nın Vortex ve yük 23 ul / kuyucuk uygun kuyulara karıştırın. Plaka haritaya bakın.
      14. Örnek yüklemesi için ilave alanı (ayrı bir odada, tercihen steril kabin) şablona taşıma plakası.
      15. Her bir kuyu için ipuçları değişen, örnekleri yüklemek için bir P2 pipet kullanın. Tüm örnekler ikişer kez çalıştırılır. Konumu için plaka haritaya bakın.
      16. Standart eğri oyuklara için, 1 | il / göz, standart eğri ve 1 ul DNA, uygun seyreltme ekleme / oyuk 2 H O 25 ul son hacim getirmek.Hedef içermeyen kontrol kuyuları için, 2 ul H2O eklemek
      17. Uygun kuyulara 2 ul / göz örnek DNA ekleyin.
      18. Kullanılan tüm kuyuları kap. Emin olun kapakları sıkıca kapatılır. Hızlı bir şekilde gerçek-zamanlı PCR makinesinin içine plakasını yüklemeden önce PCR plaka (5 sn) dönerler.
      19. Makine üreticisi tarafından sağlanan talimatlara göre PCR makine ve çalışma QPCR içine plaka yükleyin. Aşağıdaki hidroliz prob döngü koşulları tavsiye edilmektedir:
        20. bileşen reaksiyon başına x 102 (tam plaka)
        lytA F 10 mcM stokunun 0.25 ul 25.5 ul
        lytA R 10 mcM stokunun 0.25 ul 25.5 ul
        lytA prob 10 uM stoklar 0.5 ul 51 ul
        H 2 O 9.5 ul 969 ul
        Usta mix 12.5 ul 1.275 ul
        Final hacmi 23 ul 2.346 ul
        Aşama 1 (1x): 95 ° C'de 3 dakika
        Aşama 2 (40x): 95 ° C'de 20 saniye
        60 ° C'de 20 saniye
      20. Veri toplamak ve standart eğri kullanılarak pnömokok DNA ölçmek. Genomik DNA, daha önce 1 pg 447.4 hücreleri eşdeğer olduğu tahmin, 17, açıklanan ve CFU / ml (varsayarak o kadar rapor edilen bakteriyel yükleri hesaplanırne CFU başına genom ve genom başına Lyta'nın bir kopyası; bakınız Şekil 4). Başarılı bir tahlil için, R 2 değeri 0,98 ≥ olmalıdır ve standart eğrinin aralığındaki tüm olumlu sonuçlar (CT 0.00001 ng için elde edilen daha az değeri / ul standart eğri noktası arka / lytA negatif olarak kabul edilir).
        Not: Bazı real-time PCR sistemleri, standart eğrileri oluşturmak ve bilinmeyenler hesaplamak için kullanılan analiz yazılımı ile birlikte gelir. Aksi takdirde, bu hesaplamalar Excel veya benzer programlar yapılabilir. Bir örnek, standart bir eğri, Şekil 4 'de gösterilmiştir.
      21. Pnömokokkal yapışmayı hesaplamak için, durum b yapışkan pnömokok sayısını normalize. CCL-23 hücreleri,% 100 + pnömokokkinin ve diğer koşullar bu durum yapışkan pnömokok karşılaştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Temsili bir deneyden elde edilen sonuçlar, bu pnömokok in (S. pneumoniae PMP843, bir kolonize 19F izole edilmiş) 1 saat S. eklenmesinden sonra CCL-23 hücrelerine ilave edildi salivarius ve pnömokokkal yapışmayı canlı sayımı ve lytA qPCR her ikisi tarafından nicelleştirilmiştir Tablo 2 'de gösterilmiştir. Sonuçlar sayısına normalize bakteri mutlak sayısı (CFU / ml olarak gösterilmiştir) ve% bağlılık, her ikisi için de, iki yöntem arasındaki uyumluydu yalnız pnömokok içeren kuyuların içinde yapışık pnömokokki. Bu pnömokokkal yapışmayı inhibe ettiği bilinmektedir ve bu nedenle, pnömokokkinin + heparin durumda azaltılmış yapışma (tipik olarak <% 40, tek başına pnömokok ile karşılaştırıldığında). S, başarılı bir tahlilin göstergesidir olarak Heparin, bir kontrol olarak kullanılır Tablo 2, S. yüksek konsantrasyonda gösterildiği gibi salivarius, doza bağımlı bir şekilde pnömokokkal yapışmayı inhibe salivarius (yaklaşıkly 10 S. salivarius: 1 pnömokok) en düşük pnömokok bağlılık sonuçlandı.

Şekil 5, CCL-23 hücreleri, pnömokokkinin yapışmasını gösterdiğinde S. salivarius 1 saat önce, pneumococci (preaddition), eş zamanlı olarak (coaddition) ya da pnömokok sonra 1 saat (post-ek) ilave edilir. S. salivarius önce, pneumococci eklendiklerinde pnömokokkal yapışmayı inhibe daha etkilidir S. hem de yüksek ve orta doz halinde salivarius önemli S. sadece yüksek dozda ise, preaddition tahlilinde (Şekil 5A) pnömokokkal yapışmayı azaltılmış salivarius coaddition ve post-ilave tahliller (Şekil 5B ve 5C) pnömokok yapışmasını inhibe.

Tablo 2'de ve Şekil 4 ve 5 veri lytA QPCR primerlerin önceki bir sürümünü kullanılarak elde edilmiştir ve 17 prob. Mevcut protokol güncelleştirilmiş QPCR tahlili tarif eder.

Şekil 1
Şekil 1. S. Temsilcisi büyüme eğrileri pneumoniae PMP843 (A) ve S. salivarius K12 (B). Her tür için, uygun bir sayımı ile tespit edildiği üzere CFU / ml siyah (sol y-ekseni) gösterilmektedir, ve 600 nm'de optik yoğunluk (OD) gri (sağ y-ekseni) gösterilmektedir. Orta log fazı S. 3 saat olduğu uygun bir sayımı ile tahmin edilmiştir pneumoniae PMP843 ve S. 2 saat salivarius K12. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51069/51069fig2.jpg "width =" 500px "/>
Şekil 2,., Sitopatik etkiler (CPE) ile sağlıklı CCL-23 hücreleri ve CCL-23 hücrelerinin örnekleri arasında. Sitopatik etkileri ile CCL-23 hücreleri. B) CCL-23 hücreleri, sağlıklı ve konfluent tek tabaka A) Örnek. Hücrelerin, hücre içi parlak bölgelerde, ve hücreler plaka kaldırdı bozulur monolayer alanlarda yuvarlama unutmayın. Görüntüler 200X büyütmede bir ters ışık mikroskobu kullanılarak alınmıştır. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 3,
Şekil 3,. S. salivarius ve at kanı agarda pnömokok koloniler. S. Beyaz ile gösterildiği gibi salivarius koloniler, küçük ve beyazok ve beyaz ok ve harf B. tarafından gösterildiği gibi harf A. Pnömokok (S. pneumoniae) koloniler, rengi genellikle, büyük düz, ve yeşilimsi olan büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

Şekil 4,
Şekil 4,. Örneği S. qPCR pneumoniae standart eğri. Genomik DNA hesaplamaları Ct değerleri ile birlikte gösterilmiştir (* temsili qPCR tahlil yinelenen standart eğri kuyuların ortalama), grafik üzerinde gösterilen sonuç standard eğri, denklemi ve R2 değeri ile. için buraya tıklayın Daha büyük resmi görmek .

Şekil 5, içerik-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" width = "600" />
S. Şekil 5. Etkisi . (Pnc,% 100'e normalize) CCL-23 hücreleri hücreleri, tek başına pnömokok ile kuluçkalanmıştır CCL-23 hücre mono tabakaları pnömokokkal yapışmayı pnömokokkal uyumda salivarius pneumococci ve 100 U / ml heparin (heparin) ile, ya da pneumococci ve S. salivarius ~ 10 bir oranda eklendi: S. salivarius: 1 pnömokokki (yüksek), ~ 1 S. salivarius: 1 pnömokokki (orta), ya ~ 1 S. salivarius:. 10 pnömokokki (düşük) S. salivarius (B) olarak, aynı zamanda, (A) ilave edilmeden önce 1 saat, ya da 1 saat sonra pnömokokki (C) edildi. n ≥ 3, * P gösterir <0.05 yalnız pneumococci (Student t testi). kıyaslandığında büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın .

"Fo: keep-together.within-page =" always ">

Grup Deneyi durum Notlar
A Tek başına CCL-23 hücreleri
B + Pnömokokki, CCL-23 hücreleri
C CCL-23 hücreleri, pnömokokkinin + + heparin Hücre yüzeyine Heparin pnömokokkal yapışmayı bloke 16 glycosylaminoglycans ve bir kontrol olarak kullanılır
D CCL-23 hücreleri, pnömokokkinin + + S. salivarius [yüksek] Yaklaşık 1 pnömokok: 10 S. salivarius
D CCL-23 hücreleri, pnömokokkinin + + S. salivarius [med] Yaklaşık 1 pnömokok: 1 S. salivarius
F CCL-23 hücreleri, pnömokokkinin + + S. salivarius [düşük] Yaklaşık 10 pnömokok: 1 S. salivarius


Tablo 1. Pnömokok Yapışma deneyinde test koşulları. Altı temel deney koşulları burada açıklanmaktadır.

6
Deneyi durumu * CFU / ml Pnc (qPCR) % Bağlılık (qPCR) CFU / ml Pnc (canlı sayımı) % Bağlılık (canlı sayımı)
Pnc yalnız 1.1 x 10 7 100 9.1 x 10 6 100
Pnc + heparin 1.5 x 10 6 14 7,6 x 10 5 8
Pnc + Sal [yüksek] 6.1 x 10 5 6 3,2 x 10 5 4
Pnc + Sal [med] 3.6 x 10 6 33 2.7 x 10 6 29
Pnc + Sal 9,8 x 10 6 92 90

Tablo 2: S. eklenmesinden sonra CCL-23 hücrelerine pnömokokkal yapışmayı . * Pnc = pnömokokki lytA QPCR ve canlı sayımı yöntemi ile belirlenen salivarius; Sal = S. salivarius; [Yüksek] yaklaşık 10 Sal: = 1 Pnc; [Med] = yaklaşık 1 Sal: 1 Pnc; 10 Pnc: [düşük] Yaklaşık 1 Sal =.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu tahlilde önemli bir kısmının S. uygun konsantrasyonları katmaktadır bölümlerde 3.1.7 ve 3.1.12 de salivarius ve pneumococci'ye. Konsantrasyonlar OD okumaları kullanılarak tahmin edilir, ancak bir sonraki gün plakalar sayılmıştır kadar tam olarak uygulanması gibi tespit edilmez. Bu nedenle, orta log fazı belirlemek ve OD ile konsantrasyonunun tahmin yardımcı olmak için tahlilde kullanılan tüm bakteriyel suşlar için zamanla OD ve uygun bir sayıları (CFU / ml) ölçmek için büyüme eğrileri gerçekleştirmek tavsiye edilir. Buna ek olarak, pnömokok suşları yapışma özellikleri önemli ölçüde farklı olabilir. Iyi yapışma (> 3 saat inkübe edildikten sonra, epitelyal hücrelerine yapışan inokulum% 10) pnömokokkal yapışmayı inhibe probiyotiklerin yeteneği araştırılmaktadır deneyleri için tavsiye edilir suşları. Deneyimli bir operatör tarafından gerçekleştirilen zaman bile, yapışma seviyesi, Şekil 5'te görülen nispeten büyük hata çubukları ile kanıtlandığı gibi, tahlil için tahlil değişebilir. ForBu nedenle her deney koşulu için yinelenen kuyuları ile, her bir deney için üç tekrarlar az öneririz. Benzer değişkenlik Escherichia coli 18 ile yapışma tahlillerinde bildirilmiştir. Bu protokol, hücrelerin pnömokok ilave edildikten sonra 3 saat boyunca inkübe edilir. Zaman süreçli deneyler, yapışma gerçekleştirilir ve bakteri çoğunluğu inkübasyondan ilk bir saat içinde uygun olduğunu gösteriyor ise Kuluçka süresi kısaltılabilir.

Bu protokol pnömokok bağlılık, qPCR ve uygulanabilir sayma ölçülmesi için iki yöntem sunar. Her iki yöntem de uygun olan, ve seçim operatörün tercihi ve mevcut laboratuar ekipmanı (gerçek zamanlı bir PCR makinesi örneğin bağlantısı) bağlıdır. Canlı sayımı ile miktar tayini ilave reaktifler ya da gerçek-zamanlı PCR makinesi gerektirmeyen düşük maliyetli bir yöntemdir. Bununla birlikte, (a 12 oyuklu bir deney için, tipik olarak 80 levhalar), birçok plakalarını kullanır ve acil gerçekleştirilmelidirTahlil sonunda ly ve pnömokok kolonilerin sayılması S. büyük bir miktarda içeren plakalar üzerinde zor olabilir salivarius. QPCR miktarının daha pahalı ve uzun bir DNA ekstraksiyon adımı gerekir, ancak örnekler etkinliğinin artırılması, dondurulmuş ve gruplar halinde işleme saklanabilir. Ekstre edilen DNA, aynı zamanda, yapışkan olmayan S. QPCR tespiti gibi, başka amaçlar için kullanılabilir salivarius. S. soruşturma ise salivarius bağlılık, bu CCL-23 hücreleri artı S. ile kuyu dahil edilmesi önerilmektedir salivarius (pnömokokların olmadan) ve CCL-23 hücre ve S ile kuyu salivarius ve heparin gibi ek kontroller.

Temel analiz ayrıca kolonizasyon diğer bilimsel yönlerini incelemek için adapte edilebilir. Örneğin, sitokin üretiminde de probiyotiklerin etkisinin hücre süpernatantlar depolama ve tahlil ile değerlendirilebilir. Tahlil, aynı zamanda oldukça ile yapışması daha bakteri istilası incelemek için değiştirilebilirhasattan önce ve lize hücreleri hücre-dışı bakterileri öldürmek için hücre membranı geçirgen olmayan antibiyotikler ile hücrelerin inkübe edilmesi. Burada açıklandığı gibi, tahlil yapışık ve invaziv (içselleştirilmiş) pneumococci arasında ayırım yapmaz. Bununla beraber, daha önce yapılan çalışmalar içsel pnömokok düzeyleri (PMP843 de dahil olmak üzere) en çok 10 izolat için (tipik olarak% 0.01 'inokulum ≤) çok küçük olduğu bulduk, hücreye birleşik pnömokok büyük çoğunluğu yapışkan yerine içsel bulunmaktadır. Ek uygulamalar kolonizasyonunu inhibe etme kabiliyeti açısından, diğer probiyotik türler test ve / veya söz konusu spesifik genlerin rolünü araştırmak için mutant bakteri türleri şu an içerir.

Bu in vitro tahlil açık bir sınırlama kurulu bir epitel, bağışıklık hücrelerini normal bitki örtüsü, ya da muhtemelen in vivo olarak pnömokokkal kolonizasyonu etkileyen diğer faktörler dahil olmamasıdır. Tam olsun probiyotikler cou değerlendirmek içinld hayvan modelleri kullanılarak ve insan klinik sonuçlar alınmış in vivo çalışmalar, solunum yollarında patojen kolonizasyonunu engellemede yararlı olabilir. Bununla birlikte, in vitro deneyler, yapışma pnömokokkal yapışmayı inhibe etmek için potansiyeli olan probiyotik belirlenmesi için yararlı bir ekran olarak hizmet etmek ve tercih edilen doz stratejileri ile ilgili bilgilerin yanı sıra, mekanik çalışmalar için kullanılabilen deneysel bir model temin sağlayabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Murdoch Çocuk Araştırma Enstitüsü ve Victoria Hükümeti'nin Operasyonel Altyapı Destek Programı tarafından finanse edilerek desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. Lancet. 374, 893-902 (2009).
  2. Bogaert, D., de Groot, R., Hermans, P. W. M. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect. Dis. 4 (04), 144-154 (2004).
  3. Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination. Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).
  4. Jacoby, P., et al. Modelling the co-occurrence of Streptococcus pneumoniae with other bacterial and viral pathogens in the upper respiratory tract. Vaccine. 25, 2458-2464 (2007).
  5. Kwambana, B., Barer, M., Bottomley, C., Adegbola, R., Antonio, M. Early acquisition and high nasopharyngeal co-colonisation by Streptococcus pneumoniae and three respiratory pathogens amongst Gambian new-borns and infants. BMC Infect. Dis. 11, (2011).
  6. Licciardi, P. V., et al. Protecting against pneumococcal disease: critical interactions between probiotics and the airway microbiome. PLoS Pathog. 8, (2012).
  7. Popova, M., et al. Beneficial effects of probiotics in upper respiratory tract infections and their mechanical actions to antagonize pathogens. J. Appl. Microbiol. 113 (6), 1305-1318 (2012).
  8. Pracht, D., et al. PavA of Streptococcus pneumoniae modulates adherence, invasion, and meningeal inflammation. Infect. Immun. 73, 2680-2689 (2005).
  9. Adamou, J. E., Wizemann, T. M., Barren, P., Langermann, S. Adherence of Streptococcus pneumoniae to human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Infect. Immun. 66, 820-822 (1998).
  10. Wong, S. S., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae adherence to human epithelial cells in vitro by the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG. BMC Res. Notes. 6 (1), 135 (2013).
  11. Wescombe, P. A., Heng, N. C. K., Burton, J. P., Chilcott, C. N., Tagg, J. R. Streptococcal bacteriocins and the case for Streptococcus salivarius as model oral probiotics. Future Microbiol. 4, 819-835 (2009).
  12. Di Pierro, F., Adami, T., Rapacioli, G., Giardini, N., Streitberger, C. Clinical evaluation of the oral probiotic Streptococcus salivarius K12 in the prevention of recurrent pharyngitis and/or tonsillitis caused by Streptococcus pyogenes in adults. Expert. Opin. Biol. Ther. 13 (3), 339-343 (2013).
  13. Fiedler, T., et al. Protective mechanisms of respiratory tract streptococci against Streptococcus pyogenes biofilm formation and epithelial cell infection. Appl. Environ. Microbiol. 79, 1265-1276 (2013).
  14. Slotved, H. C., Satzke, C. In vitro growth of pneumococcal isolates representing 23 different serotypes. BMC Res. Notes. 6, 10-1186 (2013).
  15. Carvalho, M. dG. S., et al. Evaluation and improvement of real-time PCR assays targeting lytA, ply, and psaA genes for detection of pneumococcal DNA. J. Clin. Microbiol. 45, 2460-2466 (2007).
  16. Tonnaer, E. L. G. M., et al. Involvement of glycosaminoglycans in the attachment of pneumococci to nasopharyngeal epithelial cells. Microbes Infect. 8, 316-322 (2006).
  17. Smith-Vaughan, H., et al. Measuring nasal bacterial load and its association with otitis media. BMC Ear Nose Throat Disord. 6, (2006).
  18. Letourneau, J., Levesque, C., Berthiaume, F., Jacques, M., Mourez, M. In vitro assay of bacterial adhesion onto mammalian epithelial cells. J. Vis. Exp. , (2011).

Tags

İmmünoloji Sayı 86 Gram-pozitif Bakteriyel Enfeksiyonlar Zatürre Bakteriyel Akciğer Hastalıkları Solunum Yolu Enfeksiyonları, Bağlılık kolonizasyon probiyotikler,
Bir kullanma Pnömokok Kolonizasyon üzerinde Probiyotiklerin Etkileri incelenmesi<em&gt; In Vitro</em&gt; Yapışma Deneyi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter