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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

使用一个调查益生素对肺炎球菌定植的影响 Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

体外坚持测定可用于研究肺炎链球菌的附着上皮细胞单层，并探讨潜在的干预措施，如使用益生菌抑制肺炎球菌定植。

Abstract

肺炎链球菌 （肺炎球菌）的坚持鼻咽上皮衬里可导致殖民化，被认为是肺炎球菌感染，如肺炎和中耳炎的先决条件。 体外粘附实验可以用来研究肺炎球菌的附着上皮细胞单层和调查潜在的干预措施，如使用益生菌，能抑制肺炎球菌定植。这里所描述的协议被用来研究对肺炎球菌的对人上皮细胞系CCL-23的粘附益生菌唾液链球菌的效果（有时也称为HEp-2细胞）。该法包括三个主要步骤：1）准备上皮细胞和细菌细胞，2）除细菌上​​皮细胞单层的，和3）检测肺炎链球菌粘附通过活菌数（连续稀释和电镀）或定量实时PCR（qPCR的）。这TEChnique是相对简单的，不需要专门的设备比组织培养的设置等。该法可用于测试其他益生菌种类和/或肺炎球菌定植的潜在抑制剂，并可以很容易地修改，以解决有关肺炎球菌粘附和侵袭等科学问题。

Introduction

肺炎链球菌 （肺炎球菌）是一种革兰氏阳性细菌，可引起感染，包括肺炎，中耳炎，脑膜炎。它是疾病的中低收入国家的儿童和负责估计有80万，每年死亡人数的1五岁以下儿童的主要病因。肺炎球菌是经常携带在幼儿的鼻咽部。虽然这定植通常被认为是无症状的，它先于肺炎球菌的感染，并作为贮存器为细菌在人群2。肺炎球菌结合疫苗接种有效地降低了运输包含在疫苗中的血清型。然而，有超过90肺炎球菌血清型，疫苗接种可导致血清型替换，从而消除疫苗血清型的后面是一个上升的马车和疾病引起的非疫苗血清型3。此外，在一些高危人群，肺炎球菌定植常发生在生命的早期，前第一剂疫苗4,5的管理。最近，使用益生菌已被提出作为一个额外的策略，以抑制肺炎球菌定植6,7。 体外粘附试验已被用于检查肺炎球菌粘附8,9。这些实验已经适应了调查益生菌鼠李糖乳杆菌 GG（LGG）对肺炎球菌坚持10的影响。

除了​​LGG和其他乳酸细菌， 唾液链球菌 ，口腔内的一种常见的居民，已被研究作为呼吸道一个潜在的益生菌，由于其潜在的定殖和抑制肺炎球菌和其它呼吸道病原体的体外能力11 - 13。这里介绍的协议描述用于调查S的影响的粘附试验唾液 K12对肺炎球菌坚持对人上皮细胞系CCL-23。在之前的实验使用，肺炎球菌菌株进行了评价粘附能力，生长和附着性可以有很大差异的菌株10,14之间。肺炎链球菌和S.的生长曲线唾液中执行通过光密度，以确定对数中期和估计浓度（菌落形成单位或CFU /毫升）（OD， 图1）。因此建议通过活菌数和OD检查生长的每个隔离在测定前使用。该测定可以在标准的组织培养设施和设备的任何实验室进行。在这个协议中，三个剂量的S的影响唾液给予1小时前对S的依从性增加肺炎球菌肺炎 PMP843，从鼻咽拭子派生的血清型19F车厢分离，进行检查。两种不同的方法来量化肺炎链球菌粘附呈现：电镀血琼脂阻止矿山活菌数，以及DNA提取和检测肺炎链球菌自溶素基因的qPCR 15。基本遵守试验方案可以很容易地修改，以测试不同剂量或益生菌的给药时间，也可以与其他的细菌菌株或物种中使用。

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Protocol

上皮1。准备和细菌细胞

  1. CCL-23上皮细胞的解冻
    1. Prewarm最小必需培养基（MEM）的含10％胎牛血清（FBS）在37℃水浴〜30分钟。
    2. 消毒的组织培养批准的生物安全柜，用紫外灯使用前至少10分钟，然后擦拭手中的工作区用70％乙醇。请用70％的乙醇和地点在生物安全柜的温暖媒体瓶。
    3. 用25毫升移液管转移14毫升的介质导入T-75烧瓶中。将烧瓶在37℃培养箱中培养，而细胞解冻（1.1.4节）。
    4. 卸下液氮储存使用适当的安全预防措施，并在一个温暖的37℃水浴中，直到〜80％解冻CCL-23细胞的小瓶。
    5. 返回在第1.1.3生物安全柜准备的烧瓶中。擦拭CCL-23细胞的小瓶的外表面用70％乙醇和传送内容（1毫升）到T-75瓶使用P1000的移液管。
    6. 孵育在其一侧将烧瓶在37℃，5％CO 2，95％相对湿度组织培养箱中过夜（16-20小时）。
    7. 检查在显微镜下的细胞，以确认一个健康的形态，去除介质，并更换15毫升新鲜，预热MEM +10％FBS。
  2. CCL-23上皮细胞的维持
    1. 一旦细胞是〜80％汇合（1-2天），通过用25毫升移液管除去介质和轻轻地用8-10洗细胞两次毫升预热的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，用10毫升吸管。
    2. 除去PBS中并加入1毫升无菌的0.25％胰蛋白酶-EDTA（0.25％（重量/体积），胰蛋白酶，0.1 mM EDTA）中。把烧瓶在其一侧，旋转，以确保胰蛋白酶涵盖细胞的汇合层，并培育烧瓶中2-3分钟在37℃，5％CO 2的培养箱中培养。
    3. 回到瓶中的生物安全柜，加9毫升预热MEM +10％FBS，和吸管上下6 -8倍到重悬细胞，喷射液体向下烧瓶撞出细胞的一侧。
    4. 分裂细胞1点15分（1毫升+14毫升MEM +10％FBS）或1点半（0.5毫升+14.5毫升MEM +10％FBS），弃去过量的细胞，并返回到烧瓶中，在37℃，5％CO 2培养箱中培养。
    5. 通道的细胞至少两次在粘附试验后方可使用。典型的细胞分裂，每3-4天。
  3. CCL-23上皮细胞接种 （前一天粘附试验，协议2）
    1. 如在第1.2.1-1.2.3所述，重新悬浮在预热的MEM分裂汇合细胞+5％FBS（胎牛血清的浓度降低，以减少血清成分干涉检测的可能性）。去除20微升细胞，并使用台盼蓝染色和血细胞计数器计数。
    2. 稀释细胞在预热的MEM + 5％FBS，以1.5×10 5细胞/在无菌的50ml管中ml的浓度。
    3. 种子1毫升个细胞/孔在一个组织培养处理的24孔板中。
  4. 细菌的制备
    这个过程可以遵循为制备肺炎球菌和S的唾液 。细菌生长介质通常保持在37℃培养箱中过夜，以prewarm和测试不育（如果被污染一般会出现混浊）。
    1. 要坚持性对马血琼脂（HBA）板检测，连胜细菌和孵化，在35-37℃和5％CO 2的18-24小时之前两天。绵羊血琼脂可以作为一种替代方法。
    2. 次日，通过吸取10毫升托德-Hewitt肉汤0.5％酵母提取物（THB + YE）介质进入无菌30毫升管制备的过夜培养每个细菌物种。用10微升环，接种约10-12很好的分离克隆。简要涡和孵化，在35-37℃和5％CO 2为14-16小时。需要注意的是肺炎球菌就会自溶如果离开太久的肉汤培养物。

    2坚持含量：加入细菌的上皮细胞单层

    1. 肺炎链球菌和S.中旬登录细菌培养物的制备唾液
      1. 移取10毫升预热泰铢+叶成每两个无菌30毫升管，一个标有肺炎球菌及其他S的唾液 。
      2. 达到对数中期，肺炎球菌要求〜3小时和S.唾液需要〜2小时培养（参见图1）。同时启动两种文化。涡（3-5秒）过夜细菌培养，并加入100微升肺炎球菌和100微升S。唾液进入相应的管。
      3. 简要涡和孵化培养，在37℃下为S。约2小时唾液和3小时的肺炎球菌。
    2. CCL-23细胞粘附试验的制备
      1. 使用倒置显微镜，检查24孔板confluen吨单层与健康的细胞形态。单分子膜应> 80％汇合，没有细胞聚集或致细胞病变效应如细胞变圆附着的或损失（参见图2）的证据。
      2. 在每个用移液管好，倾斜板稍微以避免干扰细胞单层中取出介质。
      3. 轻轻洗涤细胞，加入约500μL预热的PBS到每一个使用血清吸管好，用移液管将其删除，稍微倾斜板。弃PBS。重复洗涤步骤一次。
      4. 加入500μl预热的MEM + 5％FBS在每孔中。返回的24孔板中的CO 2培养箱中，同时制备细菌培养物。
        注意：为了确定感染复数（MOI）的多重性的确切CCL-23细胞的数目，两口井可以被胰蛋白酶消化并计数在感染当天。

    3，坚持含量

    1. 添加到肺炎球菌在CCL-23细胞在MOI〜10:1。测试一式两份孔中在表1中列出的条件。
      1. 衡量的A 600（外径）1毫升S的光密度唾液文化。外径应为0.3-0.6之间。
      2. 转帐5毫升S。唾液文化到10ml的试管和离心1,870×g离心4分钟。
      3. 弃上清，并根据OD值在3.1.1节，重悬S。唾液在200-1,000微升0.85％的NaCl（终浓度为〜1.5×10 9 CFU /毫升）。作为一般指引，0.375的OD将悬浮在260微升。准备1:10和1:100稀释的S。用0.85％的NaCl 唾液 。
        注：共有三种浓度的S.（代表高，中，低剂量）将唾液测定中进行测试。高剂量的〜10 S的比值唾液 ：1肺炎球菌，介质为〜1 S。唾液 ：1肺炎球菌，而低为〜1个S。唾液：10肺炎球菌。
      4. 取出24孔板从保温箱。
      5. 从肝素对照孔，取出40微升的媒体和100 U / ml的终浓度加入50微升肝素（1,000 U / ml的股票浓度）。
      6. 加入10微升0.85％的NaCl只含CCL-23细胞和含CCL-23细胞和肺炎链球菌（S.无唾液 ）井井。
      7. 加入10微升未稀释的1:10和1:100 S。唾液各自的水井。
        注：S。唾液也可以在同一时间为肺炎双球菌（coaddition）或1小时，加入肺炎球菌（后加）后，研究益生菌给药时间的影响。
      8. 离心24孔板中于114×g离心3分钟，以促进与细胞层的细菌接触并孵育1小时，在37℃，5％CO 2。
      9. 执行S的连续稀释唾液股票在0.85％NaCl和平板上的重复的HBA板的活菌数。首先，加入50微升的现货，450微升0.85％的NaCl，使10 -1稀释，然后脉冲涡流（5秒），变更的提示，并加入50微升的10 -1稀释至450微升0.85％的NaCl作10 -2稀释度等等多达10 -7。
      10. 板100微升的10 -5，10 -6和10 -7稀释液一式两份的HBA板和扩散用无菌吊具。在37℃，5％CO2倒过夜的HBA板。
      11. 向1小时温育结束时，对肺炎球菌重复部分3.1.1-3.1.3。的OD应该是0.2-0.7之间。降速1毫升肺炎球菌培养和悬浮颗粒在300-2,000微升0.85％氯化钠（基于OD值）来的〜1.5×10 8 CFU /毫升的浓度。作为一般指引，0.3的OD将重新悬浮于500微升。
      12. 1小时后孵化与S。唾液 ，加入10μ;升未稀释的肺炎球菌对所有的井，除了阴性对照孔（含电池只）。
      13. 离心24孔板中于114×g离心3分钟，并在37℃，5％CO 2中3小时。如第3.1.9和平板稀释10-4，10-5和10-6上的重复的HBA板的活菌数中描述的0.85％的NaCl进行肺炎球菌股票的连续稀释。
    2. 3小时后，检查在显微镜下的细胞，保证细胞单层看起来很健康（ 见图2）。从各取出介质，并轻轻按2.2.3节中描述洗细胞3倍。使用不同的移液管的每个状态。这一步是必要的，以除去未粘附的肺炎球菌。单层不应该在洗涤过程中散开;这可以通过在显微镜下再次检查来确认。

    注意：介质在该步骤中去除，可以储存在-20℃下进行另外的分析（<em>的例如细胞因子水平的测量）。

    1. 加入200μl0.1％毛地黄皂苷（温和的洗涤剂）的每个孔中，孵育7分钟，在37℃，5％CO 2。
    2. 添加800微升THB的媒体的每个孔中。裂解细胞用移液器上下吹吸，并且，如果需要，刮井3至4倍的移液管尖，以确保细胞单层被完全除去。改变井之间的技巧。
    3. 从每个使用P1000的移液管以及取出内容物并转移到标有微量离心管中。

    贴壁肺炎球菌4。定量

    肺炎球菌粘附可通过测定活菌数（连续稀释和镀层在血琼脂）或通过定量实时PCR进行定量。

    1. 活菌计数方法
      必须坚持测定步骤3.5之后立即执行此方法。
      1. 对于每个分析孔，准备在收集样本的连续稀释通过加入50μl的样品到450微升0.85％NaCl中，脉冲涡流，并连续稀释如第3.1.9至10 -6稀释描述步骤3.5的粘附测定。
      2. 板100微升的10 -3，10 -4，10 -5，和 10 -6稀释度一式两份在血琼脂，散布用无菌吊具，并于37℃过夜孵育平板倒置，5％的CO 2。注意，含有：CCL-23细胞的单独的孔中不应该包含任何细菌和可镀整齐（100微升未稀释）作为无菌控制。
      3. 第二天，通过计算在坚持试验第3.1.13编写相应的稀释板（含30-300殖民地）的菌落确定肺炎球菌接种。计算CFU /毫升的用平均值由两个板块的接种物。同样，确定S。唾液接种计数编制板上的菌落在第3.1.10。
        注：板应该只包含肺炎双球菌;其它物种的存在表明该测定法被污染和结果是无效的。
      4. 要确定肺炎球菌附着水平，算上适当稀释平板（含30-300肺炎球菌菌落）在第4.1.1准备每个样品。需要注意的是S。唾液菌落将是小和白色，而肺炎链球菌将持平和绿色由于α-溶血，如示于图3。要计算的肺炎球菌粘附，从条件b正常化粘附肺炎链球菌的数量。 CCL-23细胞+肺炎链球菌为100％，和肺炎球菌粘附比较从其他条件这个条件。
    2. 定量PCR方法
      收集粘附试验样品步骤3.5可以储存在-20°C，直到DNA提取。使用商业试剂盒进行DNA提取和在各节中描述4.2.1-4.2.9和qPCR的作为说在第4.2.10-4.2.20。
      1. 制备酶促裂解缓冲液（含有50mM磷酸盐缓冲液pH 6.7 1毫克/毫升溶菌酶，0.075毫克/毫升的变溶菌素，和2毫克/毫升蛋白酶K）。以下几招可以用来打10毫升（不足50提取）。酶法裂解液应在使用前新鲜配制。

        7.25毫升的50mM磷酸盐缓冲液（pH 6.7）
        1.00毫升10的最终[1毫克/毫升]毫克/毫升溶菌酶股票
        0.75 1毫克毫升/ ML变溶菌素股票作最后[0.075毫克/毫升]
        1.00毫升20的最后[2毫克/毫升] mg / ml的蛋白酶K股票
      2. 解冻在冰上或4℃下的样品涡和传输每个样品100μL分装到标有微量离心管中。返回原始样本放回-20℃冰箱。
      3. 离心样品在6700×g离心10分钟。
      4. 取出并弃去上清液。加入200μl酶裂解缓冲液的颗粒和涡旋重悬。 Incub吃的样品在56℃下进行30分钟。短暂离心（5秒），在6700×g离心在试管底部收集液体。
      5. 加10微升20％的SDS，以完成细胞裂解，轻轻混匀，在室温下放置2分钟。
      6. 加入4μLRNA酶A（100毫克/毫升的股票）中，轻轻混匀（在摇臂或反相管），在室温下2分钟。
      7. 加入200μl缓冲液的Al（从工具包），涡旋15秒。孵育的样品在70℃下10分钟。短暂离心（5秒），在6700×g离心在试管底部收集液体。
      8. 加入200μl100％乙醇，涡旋15秒。简要地旋转以收集液体在管的底部，则在不润湿的轮辋的混合物（包括任何沉淀物）转移到离心柱（在2 ml收集管中）。根据制造商的方案中遵循的洗涤步骤（此处未示出）。
      9. 以洗脱DNA，转列到一个标有离心管中，加入50微升缓冲的AE（FR嗡试剂盒），并在室温下孵育2分钟。离心机在4300×g离心1分钟。重复一次，最后洗脱的100微升体积。 DNA可以贮存于-20℃直至使用。
      10. 要执行定量PCR，消毒用紫外灯的罩15分钟前开始。准备一个96孔板地图工作表记录井位每个样品建议。
      11. 使用的肺炎球菌的基因组DNA（从参考菌株ATCC 6305中提取）10纳克/微升库存制备标准曲线。
        1. 解冻肺炎球菌股票的DNA，并在台式离心机后短暂离心（5秒）。
        2. 加入3微升的DNA，以27μL无核酸酶H 2 O，每个稀释度之间变化的技巧和涡旋执行1:10系列稀释液在6预先标记的离心管。最终的稀释系列由6个试管：1，0.1，0.01，0.001，0.0001和0.00001纳克/微升。
          注意：这些可以被存储在4℃下长达一周。
      12. PreparêLYTA mastermix在无菌的15毫升锥形管在无菌PCR罩如下。在冰上解冻并涡旋在使用前立即组件。 等人15最初被发表的，并示于材料的列表。
      13. 旋涡LYTA和负载23微升/孔混合到适当的水井。是指板图。
      14. 交通运输板块的样品装载模板除了区域（在一个单独的房间最好是无菌柜）。
      15. 使用P2移液管装入样品，改变提示每口井。所有样品一式两份运行。是指板图的位置。
      16. 对于标准曲线的井，加入1μl/孔的适当稀释的标准曲线的DNA加1微升/孔H 2 O至使终体积为25微升。对于无模板对照孔，加2微升H 2 O
      17. 加入2μl/孔的样品DNA插入适当的孔。
      18. 盖上使用的所有井。确保帽紧贴关闭。装载板进入实时PCR仪前快速旋转PCR板（5秒）。
      19. 负载板进入PCR仪和运行的qPCR根据由机床制造商提供的说明。下面水解探针循环条件，建议：
        20. 元件 每个反应 ×102（全板）
        LYTA F 0.25微升10微米股票 25.5微升
        LYTAř 0.25微升10微米股票 25.5微升
        LYTA探头 0.5微升10微米股票 51微升
        H 2 O的 9.5微升 969微升
        预混 12.5微升 1,275微升
        最终体积 23微升 2,346微升
        步骤1（1×）： 3分钟，在95℃下
        步骤2（40X）： 20秒在95℃下
        20秒在60℃下
      20. 收集数据，并使用标准曲线定量肺炎球菌的DNA。如前所述17，推定该1皮克基因组DNA的相当于447.4细胞，并报告为菌落形成单位/毫升（假设ö细菌负荷的计算每CFU NE基因组中，每个基因组LYTA的一个副本;参见图4）。对于一个成功的试验中，在R 2的值应≥0.98和标准曲线的范围内的所有阳性结果（Ct值小于为0.00001纳克获得/微升标准曲线点被认为是背景/ LYTA负）。
        注意：某些实时PCR系统都带有可用于构建标准曲线，并计算未知分析软件。否则，这些计算可以在Excel或类似的程序来进行。一个例子的标准曲线示于图4。
      21. 为了计算肺炎球菌坚持，从正常化条件b附着肺炎球菌的数量。 CCL-23细胞+肺炎球菌为100％，和肺炎球菌粘附比较从其他条件这个条件。

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Representative Results

结果从有代表性的实验中，肺炎链球菌（ 肺炎链球菌 PMP843，一个定植19F分离物）加入到CCL-23细胞中加入S。后1小时唾液 ，和肺炎球菌粘附进行定量既活菌计数和LYTA的qPCR示于表2，结果是这两种方法对细菌的两个绝对数量（表示为菌落形成单位/毫升），％依从性，归一化到数之间是一致的的肺炎链球菌附着在仅含有肺炎球菌的水井。肝素被用作对照，因为它是已知的抑制肺炎球菌粘附，因此在肺炎链球菌+肝素条件减少附着（通常<40％，而单 ​​独的肺炎球菌）是指示一个成功的测定。S.唾液抑制，且呈剂量依赖性肺炎球菌粘附，如表2所示，其中高浓度的S。唾液 （近似值LY 10 S。唾液 ：1肺炎双球菌）导致的肺炎球菌最低的坚持。

图5示出肺炎球菌的对CCL-23细胞的粘附时S.唾液中加入肺炎球菌前1小时（preaddition），同时（coaddition）或肺炎后1小时（后添加）。S.唾液是在何时之前加肺炎球菌，肺炎球菌抑制附着更为有效同时作为高，中剂量的S。唾液显著减少肺炎球菌粘附在preaddition测定（ 图5A），而仅在高剂量的S。唾液抑制在coaddition和后添加测定（ 图5B和5C），肺炎球菌粘附。

表2中所示和图4和图5中的数据用的LYTA的qPCR引物的早期版本获得和探头17。目前的协议描述了更新的qPCR分析。

图1
图1：S.代表生长曲线肺炎 PMP843（A）和S。唾液 K12（B）对于每个物种，CFU / ml的通过可行的计数测定显示为黑色（左侧y轴）和光密度（OD）在600nm处显示为灰色（右侧y轴）。半对数期进行估计可行的计数为3小时为S。肺炎 PMP843和2小时为S。唾液 K12。 点击这里查看大图 。

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图2。健康CCL-23细胞和CCL-23细胞病变效应（CPE）的例子。 CCL-23细胞B）CCL-23细胞病变效应的健康，融合单层的）例子。注意细胞，细胞内的明亮区域，并且打乱单层细胞的地方都抬离板领域的舍入。用倒置光显微镜放大200倍拍摄图像。 点击这里查看大图 。

图3
图3。S.唾液和马血琼脂肺炎球菌菌落。S. 唾液菌落小而白，由白所示箭头和字母A肺炎（ 肺炎链球菌 ）菌落通常较大，扁平化，绿色为主色，白色箭头和字母B所示点击这里查看大图 。

图4
图4实施例S.对于肺炎定量PCR标准曲线。基因组DNA计算与Ct值显示（*平均从有代表性的qPCR实验重复的标准曲线井），与上图所示的最终标准曲线方程和R 2的值。 点击这里查看大图 。

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S的 ​​图5。影响唾液对肺炎球菌坚持CCL-23细胞肺炎球菌坚持CCL-23细胞单层时细胞培养与肺炎球菌孤单。（PNC;标准化为100％），与肺炎球菌和100 U / ml的肝素（肝素），或与肺炎球菌和S。唾液加入量为〜10的比率：S。唾液 ：1肺炎双球菌（高），〜1 S。唾液 ：1肺炎双球菌（中），或者〜1 S。唾液 ：10肺炎球菌（低）S。唾液中加入1小时（A）之前，同时作为（B）或肺炎后1小时（C）。 n≥3时，*表示P <0.05时相比，单纯肺炎链球菌（Student t检验）。 点击这里查看大图 。

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组试验条件笔记
一单独CCL-23细胞
乙 CCL-23细胞+肺炎双球菌
Ç CCL-23细胞+肺炎球菌+肝素肝素块肺炎球菌粘附到细胞表面glycosylaminoglycans 16和用作控制
ð CCL-23细胞+肺炎球菌+ S。唾液 [高] 约1肺炎球菌：10 S。唾液
Ë CCL-23细胞+肺炎球菌+ S。唾液 [医] 约1肺炎球菌：1 S。唾液
F CCL-23细胞+肺炎球菌+ S。唾液 [低] 约10肺炎球菌：1 S。唾液


表1中的条件肺炎球菌粘附试验测试。六个基本实验条件说明如下。

6个
试验条件* CFU /毫升PNC（定量PCR） ％依从性（定量PCR） CFU /毫升PNC（活菌数） ％依从性（活菌数）
PNC独 1.1×10 7 100 9.1×10 6个 100
PNC +肝素 1.5×10 6个 14 7.6×10 5个 8
PNC +萨尔[高] 6.1×10 5个 6 3.2×10 5个 4
PNC +萨尔[医] 3.6×10 6个 33 2.7×10 6个 29
PNC +萨尔 9.8×10 6个 92 90

表2：以下添加S.肺炎球菌粘附到CCL-23细胞唾液由LYTA定量PCR和活菌计数法测定 * PNC =肺炎双球菌;萨尔= S。唾液 ; [高] =约10萨尔：1 PNC; [医] =约1萨尔：1 PNC; [低] =约1萨尔：10 PNC。

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Discussion

该测定法的一个关键部分是加入S的适当浓度唾液和肺炎球菌在第3.1.7和3.1.12。浓度使用OD值估计，但确切的接种都没有确定，直到板计数第二天。出于这个原因，建议进行生长曲线测定OD和活菌数（CFU / ml）的随时间变化的测定中用于识别数中期，并协助由OD浓度估算所有的菌株。此外，肺炎球菌菌株可以在自己的坚持性方面都有很大差别。菌株具有良好的粘附性（>接种3小时温育之后粘附到上皮细胞的10％）被推荐为测定调查益生菌抑制肺炎球菌粘附的能力。即使当由有经验的操作者进行的，附着水平可随检测到测定，如由如图5所示的比较大的误差棒。对于为此，我们建议至少三个重复每个实验中，复孔每个检测条件。类似的变异有报道在使用大肠杆菌 18粘附测定。在这个协议中，将细胞孵育3小时后加入肺炎球菌。如果坚持时间过程实验的进行和显示，大多数细菌培养的第一个小时内附着的孵育时间可被缩短。

该协议提出了两种方法来量化肺炎球菌附着，定量PCR和可行的计数。这两种方法都是合适的，而选择依赖于操作者的首选项和可用实验室设备（ 例如，访问一个实时PCR机器）。量化由可行计数是不需要另外的试剂或实时PCR机器的低成本方法。然而，它使用了许多板（通常80板为12孔测定），并且必须立即执行的LY在测定结束时，计数和肺炎球菌的菌落可以是困难的，包含大量的S.板唾液 。量化通过qPCR是更昂贵的，需要长时间的DNA提取步骤，但样品可以冷冻储存，并在分批处理，提高了效率。提取的DNA也可以用于其它目的，如定量PCR检测粘附S的唾液 。如果调查S.唾液坚持，建议包括井CCL-23细胞加S。唾液 （无肺炎双球菌）和井CCL-23细胞加S。唾液和肝素作为额外的控制。

基本分析还可以适应定植调查等科学方面。例如，对细胞因子产生益生菌的效果可以通过存储并测定细胞上清液进行评估。该测定也可以被修改来检查细菌侵入而不是附着由培养细胞细胞膜防渗抗生素杀死细菌胞外之前，收集和裂解细胞。如这里描述的那样，测定不粘附和侵入性（内在）肺炎链球菌之间进行区分。然而，先前的研究已经发现内在肺炎球菌的电平非常小（通常≤接种物的0.01％）10因此，对于大多数菌株（包括PMP843），细胞相关的肺炎双球菌的绝大多数是贴壁，而不是内在化。其它应用还包括用于抑制殖能力测试其他的益生菌种，和/或在寻找突变的细菌菌株进行调查感兴趣的特定基因的作用。

这在体外测定法的一个明显局限在于它不包括已建立的上皮细胞，免疫细胞，正常菌群，或者说有可能影响肺炎链球菌定殖在体内的其他因素。要充分评估益生菌是否腠LD是防止病原菌定植于呼吸道， 体内研究利用动物模型和人体临床试验是必要的有益的。然而， 在体外粘附试验作为用于识别益生菌以潜在抑制肺炎球菌粘附一个有效屏幕，并且可以提供关于优惠的给药策略的信息，以及提供了可用于机理研究的实验模型。

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Disclosures

作者什么都没有透露。

Acknowledgments

这项工作是由来自默多克儿童研究所和维多利​​亚州政府的基础设施运营支持项目资金支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

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References

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免疫学，第86期，革兰氏阳性菌感染，肺炎，细菌性，肺疾病，呼吸道感染，
使用一个调查益生素对肺炎球菌定植的影响<em&gt;体外</em&gt;粘附试验
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Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

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