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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un Published: April 28, 2014 doi: 10.3791/51069
Automatic Translation
1, 2, 3, 1,4, *1,4, *2
1Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, 2Allergy & Immune Disorders, Murdoch Childrens Research Institute, 3Department of Otolaryngology, The University of Melbourne, 4Department of Microbiology & Immunology at the Peter Doherty Institute for Infection & Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

In vitro aderenza possono essere utilizzati per studiare l'attaccamento di Streptococcus pneumoniae di monostrati di cellule epiteliali e di indagare potenziali interventi quali l'uso di probiotici per inibire la colonizzazione pneumococcica.

Abstract

L'aderenza di Streptococcus pneumoniae (pneumococco) al rivestimento epiteliale del rinofaringe può provocare colonizzazione ed è considerato un prerequisito per infezioni pneumococciche quali polmonite e otite media. Saggi in vitro di aderenza possono essere utilizzati per studiare l'attaccamento di pneumococchi a cellule epiteliali monostrati e di indagare potenziali interventi, come l'uso di probiotici, per inibire la colonizzazione pneumococcica. Il protocollo qui descritto viene usato per studiare gli effetti della salivarius Streptococcus probiotico dall'adesione dei pneumococchi alla linea cellulare epiteliale umano CCL-23 (talvolta indicato come cellule HEp-2). Il test prevede tre fasi principali: 1) la preparazione delle cellule epiteliali e batteriche, 2) l'aggiunta di batteri per monostrati di cellule epiteliali, e 3) individuazione di pneumococchi aderenti da conte vitali (diluizione seriale e placcatura) o quantitativa real-time PCR (qPCR ). Questo technique è relativamente semplice e non richiede attrezzature specializzate diverso da una configurazione coltura tissutale. Il test può essere usato per testare altre specie probiotiche e / o potenziali inibitori di colonizzazione da pneumococco e può essere facilmente modificato per affrontare altre questioni scientifiche riguardanti l'adesione pneumococcica e l'invasione.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è un batterio Gram-positivi che possono causare infezioni, tra cui la polmonite, otite media, e la meningite. E 'una delle principali cause di malattia nei bambini nei paesi a basso reddito e responsabile di circa 800.000 decessi di bambini sotto i cinque anni ogni anno 1. Pneumococchi sono spesso effettuato nel nasofaringe dei bambini. Sebbene questa colonizzazione è generalmente considerato asintomatica, precede infezione pneumococcica e funge da serbatoio per i batteri in popolazioni umane 2. Vaccinazione pneumococcico coniugato riduce efficacemente il trasporto dei sierotipi contenuti nel vaccino. Tuttavia, ci sono più di 90 sierotipi di pneumococco, e la vaccinazione può portare alla sostituzione sierotipo, per cui l'eliminazione dei sierotipi del vaccino è seguita da un aumento della carrozza e malattia causata da sierotipi non vaccinali 3. Inoltre, in alcune popolazioni ad alto rischio, pneumococcocolonizzazione si verifica spesso molto presto nella vita, prima della somministrazione della prima dose di vaccino di 4,5. Recentemente, l'uso di probiotici è stata proposta come una strategia aggiuntiva per inibire pneumococcica colonizzazione 6,7. Saggi in vitro di aderenza sono stati utilizzati per esaminare l'adesione pneumococcica 8,9. Questi test sono stati adattati per studiare l'impatto del probiotico Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) sull'adesione pneumococcica 10.

Oltre a LGG e altri batteri lattici, Streptococcus salivarius, residente comune della cavità orale, è stato studiato come potenziale probiotico per le vie respiratorie a causa della sua potenziale colonizzazione e capacità di inibire pneumococchi e altri patogeni respiratori in vitro 11 - 13. Il protocollo presentato qui descrive un test aderenza utilizzato per studiare gli effetti di S. salivarius K12 sul rispetto pneumococcoalla linea cellulare epiteliale umano CCL-23. Prima di usare nel saggio, isolati pneumococco sono stati valutati per le capacità di aderenza, come la crescita e le proprietà di aderenza può variare notevolmente tra gli isolati 10,14. Curve di crescita di pneumococchi e S. salivarius sono stati eseguiti per determinare fase mid-log e concentrazione stima (unità formanti colonie o CFU / ml) di densità ottica (OD, Figura 1). Si raccomanda di esaminare crescita conteggio e OD valida per ogni isolato prima dell'uso nel saggio. Questa analisi può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con impianti di coltura di tessuti standard e attrezzature. In questo protocollo, gli effetti di tre dosi di S. salivarius somministrato 1 ora prima dell'aggiunta di pneumococchi sull'aderenza di S. pneumoniae PMP843, un sierotipo 19F carrozza isolato derivata da un tampone nasofaringeo, sono esaminati. Due modi diversi di quantificare pneumococchi aderenti sono presentati: placcatura su agar sangue per scoraggiareil mio conte vitali, e l'estrazione del DNA e la rilevazione del pneumococco LYTA gene da qPCR 15. Il protocollo di base saggio aderenza può essere facilmente modificato per testare diverse dosi o tempo di somministrazione di probiotici e può essere utilizzato anche con altri ceppi batterici o specie.

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Protocol

1. Preparazione delle cellule epiteliali e batteriche

  1. Scongelamento dei CCL-23 cellule epiteliali
    1. Preriscaldare Minimum Essential media (MEM) contenente 10% siero fetale bovino (FBS) in un bagno d'acqua a 37 ° C per ~ 30 min.
    2. Sterilizzare l'armadio biosicurezza cultura approvato tessuto con luce UV per almeno 10 minuti prima dell'uso, e pulire l'area di lavoro con il 70% di etanolo. Pulire la bottiglia mezzi riscaldato con il 70% di etanolo e posto in armadietto biosicurezza.
    3. Usando una pipetta 25 ml, trasferire 14 ml di mezzo in un matraccio T-75. Porre pallone nel 37 ° C incubatore mentre le cellule sono sciolgono (paragrafo 1.1.4).
    4. Rimuovere una fiala di CCL-23 cellule di stoccaggio di azoto liquido mediante opportune misure di sicurezza e caldo in un bagno di acqua a 37 ° C fino a ~ 80% scongelati.
    5. Ritorno il pallone preparato in sezione 1.1.3 per l'armadio biosicurezza. Pulire la superficie esterna del flacone di CCL-23 cellule con etanolo al 70% e contenuto di trasferimento (1 ml) in T-75 Pallone con una pipetta P1000.
    6. Incubare la beuta su un lato a 37 ° C, 5% CO 2, 95% umidità relativa tessuto cultura incubatore notte (16-20 ore).
    7. Controllare le cellule al microscopio per confermare una morfologia sano, rimuovere il supporto e sostituire con 15 ml freschi, preriscaldata MEM + 10% FBS.
  2. Manutenzione di CCL-23 cellule epiteliali
    1. Una volta che le cellule sono ~ 80% confluenti (1-2 giorni), il passaggio rimuovendo multimediale utilizzando una pipetta 25 ml e lavare delicatamente le cellule due volte con 8-10 ml preriscaldata tampone fosfato (PBS) usando una pipetta 10 ml.
    2. Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di soluzione sterile 0,25% tripsina-EDTA (0,25% (w / v) tripsina, 0,1 mM EDTA). Ruotare pallone su un fianco, ruotare garantire tripsina copre lo strato confluente di cellule, e incubare la beuta per 2-3 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
    3. Pallone di tornare al cabinet biosicurezza, aggiungere 9 ml preriscaldata MEM + 10% FBS, e pipetta su e giù 6 -8x per risospendere le cellule, espellere liquido verso il lato del matraccio a staccare le cellule.
    4. Celle divise 1:15 (1 ml + 14 ml MEM + 10% FBS) o 1:30 (0,5 ml + 14,5 ml MEM + 10% FBS), scartano cellule in eccesso, e ritornano pallone 37 ° C, 5% CO 2 incubatore.
    5. Passaggio cellule almeno due volte prima di usare nel saggio aderenza. Tipicamente le cellule vengono suddivisi ogni 3-4 giorni.
  3. Semina del CCL-23 cellule epiteliali (un giorno prima rispettare nell'ambito del dosaggio, protocollo 2)
    1. Split cellule confluenti, come descritto nelle sezioni 1.2.1-1.2.3, risospensione in MEM preriscaldata + 5% FBS (concentrazione di FBS si abbassa per ridurre la probabilità di componenti del siero che interferiscono nel dosaggio). Rimuovere 20 ml di cellule e contare utilizzando trypan colorazione blu e un emocitometro.
    2. Diluire le cellule nel preriscaldata MEM + 5% FBS ad una concentrazione di 1,5 x 10 5 cellule / ml in una provetta sterile da 50 ml.
    3. Seme 1 ml di cellule / pozzetto in un tessuto-Coltura trattata piastra da 24 pozzetti.
  4. Preparazione di batteri
    Questa procedura può essere seguita per la preparazione di pneumococchi e S. salivarius. Mezzi di crescita batterica è solitamente conservata in un incubatore a 37 ° C durante la notte per Preriscaldare e prova di sterilità (generalmente appare torbida se contaminata).
    1. Due giorni prima, a rispettare saggio, batteri striscia a cavallo del sangue agar (HBA) piastre e incubare a 35-37 ° C e 5% di CO 2 per 18-24 ore. Agar sangue di montone può essere utilizzato in alternativa.
    2. Il giorno seguente, preparare una coltura durante la notte per ciascuna specie batteriche pipettando 10 ml Todd-Hewitt Broth con 0,5% di estratto di lievito (THB + YE) medio in una provetta sterile da 30 ml. Utilizzando un ciclo 10 microlitri, inoculare circa 10-12 colonie ben separate. Brevemente vortex e incubare a 35-37 ° C e 5% di CO 2 per 14-16 ore. Si noti che pneumococchi si autolyze se lasciato troppo a lungo in brodo di coltura.

    2 Aderenza saggio:. Aggiunta di batteri di monostrati di cellule epiteliali

    1. Preparazione di mid-log colture batteriche di pneumococchi e S. salivarius
      1. Pipettare 10 ml di preriscaldata THB + YE in ciascuno dei due sterili da 30 ml tubi, uno pneumococchi etichettati e l'altro S. salivarius.
      2. Per raggiungere fase di mid-log, pneumococchi richiede ~ 3 ore e S. salivarius richiede ~ 2 ore di incubazione (vedi Figura 1). Inizia entrambe le culture allo stesso tempo. Vortex (3-5 sec) colture batteriche durante la notte e aggiungere 100 microlitri pneumococchi e 100 microlitri S. salivarius in tubi corrispondenti.
      3. Brevemente vortex e incubare le colture a 37 ° C per circa 2 ore per S. salivarius e 3 ore per pneumococchi.
    2. Preparazione del CCL-23 cellule per saggio aderenza
      1. Utilizzando un microscopio invertito, controllare la piastra a 24 pozzetti per confluent Monostrati con morfologia delle cellule sane. Monostrati dovrebbero essere> 80% confluenti, senza evidenza di aggregazione delle cellule o degli effetti citopatici come arrotondamento cella o perdita di aderenza (vedi Figura 2).
      2. Rimuovere il supporto in ciascun pozzetto utilizzando una pipetta di trasferimento, inclinando leggermente la piastra per non disturbare il monostrato cellulare.
      3. Per lavare delicatamente le cellule, aggiungere ~ 500 microlitri di PBS preriscaldata in ogni pozzetto con una pipetta sierologica e rimuoverlo con una pipetta di trasferimento, inclinando leggermente la piastra. Eliminare il PBS. Ripetere fase di lavaggio una volta.
      4. Aggiungere 500 ml di MEM preriscaldata + 5% FBS in ogni pozzetto. Riportare la piastra a 24 pozzetti per la CO 2 incubatore durante la preparazione delle colture batteriche.
        Nota: Per determinare l'esatto numero di cellule CCL-23 per la molteplicità di infezione (MOI), due pozzetti possono essere tripsinizzate e contate il giorno di infezione.

    3. Assay Aderenza

    1. Aggiungi pneumococchi ail CCL-23 celle in un MOI ~ 10:01. Verificare le condizioni elencate nella Tabella 1 in pozzetti duplicati.
      1. Misurare la densità ottica a 600 A (OD) di 1 ml di S. cultura salivarius. OD deve essere compresa tra 0,3-0,6.
      2. Trasferire 5 ml di S. cultura salivarius in una provetta da 10 ml e centrifugare a 1870 xg per 4 min.
      3. Scartare il surnatante e si basa sulla lettura OD nella sezione 3.1.1, risospendere S. salivarius in 200-1000 ml di NaCl 0,85% (concentrazione finale ~ 1,5 x 10 9 UFC / ml). Come regola generale, un diametro esterno di 0,375 verrà risospeso in 260 ml. Preparare 1:10 e 1:100 diluizioni di S. salivarius utilizzando 0,85% NaCl.
        Nota: In totale, tre concentrazioni (in rappresentanza alta, media e basse dosi) di S. salivarius sarà testato nel saggio. La dose elevata è un rapporto di ~ 10 S. salivarius: 1 pneumococchi, il mezzo è ~ 1 S. salivarius: 1 pneumococchi, e il basso è ~ 1 S. salivarius: 10 pneumococchi.
      4. Estrarre la piastra a 24 pozzetti da incubatore.
      5. Dai pozzetti di controllo eparina, rimuovere 40 microlitri di media ed aggiungere 50 ml di eparina (1.000 U / ml di brodo di concentrazione) per una concentrazione finale di 100 U / ml.
      6. Aggiungere 10 ml di 0,85% NaCl per pozzetti contenenti solo CCL-23 cellule e pozzetti contenenti CCL-23 cellule e pneumococchi (senza S. salivarius).
      7. Aggiungere 10 ul di non diluito, 1:10 e 1:100 di S. salivarius a rispettivi pozzetti.
        Nota: S. salivarius può anche essere aggiunto al tempo stesso come pneumococchi (coaddition) o 1 ora dopo pneumococchi (post-addizione) per esaminare l'effetto del tempo di somministrazione probiotico.
      8. Centrifugare la piastra da 24 pozzetti a 114 xg per 3 min a favorire il contatto batterica con lo strato di cellule e incubare per 1 ora a 37 ° C, 5% CO 2.
      9. Effettuare diluizioni seriali della S. salivarius magazzino in 0,85% NaCl e piastra su duplicato HBApiastre per conte vitali. In primo luogo, aggiungere 50 ml di stock da 450 ml di 0,85% NaCl per fare una diluizione 10 -1, poi impulsi vortice (5 sec), punte di cambiamento, e aggiungere 50 ml di diluizione 10 -1 a 450 ml di 0,85% NaCl per fare una diluizione 10 -2 e così via fino a 10 -7.
      10. Piatto 100 ml di 10 -5, 10 -6, -7 e 10 diluizioni in duplicato su piastre HBA e si sviluppa con una spatola sterile. Incubare le piastre HBA invertiti notte a 37 ° C, 5% di CO 2.
      11. Verso la fine dell'incubazione 1 hr, ripetere sezioni 3.1.1-3.1.3 per pneumococchi. DO deve essere compresa tra 0,2-0,7. Centrifugare 1 ml di coltura pneumococcica e risospendere il pellet in 300-2,000 ml di NaCl 0,85% (in base alla lettura OD) ad una concentrazione di circa 1,5 x 10 8 UFC / ml. Come regola generale, un diametro esterno di 0,3 sarà risospeso in 500 microlitri.
      12. Dopo 1 ora di incubazione con S. salivarius, aggiungere 10 μ; L pneumococchi non diluito a tutti i pozzetti tranne pozzetti di controllo negativo (contenenti cellule solo).
      13. Centrifugare la piastra da 24 pozzetti a 114 xg per 3 min e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 3 ore. Eseguire la diluizione seriale del pneumococchi magazzino in 0,85% NaCl come descritto nella sezione 3.1.9 e le diluizioni piatto 10 -4, 10 -5 e 10 -6 su piastre HBA duplicati per conteggi vitali.
    2. Dopo 3 ore, controllare le cellule al microscopio per assicurare che monostrati aspetto sano (vedi figura 2). Rimuovere il supporto di ogni bene e delicatamente lavare le cellule 3x come descritto nella sezione 2.2.3. usando una pipetta diverso per ogni condizione. Questo passaggio è essenziale eliminare pneumococchi nonadherent. I monostrati non dovrebbero sfaldi durante il processo di lavaggio; questo può essere confermata controllando nuovamente al microscopio.

    Nota: Supporto rimosso durante questa fase può essere conservato a -20 ° C per ulteriori analisi (<em> ad es misurazione dei livelli di citochine).

    1. Aggiungere 200 ml di 0,1% digitonina (un detergente delicato) a ciascun pozzetto ed incubare per 7 minuti a 37 ° C, 5% CO 2.
    2. Aggiungere 800 ml di THB media per ciascun pozzetto. Lisare le cellule pipettando su e giù, e, se necessario, raschiare pozzetti 3-4x con la punta della pipetta per assicurarsi che il monostrato cellulare viene completamente rimosso. Cambiare punte tra pozzi.
    3. Rimuovere il contenuto da ogni pozzetto con una pipetta P1000 e trasferire nelle provette per microcentrifuga con etichetta.

    4. Quantificazione dei Aderente pneumococchi

    Pneumococchi aderente può essere quantificata determinando conte vitali (diluizione seriale e placcatura su agar sangue) o quantitativa real-time PCR.

    1. Metodo Conta vitale
      Questo metodo deve essere eseguita immediatamente dopo passo 3.5 del dosaggio aderenza.
      1. Per ogni pozzetto analisi, preparare diluizioni seriali dei campioni raccolti inpunto 3.5 del dosaggio aderenza aggiungendo 50 ml di campioni da 450 ml di 0,85% NaCl, impulso vortex, e diluizioni seriali come descritto nella sezione 3.1.9 fino alla diluizione 10 -6.
      2. Piatto 100 ml di 10 -3, -4, 10 10 -5, e 10 -6 diluizioni in duplicato su agar sangue, si sviluppa con una spatola sterile e incubare le piastre capovolte notte a 37 ° C, 5% di CO 2. Notare che i pozzetti contenenti CCL-23 celle da solo non devono contenere batteri e possono essere placcati ordinata (100 ml non diluito) come controllo di sterilità.
      3. Il giorno seguente, determinare il inoculi pneumococcico contando le colonie sulle piastre di diluizione appropriate (contenenti 30-300 colonie) preparati in sezione 3.1.13 del dosaggio aderenza. Calcolare il CFU / ml di inoculo utilizzando il valore medio da due piastre. Analogamente, determinare il S. salivarius inoculi per conteggio delle colonie sulle piastre preparatenella sezione 3.1.10.
        Nota: Le piastre devono contenere solo pneumococchi; la presenza di altre specie indica che il test è stato contaminato e risultati non sono validi.
      4. Per determinare i livelli di aderenza pneumococco, conta la piastra di diluizione appropriata (contenente 30-300 colonie pneumococco) per ogni campione preparato nella sezione 4.1.1. Si noti che S. colonie salivarius saranno piccoli e nero, mentre pneumococchi sarà dovuto piatta e verde di α-emolisi, come mostrato nella Figura 3. Per calcolare l'adesione pneumococcica, normalizzare il numero di pneumococchi aderente dalla condizione b. CCL-23 celle + pneumococchi al 100% e confronta i pneumococchi aderente da altre condizioni a questa condizione.
    2. metodo qPCR
      I campioni raccolti in aderenza Assay passo 3.5 possono essere conservati a -20 ° C fino estrazione del DNA. Estrazione del DNA viene eseguita utilizzando un kit commerciale e descritto nelle sezioni 4.2.1-4.2.9 e la qPCR comedire in sezioni 4.2.10-4.2.20.
      1. Preparare enzimatica Lysis buffer (50 mM tampone fosfato pH 6,7 contenente 1 mg / ml lisozima, 0,075 mg / ml mutanolysin, e 2 mg / ml proteinasi K). La ricetta che segue può essere utilizzata rendere 10 ml (sufficiente per 50 estrazioni). Tampone di lisi enzimatica dovrà essere preparata prima dell'uso.

        7.25 ml di soluzione di 50 mM tampone fosfato (pH 6.7)
        1,00 ml di 10 mg / ml di brodo lisozima per una finale [1 mg / ml]
        0,75 ml di 1 mg / ml mutanolysin magazzino per finale [0,075 mg / ml]
        1,00 ml di 20 mg / ml proteinasi K magazzino per finale [2 mg / ml]
      2. Scongelare i campioni in ghiaccio oa 4 ° C. Vortex e il trasferimento di aliquote di 100 ml di ogni campione in provette per microcentrifuga con etichetta. Ritorno campioni originali indietro nel -20 ° C freezer.
      3. Centrifugare i campioni a 6.700 xg per 10 min.
      4. Rimuovere e scartare il surnatante. Aggiungere 200 ml di tampone di lisi enzimatica al pellet e vortex per risospendere. Incubmangiato i campioni a 56 ° C per 30 min. Centrifugare brevemente (5 sec) a 6.700 xg per raccogliere il liquido sul fondo della provetta.
      5. Aggiungere 10 ml di 20% SDS per completare la lisi cellulare e mescolare delicatamente a temperatura ambiente per 2 min.
      6. Aggiungere 4 ml di RNase A (100 mg / magazzino ml) e mescolare delicatamente (su una sedia a dondolo o invertendo i tubi) a temperatura ambiente per 2 min.
      7. Aggiungere 200 ml di tampone AL (da kit) e vortex per 15 sec. Incubare i campioni a 70 ° C per 10 min. Centrifugare brevemente (5 sec) a 6.700 xg per raccogliere il liquido sul fondo della provetta.
      8. Aggiungere 200 ml di 100% EtOH e vortex per 15 sec. Centrifugare brevemente per raccogliere il liquido sul fondo della provetta, poi trasferire il composto (compreso l'eventuale precipitato) alla colonna di spin (in un tubo di raccolta 2 ml) senza bagnare il bordo. Seguire i passaggi di lavaggio a seconda del il protocollo del produttore (non mostrato qui).
      9. Per eluire il DNA, trasferire colonna in una provetta per microcentrifuga con etichetta, aggiungere 50 ml di tampone AE (frkit om), e incubare a temperatura ambiente per 2 min. Centrifugare a 4.300 g per 1 min. Ripetere una volta per un volume finale di 100 microlitri di eluizione. Il DNA può essere conservato a -20 ° C fino all'utilizzo.
      10. Per eseguire qPCR, sterilizzare le cappe con luce UV per 15 minuti prima di iniziare. Preparazione di una piastra a 96 pozzetti map foglio di lavoro per registrare le posizioni e per ogni campione è raccomandato.
      11. Preparare curva standard utilizzando un / magazzino ml 10 ng di DNA genomico da pneumococco (estratto dal ceppo di riferimento ATCC 6305).
        1. Scongelare pneumococco magazzino DNA e spin down brevemente (5 sec) in una centrifuga da tavolo.
        2. Eseguire 01:10 diluizioni seriali in 6 provette per microcentrifuga prelabeled con l'aggiunta di 3 ml di DNA a 27 microlitri priva di nucleasi H 2 O, cambiando suggerimenti e vortex tra ogni diluizione. La serie diluizione finale è composta da 6 tubi: 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 e 0.00001 ng / ml.
          Nota: Questi possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di una settimana.
      12. Prepae Lyta MASTERMIX come segue in una sterile tubo da 15 ml in una cappa sterile PCR. Scongelare componenti su ghiaccio e vortex immediatamente prima dell'uso. et al.15 e sono mostrati nella lista dei materiali.
      13. Vortex e carico 23 microlitri / pozzetto della LYTA mescolano nei pozzetti appropriati. Fare riferimento alla targa mappa.
      14. Piastra Trasporti per modello area aggiunta (preferibilmente un armadio sterile in una stanza separata) per caricare il campione.
      15. Utilizzare una pipetta P2 per caricare campioni, cambiando suggerimenti per ogni bene. Tutti i campioni vengono eseguiti in duplicato. Fare riferimento alla targa mappa per la posizione.
      16. Per i pozzi curva standard, aggiungere 1 ml / pozzetto della diluizione appropriata di DNA curva standard più 1 ml / pozzetto H 2 O per portare il volume finale di 25 microlitri.Per non pozzetti di controllo del modello, aggiungere 2 ml H 2 O.
      17. Aggiungere 2 ml / pozzetto di DNA campione nei pozzetti appropriati.
      18. Cap tutti i pozzetti in uso. Rendere sicuri i tappi sono chiusi comodamente. Girare rapidamente la piastra PCR (5 sec) prima di caricare la piastra in una macchina PCR real-time.
      19. Piatto di carico in PCR macchina ed eseguire qPCR secondo le istruzioni fornite dal costruttore della macchina. Si raccomandano le seguenti sonda condizioni di ciclo di idrolisi:
        20. componente per reazione x 102 (piatto pieno)
        LYTA F 0,25 ml di 10 mM magazzino 25.5 ml
        LYTA R 0,25 ml di 10 mM magazzino 25.5 ml
        Sonda LYTA 0,5 ml di 10 mM magazzino 51 microlitri
        H 2 O 9.5 microlitri 969 microlitri
        Master mix 12.5 ml 1.275 pl
        Volume finale 23 microlitri 2346 microlitri
        Fase 1 (1x): 3 min a 95 ° C
        Passo 2 (40x): 20 sec a 95 ° C
        20 sec a 60 ° C
      20. Raccogliere i dati e quantificare il DNA pneumococco utilizzando la curva standard. Cariche batteriche sono calcolate come descritto in precedenza 17, stimando che 1 pg di DNA genomico è equivalente a 447,4 cellule, e segnalato come UFC / ml (assumendo one genoma per ogni CFU, e una copia del LYTA per genoma; vedere Figura 4). Per un saggio di successo, il valore di R 2 deve essere ≥ 0,98 e tutti i risultati positivi all'interno della gamma della curva standard (cT valori inferiori a quello ottenuto per il ng 0,00001 / pl punto curva standard sono considerati sfondo / LYTA negativo).
        Nota: alcuni sistemi PCR in tempo reale sono dotati di software di analisi che può essere usato per costruire curve standard e calcolare incognite. Altrimenti, questi calcoli possono essere eseguiti in Excel o programmi simili. Una curva standard esempio è mostrato in Figura 4.
      21. Per calcolare l'adesione pneumococcica, normalizzare il numero di pneumococchi aderente dalla condizione di b. CCL-23 celle + pneumococchi al 100% e confronta i pneumococchi aderente da altre condizioni a questa condizione.

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Representative Results

I risultati di un esperimento rappresentativo in cui pneumococchi (S. pneumoniae PMP843, un colonizzando 19F isolare) sono stati aggiunti al CCL-23 cellule 1 ora dopo l'aggiunta di S. salivarius, e l'adesione pneumococcica è stata quantificata sia conta vitale e Lyta qPCR sono mostrati in Tabella 2. risultati erano coerenti tra i due metodi sia per il numero assoluto di batteri (presentato come CFU / ml) e l'aderenza%, normalizzato al numero pneumococchi di aderente nei pozzetti contenenti pneumococchi solo. L'eparina viene usato come controllo, come è noto per inibire l'adesione pneumococcica e quindi l'aderenza ridotta nel pneumococchi + condizione di eparina (tipicamente <40% rispetto alla sola pneumococchi) è indicativa di un dosaggio efficace. S. salivarius inibisce l'adesione pneumococcica in modo dose-dipendente, come mostrato nella Tabella 2, dove l'alta concentrazione di S. salivarius (approssimativaly 10 S. salivarius: 1 pneumococchi) ha provocato la più bassa aderenza pneumococcica.

La Figura 5 mostra l'aderenza dei pneumococchi a CCL-23 cellule quando S. salivarius viene aggiunto 1 ora prima pneumococchi (preaddition), contemporaneamente (coaddition), o 1 ora dopo pneumococchi (post-aggiunta). S. salivarius è più efficace nell'inibire l'adesione pneumococcica quando aggiunto prima pneumococchi, come entrambe le dosi di alta e media di S. salivarius ridotto significativamente adesione pneumococcica nel saggio preaddition (Figura 5A), mentre solo la dose elevata di S. salivarius inibito l'adesione pneumococcica nel coaddition e test post-addizione (Figure 5B e 5C).

I dati riportati nella tabella 2 e figure 4 e 5 sono stati ottenuti utilizzando una versione precedente di primer LYTA qPCR e sonda 17. L'attuale protocollo descrive il saggio qPCR aggiornato.

Figura 1
Figura 1. Curve di crescita rappresentativi di S. pneumoniae PMP843 (A) e S. salivarius K12 (B). Per ogni specie CFU / ml determinato mediante conteggio vitale appare in bianco (sinistra asse y), e la densità ottica (OD) a 600 nm viene mostrata in grigio (asse y di destra). Mid-log fase è stata stimata mediante conteggio praticabile per essere di 3 ore per S. pneumoniae PMP843 e 2 ore per S. salivarius K12. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Figura 2. Esempi di sani CCL-23 cellule e CCL-23 cellule con effetto citopatico (CPE). A) Esempio di un sano, monostrato confluente di CCL-23 cellule. B) CCL-23 cellule con effetti citopatici. Nota arrotondamento delle cellule, regioni intracellulari luminosi, e le aree di monostrato perturbato in cui le cellule hanno tolto il piatto. Le immagini sono state scattate con un microscopio invertito a 200 ingrandimenti. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 3
Figura 3. S. salivarius e le colonie pneumococco su agar sangue di cavallo. S. colonie salivarius sono piccoli e bianchi, come indicato dal biancofreccia e la lettera A. pneumococco (S. pneumoniae) colonie sono generalmente più grandi, più piatta, e verdastro, come indicato dalla freccia bianco e lettera B. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 4
Figura 4. Esempio S. curva standard pneumoniae per qPCR. calcoli di DNA genomico sono presenti con valori Ct (media dei duplicati pozzi curva standard da un saggio rappresentante qPCR *), con il valore risultante standard di curva, equazione, e R 2 mostrato sul grafico. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

Figura 5 content-width = "6in" src = "/ files/ftp_upload/51069/51069fig5highres.jpg" width = "600" />
Figura 5. Effetto di S. salivarius sull'adesione pneumococcico CCL-23 cellule aderenza pneumococcico CCL-23 monostrati di cellule quando le cellule sono state incubate con pneumococchi solo. (Pnc; normalizzata a 100%), con pneumococchi e 100 U / ml di eparina (eparina), o con pneumococchi e S. salivarius aggiunto in un rapporto di circa 10: S. salivarius: 1 pneumococchi (alto), ~ 1 S. salivarius: 1 pneumococchi (medio), o ~ 1 S. salivarius:. 10 pneumococchi (basso) S. salivarius stato aggiunto 1 ora prima (A), allo stesso tempo come (B), o 1 ora dopo pneumococchi (C). n ≥ 3, * indica P <0,05 rispetto al pneumococchi soli (test t di Student). Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita .

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Gruppo Condizioni Assay Note
La CCL-23 solo le cellule
B CCL-23 cellule + pneumococchi
C CCL-23 cellule + pneumococchi + eparina Blocchi eparina adesione pneumococcica di superficie cellulare glycosylaminoglycans 16 e viene utilizzato come controllo
D CCL-23 cellule + pneumococchi + S. salivarius [alta] Circa 1 pneumococco: 10 S. salivarius
E CCL-23 cellule + pneumococchi + S. salivarius [med] Circa 1 pneumococco: 1 S. salivarius
F CCL-23 cellule + pneumococchi + S. salivarius [basso] Circa il 10 pneumococco: 1 S. salivarius


Tabella 1. Condizioni testate in pneumococcico saggio di aderenza. Le sei condizioni di analisi di base sono descritte qui.

6
Condizioni Assay * CFU / ml Pnc (qPCR) % Aderenza (qPCR) CFU / ml Pnc (conta vitale) % Di aderenza (conta vitale)
Solo Pnc 1.1 x 10 7 100 9.1 x 10 6 100
Pnc + eparina 1,5 x 10 6 14 7,6 x 10 5 8
Pnc + Sal [alta] 6,1 x 10 5 6 3,2 x 10 5 4
Pnc + Sal [Med] 3,6 x 10 6 33 2,7 x 10 6 29
Pnc + Sal 9.8 x 10 6 92 90

Tabella 2: aderenza pneumococcico CCL-23 cellule dopo l'aggiunta di S. salivarius come determinato dalla LYTA qPCR e il metodo di conteggio praticabile * Pnc = pneumococchi.; Sal = S. salivarius; [Alta] = circa 10 Sal: 1 Pnc; [Med] = circa 1 Sal: 1 Pnc; [Basso] = circa 1 Sal: 10 Pnc.

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Discussion

Una parte critica di questo saggio è l'aggiunta concentrazioni appropriate di S. salivarius e pneumococchi nelle sezioni 3.1.7 e 3.1.12. Le concentrazioni sono stimate utilizzando le letture di OD, ma l'inoculo esatto non sono determinati fino piastre vengono conteggiati il ​​giorno seguente. Per questo motivo, si consiglia di eseguire curve di crescita per misurare OD e conta vitali (CFU / ml) nel tempo per tutti i ceppi batterici utilizzati nel test per identificare la fase di mid-log e assistere nella stima di concentrazione da OD. Inoltre, ceppi di pneumococco possono differire sostanzialmente le loro proprietà di aderenza. Ceppi con buona aderenza (> 10% di inoculi aderire alle cellule epiteliali dopo una incubazione di 3 ore) sono raccomandati per i saggi che indagano la capacità dei probiotici di inibire l'adesione pneumococcica. Anche se effettuata da un operatore esperto, livelli di aderenza possono variare dosaggio a dosaggio, come evidenziato dai relativamente grandi barre di errore mostrato nella figura 5. Perquesto motivo si consiglia un minimo di tre ripetizioni per ogni esperimento, con pozzetti duplicati per ogni condizione di test. Variabilità simile è stata riportata nei test di aderenza utilizzando Escherichia coli 18. In questo protocollo, le cellule vengono incubate per 3 ore dopo l'aggiunta di pneumococchi. Il tempo di incubazione può essere ridotto se esperimenti corso aderenza tempo vengono eseguite e mostrano che la maggior parte dei batteri aderire durante la prima ora di incubazione.

Questo protocollo presenta due metodi per quantificare l'adesione pneumococcica, qPCR e il conteggio vitale. Entrambi i metodi sono adatti, e la scelta dipende dalle preferenze e disponibile laboratorio attrezzature dell'operatore (accesso ad una macchina PCR in tempo reale). Quantificazione mediante conteggio vitale è un metodo a basso costo, che non richiede reagenti aggiuntivi o una macchina PCR in tempo reale. Tuttavia, usa molti piatti (tipicamente 80 piastre di saggio 12-well) e deve essere eseguita immediatamentely alla fine del test, e contando le colonie pneumococco può essere difficile su piastre contenenti una grande quantità di S. salivarius. Quantificazione da qPCR è più costoso e richiede una fase di estrazione del DNA lunga, ma i campioni possono essere congelati e trasformati in lotti, aumentando l'efficienza. Il DNA estratto può essere utilizzato anche per altri scopi, come qPCR rilevamento di aderente S. salivarius. Se indagando S. salivarius aderenza, si consiglia di includere pozzi con CCL-23 cellule più S. salivarius (senza pneumococchi) e pozzi con CCL-23 cellule più S. salivarius e eparina controlli supplementari.

Il test di base può essere adattato anche per studiare altri aspetti scientifici della colonizzazione. Per esempio, l'effetto di probiotici sulla produzione di citochine può essere valutata memorizzando e analizzando surnatanti di cellule. Il dosaggio può anche essere modificato per esaminare invasione batterica piuttosto che da aderenzaincubando le cellule con la membrana cellulare antibiotici impermeabili per uccidere i batteri extracellulari precedenti il ​​raccolto e le cellule di lisi. Come descritto qui, il test non distingue tra aderente e invasiva (interiorizzato) pneumococchi. Tuttavia, studi precedenti hanno trovato i livelli di pneumococchi internalizzata essere molto piccolo (tipicamente ≤ 0,01% di inoculi) 10 così per la maggior parte degli isolati (compresi PMP843), la stragrande maggioranza dei pneumococchi associato alle cellule aderenti sono piuttosto internalizzato. Ulteriori applicazioni includono prove altre specie probiotiche per la capacità di inibire la colonizzazione, e / o cercando in ceppi batterici mutanti per studiare il ruolo di specifici geni di interesse.

Un limite evidente di questo saggio in vitro è che non include un epitelio stabilita, cellule immunitarie, flora normale, o altri fattori che influenzano probabile colonizzazione pneumococcica in vivo. Per valutare appieno se probiotici could essere utile nel prevenire la colonizzazione dei patogeni del tratto respiratorio, in studi in vivo utilizzando modelli animali e studi clinici umani sono garantiti. Tuttavia, saggi di aderenza in vitro servono come schermo utile per identificare probiotici con il potenziale di inibire l'adesione pneumococcica e possono fornire informazioni sulle strategie di dosaggio preferenziali, oltre a fornire un modello sperimentale che può essere utilizzato per studi meccanicistici.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Murdoch Childrens Research Institute e Operational Support Program infrastrutture del Governo del Victoria.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Media (MEM) Thermo Fisher Scientific SH30244.01  
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific SH30084.03  
T-75 Flask Nunc 156472  
CCL-23 cells ATCC CCL-23  
Trypsin Life Technologies 15090046  
24-well Cell culture plate Nunc 142475  
Horse blood agar (HBA) plates Oxoid PP2001 Sheep blood agar plates also acceptable
Todd-Hewitt Broth Oxoid CM0189  
Yeast Extract Beckton Dickinson 212750  
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG  
Disposable cuvettes Kartell 1938  
Heparin Pfizer 2112105 comes in sterile ampules at 5,000 IU/5m/ 
Sterile spreader Technoplas S10805050 alternatively, a glass spreader can be dipped in 96% ethanol and flame sterilized before each use
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876  
Mutanolysin Sigma-Aldrich M9901  
Proteinase K Qiagen 19133  
SDS 20% solution Ambion AM9820  
RNase A Qiagen 19101  
QIAamp DNA mini-kit (250) Qiagen 51306  
LytA F primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA
LytA R primer Sigma-Aldrich Custom made 5' -> 3' sequence  TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT
LytA probe Eurogentec Custom made 5' -> 3' sequence Cy5-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-BHQ3, alternative fluorophores can be used
Nuclease free water Ambion AM9906  
Brilliant III Ultra Fast QPCR mastermix Agilent Technologies 600880  
Thermo-Fast 96 Detection plate  Thermo Fisher Scientific AB-1100  
Ultraclear qPCR cap strips Thermo Fisher Scientific AB-0866  
Mx3005 QPCR System Agilent Technologies 401449  
*alternative sources are available for most/all products listed  

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References

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Immunologia Numero 86 Gram-positivi infezioni batteriche polmonite batterica malattie polmonari infezioni delle vie respiratorie, L'aderenza la colonizzazione probiotici,
Indagare gli effetti dei probiotici sul pneumococcico colonizzazione utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Aderenza Assay
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Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M.,… More

Dunne, E. M., Toh, Z. Q., John, M., Manning, J., Satzke, C., Licciardi, P. Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay. J. Vis. Exp. (86), e51069, doi:10.3791/51069 (2014).

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