Summary
Amphipod Parhyale hawaiensis kabuklu embriyoloji ve karşılaştırmalı eklembacaklı gelişim ve evrim çalışmaları için umut verici bir model organizmadır. Bu protokol Parhyale erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerin elle çıkarılması için bir yöntem tarif eder.
Abstract
Amphipod Parhyale hawaiensis dünya çapında tertidal deniz habitatlarda bulunan küçük kabuklu olduğunu. Geçtiğimiz on yıl içinde, Parhyale iyi okudu eklembacaklı model organizma Drosophila melanogaster yararlı bir dışgrup karşılaştırma sağlayarak, geliştirme laboratuar çalışmaları için umut verici bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Drosophila sinsityal bölünmeler aksine, Parhyale erken yarılmış holoblastic bulunmaktadır. Erken blastomerlerin enjekte tracer boyalar kullanılarak kader eşleme her üç germ tabakaları ve germ hattı sekiz-hücre aşamasına göre kurulan göstermiştir. Bu aşamada, üç blastomerler ektoderm doğuran mahkum olan, üç mezoderm doğuran mahkum ve geri kalan iki blastomerler sırasıyla endoderm ve mikrop hattının ön vardır. Ancak, blastomer ablasyon deneyler Parhyale embriyoları da önemli düzenleyici capabiliti sahip olduğunu göstermiştirsekiz hücreli aşamada ablasyon Blastomerlerin kaderi kalan blastomerlerin bazı soyundan tarafından satın alınabilir es, öyle ki. Enjeksiyon ve fototoksik boyalar ya da manuel ablasyon sonraki aktivasyonu: Blastomer ablasyon daha önceleri, iki yöntemden biri ile tarif edilmiştir. Ancak, photoablation blastomerlerdir öldürür ama embriyo ölü hücre gövdesi kaldırmaz. Belirli blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması bu nedenle bazı uygulamalar için ablasyon tercih edilen bir yöntem olabilir. Burada canlı ve sağlam kalan blastomerlerdir tutarken hücre gövdesinin tamamen çıkarılması için gerekli olan araçları ve manuel işlemleri gösteren, Parhyale embriyoların sekiz-hücre evresinden itibaren bir blastomerlerin elle çıkarılması için bir protokol mevcut. Bu protokol, sekiz hücre evresinde veya diğer yarılma erken aşamalarında blastomerlerin için bir Parhyale hücreye uygulanabilir. Buna ek olarak, prensip olarak, bu protokol erken Clea için geçerli olabilirDiğer holoblastically yaran Omurgasız deniz vage sahne embriyolar.
Introduction
Amphipod kabuklu Parhyale hawaiensis evrimsel gelişim biyolojisi araştırmalarında 1 kullanım için büyük potansiyeli olan bir gelecek vaat eden bir model organizma olarak son on yılda ortaya çıkmıştır. Meyve. D. Drosophila melanogaster uçuyordu eklembacaklılar arasında, çoğu modeli sistemleri böceklerdir ve en yaygın olarak bu okudu melanogaster böcek Diptera takımının bir üyesi olan ve bazal biçimde dallanma böceklerin 2 kişilerce ilgili olarak elde edilen bu tür görüntüler çok embriyolojik özellikler gibi. Ayrıca, böcekler böcekler pancrustaceans denilen uzun ayakta "doğal" grup içinde kendi yakın akrabaları var, yani Subphylum Pancrustacea 3 iç içe olan, ve bu grup paraphyletic olduğunu vardır. Bu ek dorsalde böcek modelleri dallanma önerir, diğer kabuklular çalışmalar gelişimsel özelliklerin evrimsel tarihinin daha geniş bir görünüm kazanmak için gerekli olan birçok iyi D. çalışılmıştır nd moleküler mekanizmalar melanogaster. Ancak, çok az kabuklular iyi gelişme deneysel laboratuar analizi için kurulmuştur. Amphipod P. hawaiensis deneysel teknikler bir dizi için uygun son derece uysal bir laboratuar model sistemidir. Amphipods kendi ana superorder Peracarida (plaj siloları, scuds, ve de karides) içinde birçok benzersiz özellikleri görüntülemek ve bu nedenle nispeten kabuklular bu grup içinde türetilmiş olduğu düşünülmektedir. Bununla birlikte, Parhyale tarafından sunulan embriyolojik ve fonksiyonel genetik manipülasyon göreli kolaylığı bu amphipod model organizmaların mevcut envanter için değerli bir katkı yapmak.
Bir laboratuar hayvanına, P. de hawaiensis bir çok avantaj sunar. Hayvanlar sıcaklık ve tuzluluk geniş bir yelpazede karşı toleranslı olan ve yapay deniz suyu 1 büyük kültürlerinde iyi hayatta. Bu betw ayırt etmek kolaydırbelirgin morfolojik farklar, çiftleşme sırasında dişi kavramak için kullanabileceğiniz Erkeklerde en önemlisi, büyük, çengel, ön gövde uzantıları dayalı een kadın ve erkekler. Embriyolojik ve gelişimsel çalışmaları için, P. hawaiensis birkaç çok çekici özelliklere sahiptir. Embryogenezis yaklaşık 10 gün sürer ve cinsel olgunluk zamanı 28 º C'de yaklaşık altı hafta (ama Parhyale yaklaşık 20-30 º C arasında değişen sıcaklıklarda iyi hayatta unutmayın, ve bu ayrıntılı gelişimsel evreleme bilgisi 18 º C'de 4 yetiştirilen embriyo için kullanılabilir , 25 º C 4, ve 26 º C 5,6). Yetişkin laboratuvarda tüm yıl boyunca dostum, yani embriyolar yılın herhangi bir zamanında kullanılabilir. Dişiler ilk birkaç bacak çifti (Şekil 1A ve 1B) arasında yer alan bir ventral kuluçka kese içine döllenmiş yumurta (dişi yaşına bağlı olarak) 2-20 koymak ve bu embriyo toplamak mümkündürkadın öldürme veya embriyolar (Şekil 1C) zarar vermeden çok erken gelişme var. Embriyolar, tarama için süzülür yapay deniz suyu içinde hayatta sonraki gen ifadesi ya da histolojik analiz 7 için sabitlenebilir, ve detaylı bir hazırlama tablo geliştirilmesi 5 boyunca ilerleme doğru belirlenmesini sağlar. Sağlam protokolleri ya da in situ hibridizasyon 8-15 4,16,17 immün olarak gen ekspresyon analizi için kullanılmıştır, ya da RNA girişim 13,15 morpholinos 12 ve sabit bir germ hattı ile fonksiyonel portatif 18, genetik dönüştürme. Transgenesis sistemi, uyarılabilir ifade 14 ve 19 yöntemleri de P. gen araştırmak üzere de kullanılabilir güçlendirici tuzağı kullanılarak hawaiensis. Kamuya açık bir genom dizisi şu anda mevcut değil ise, oogenezisin ve embriyogenez sırasında üretilen transkript içeren bir transcriptome arı vardırn de novo monte edilmiş ve 20 açıklamalı ve gen keşif kolaylaştıran, aranabilir bir veritabanında 21 yatırılır. Sonuç olarak, P. hawaiensis gelişimini anlamak için birden fazla deneysel ve genetik yaklaşımlar için uygun son derece uysal bir model organizmadır.
D. erken sinsityal bölünmeler aksine melanogaster, P. hawaiensis embriyolar holoblastically fertilizasyon (Şekil 2A), aşağıdaki bölmektedir. Köken izleme analizleri üçüncü bölünme ile, üçüncü bölme blastomerlerin her biri özel olarak üç germ tabakaların bir ya da germ hattı 6 (Şekil 2B) meydana getirmek için mahkum olduğunu göstermiştir. Bu veriler, birlikte mikroarray veri 22, hücre soy 6,23 analizleri ve blastomer izolasyon deneyleri 4 gelişimsel potansiyelleri cel asimetrik miras yoluyla en azından bazı üçüncü bölünme blastomerlere için ayrılmış olduğunu ileri sürmüşlerdirl kader belirleyici. Hücrelerin yokluğu ile gösterildiği gibi duruma göre, (Parhyale hücre soyu terminoloji 6'daki "g" olarak adlandırılır) germ hattı ön sekiz hücre aşamasında uzaklaştırılmış olan blastomere ablasyon deneylerde, embriyolar, geç gelişim evrelerinde 4 ° germ hücreleri yoksun En metazoans 24 bir germ çizgi işareti olan protein Vasa, ifade. Bunun aksine, somatik blastomere ablasyon deneyler göstermiştir ki P. hawaiensis embriyolar da önemli düzenleyici yetenekleri, sahip sekiz hücreli aşamada ablazeydi mezoderm veya ektoderm öncü blastomer kaderi kalan blastomerlerin 25 bazı torunları tarafından ele olabilir böyle. Nasıl düzenleyici hücre kaderinin yedek oluşabilir, ve somatik blastomerlere otonom hücre kaderi benimsenmesi ölçüde bilinmemektedir. Örneğin blastomere ablasyonu gibi deneysel embriyolojik teknikler Understan yararlı olabilirding göreli özerklik ve hücre kaderini belirleyen 26,27 arasında nonautonomy ve P. çalışmada ilgi bu nedenle hawaiensis embriyogenez.
Ektodermal ve mezodermal soy düzenleyici değiştirilmesini gösterdi deneylerde, blastomer ablasyon enjeksiyon 28 ve fototoksik boyaların 25 sonraki uyarılması ile yapıldı. Bu teknik enjekte blastomer (ler) öldürmede etkili olsa da, tamamen embriyo ölü hücre gövdesi kaldırmaz. Buna ek olarak, farklılıklar hücre soyu floresan soy izleyiciler 28,29 ile blastomerlerdir enjekte ederek embriyojenezin Gastrulasyon aşamalarında aracılığıyla toplanan verilerin, ve aynı embriyonik aşamalarında 23 geliştirilmesi yoluyla soğukkanlı blastomerlerdir izleyerek toplanan veriler arasında gözlenmiştir. Belirli blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması bu nedenle bazı uygulamalar için ablasyon tercih edilen bir yöntem olabilir.
Daha önce hücre soyunun sonuçlarını yayınladı tek hücreler elle 23 ablazeydi hangi embriyoların analizleri. Ancak, erken bölünme evresindeki embriyolar, tek blastomerlerdir çıkarmak için gerekli olan hassas işlemleri henüz tam olarak tarif edilmemiştir. Burada P. toplanması için bir protokol mevcut hawaiensis embriyolar ve sekiz hücreli evre embriyo tek blastomer manuel ablasyon. Bu yöntemin amacı, hücresel davranışları ve embriyogenez ve post-embriyonik gelişimi sırasında, kalan hücrelerin hücre hayati yeterliliklerinin gözlem sağlayan, embriyo, hücre gövdesinin tamamen çıkarılmasını sağlamaktır. Bizim protokol germ hattı ön g (Şekil 2C) çıkarılmasını gösterir, ancak veya daha bölünme aşamaları blastomerlerin için, sekiz-hücre aşamasında herhangi bir hücreye uygulanabilir. Prensip olarak, bu protokol tasarımlarıyla erken bölünme evresindeki embriyolar, tek hücreleri çıkarmak için uygulanabilirr holoblastically deniz omurgasız bölünmesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bazı adımları yürütülmesi faydalı olabilir görmediniz italik olarak gösterilmiştir.
1.. Gün 1: Malzemelerinin Hazırlanması
- Aşağıdaki malzemeleri (Malzeme ve Ekipmanları bkz. Tablo) hazırlayın:
- 15 cm ve 22 cm Pasteur pipetler
- Elmas kâtip
- Süzülen yapay deniz suyu 1 mg / ml Amfoterisin B (100 mg / ml stok çözeltisi 1:100), 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin (stok çözeltisi ihtiva eden 01:50 (0,0018-0,0020 arasında tuzluluk) penisilin 5000 ünite / ml streptomisin ve 5.000 mg / ml ihtiva eden)
- katkı maddesi olmadan filtrelenmiş yapay deniz suyu (0,0018-0,0020 arasında tuzluluk)
- Konut çiftler için büyük bir plastik kap (en az 15 cm x 15 cm x 5 cm)
- Sylgard ile kaplı küçük (3 cm veya 5 cm) petri
- küçük (3 cm veya 5 cm) Petri kapları
- bir gözlem ya da cam, çok oyuklu plaka
- forseps (Kullandığımız künt forseps sağa sola türetilmişbiz yanlışlıkla forseps uçları iki çatal dişleri aynı uzunlukta olduğunu, pürüzsüz olmasını sağlamak için bileme taşı bir forseps kullanarak, ve artık sahip olduğu ile değiştirdikleri diğer laboratuvar prosedürleri, hasar gören m eski Dumont # 5 forseps kindir. Böyle yeni Dumont # 5 forseps gibi son derece ince forseps, bunlar embriyo ve / veya dişileri yaralayabilir olarak istenmemektedir.)
- Sonunda bir Pasteur pipet (aşağıya adım 1.2) genişledi
- Pasteur pipet ince ucu içine gömülü ince, kavisli tungsten telinin oluşan bir embriyo alma aracı (uygulamak alternatif yerini olabilir; aşağıya 1.3 bakınız)
- küçük bir açıklığı olan bir ağız pipet (aşağıya adım 1.4)
- Bir cam kapiller çekti yapılmış bir cam iğne (aşağıya adım 1.5 'e bakınız)
- Daha sonra genişletilmiş Pasteur pipet, pipet, bir elmas çizici ile dar parmaklarını korumak için bir Kimwipe'dan veya kağıt havlu pipet attı bölgeyi sarmak başlar noktada 15 cm Pasteur pipeti etrafında ilk puanını ve dikkatle yapmak için skor çizgisinde ucunu kırın. Kenarlarını düzeltmek için birkaç saniye için bir Bunsen beki alev üzerinde pipet kırık ucunu tutun. Açılış pipet maksimum genişliğinden az daha dar olmalıdır.
- Tungsten tel kesme aletini yapmak için, 15 cm cam Pasteur pipet ucunu bir tungsten teli ve cam eritmek için bir Bunsen beki alev üzerinde kısa bir süre tutun, yerinde tel sabitleme. Bir çengel şekil için hafifçe eğri telin ucu forseps kullanın. Bu araç için uygun bir şekle sahip bir örnek için Şekil 3'e bakınız.
- Ağız pipet için küçük bir açılış yapmak için, iki parça ov içine 22 cm Pasteur pipet ince ucunu çekinbir alev, ve küçük sonu ucu koparak er. Ağız pipet tutucu ucuna yerleştirin.
- Bir iğne çektirmenin kullanılarak ablasyon prosedürü sırasında, ilgi konusu blastomerlerdir delmek için kullanılacak olan cam iğne yapın. Uygun bir biçimde şekillendirilmiş bir iğne, Şekil 4 'de gösterilmiştir. Bu iğne 2x parametreleri ile bir program kullanarak bir Sutter P97 iğne çektirmesi çekildi (ısı = 566, = 100 çekin, hız = 20 = 250, zaman) + 1X (ısı = 566, çekin = 100, hız = 100, zaman = 250). Ama aynı zamanda embriyo koryon karşı itilir kırmaya yeterli sağlam olması, iğne yapmak için kullanılan belirli bir program ve alet değişebilir, ancak ince bir iğne noktası olması gerekir.
2. 1. Gün: Gathering Parhyale Çiftleşme Çiftler
- P. çiftleşme toplamak için genişletilmiş Pasteur pipet (adım 1.2 yukarıda) kullanın hawaiensis büyük kültür kabından çiftler ve ayrı bir kap içeren bir c aktarmakYapay deniz suyu eğiliyorum. Bu tuzlu su filtre edilmesi gerekli değildir. Bu, daha sonra öğleden sonra eşleşme çiftleri toplamak ve ertesi sabah, en son döllenmiş embriyolar ve biriken ve dolayısıyla erken bölünme edilmiş, böylece, (20-23 ° C) bir karışımı, oda sıcaklığında gece çiftler bırakmak için en iyi uygun aşamaları ablasyon. Bazı kadın ertesi sabah erken bölünme aşamasında embriyo taşıyan olmasını sağlamak için en az 20 çiftleşme çiftleri toplamak.
3. 2. Gün: Gathering Parhyale Embriyolar
- Ertesi sabah, CO 2 ile süzülmüş yapay deniz suyu (FASW) demlenmeye. Kadınlarda Bazı gece boyunca kendi erkeklerden ücretsiz swum olacak, bunlar ayrılmış kadın toplamak ve FASW / CO 2 onları uyutmak. Kalan eşleştirilmemiş erkek çiftleşme çifti kaptan çıkarıldı ve büyük kültüre geri döndürülebilir. Kalan çiftleşme çiftleri daha sonra embriyo toplanması için kaydedilebilirgün veya ertesi gün.
- FASW / CO 2 saat camı embriyo taşıyan tek Aneztezi kadın aktarın. Tüm ayrılan kadın büyük olasılıkla kadın şeffaf coxal plakaları (Şekil 1A) ile soluk pembe ya da mor küremsilerden gibi gözle görülebilir olacak, yumurta yatırılır olacak. Embriyoların erken bölünme aşamalarında ve blastomer ablasyon için bu nedenle uygun olup olmadığını belirlemek için, araştırmacı kuluçka torbadan embriyolar kaldırmak ve bir mikroskop altında incelemek gerekir.
- Bir mikroskop altında prosedürü görüntülerken, forseps ile vücudun bir tarafında coxal plakaları kavramak. Embriyolar bu coxal plakaları (Şekil 1B) arasındaki ventral yavru kese görünür olacak.
- Damızlık kese arka ucunu, yavaşça damızlık ayırmak için kuluçka kesesinin ön sonuna doğru kabloyu kaldırın, ince, kavisli tel aracı (yukarıdaki adım 1.3 Şekil 3) takınkese kaplamaları (bu 30 oostegites denilen ventral uzantıları modifiye), keseyi açıp embriyolar gevşeterek. Bu membran Yumurtlayarak sonra yaklaşık 2-3 saat kaybolur ve embriyolar bağlı değildir, tüm kolayca tel aracı tarafından bozulacak bir çok ince, şeffaf bir zar içine konur atılmaktadır ilk saat içinde embriyolar birbirleriyle ya da herhangi bir şekilde dişi embriyojenez boyunca bu noktadan itibaren. Araştırmacılar bu rahatsız edici ya da zor damızlık torbadan embriyolar kaldırmak için kavisli tel aracı manevra bulursanız, alternatif bir sürece hareketler yumuşak ve hiçbir sert basınç embriyolar veya damızlık kese uygulanır olarak kullanılabilir uygulamak. Damızlık kese embriyolar kaldırmak için uygun diğer araçlar köreltilmiş forseps ya da mühürlü ve düzeltti sonunda bir cam kılcal bulunmaktadır.
- T dışarı iterek, açılan yavru kese ile su temizlemek için değiştirilmemiş 15 cm Pasteur pipet kullanıno saat camın altına yerleşmek gerektiğini, hangi embriyoların. Ana kültürün onu reintroducing önce kurtarma izin (CO 2 olmadan) FASW temizlemek için kadın aktarın. Birden fazla kadın aynı kurtarma çanak içine yerleştirilmiş, ancak onlar hala kısmen anestezi eğer diğer hayvanlar tarafından yemiş olabilir gibi kadın, ana kültürüne onları dönmeden önce tamamen kurtarmak için izin olabilir.
- Temiz FASW ile bir Petri kabı embriyo transferi, ve embriyonik evresini belirlemek için mikroskop altında görüntülemek için değiştirilmemiş 15 cm Pasteur pipet kullanın. Bu işlem için uygun olan üçüncü bir bölünme (aşama 4 5), en vardır ayrı embriyolar. Ayrıca önceki germ disk oluşumuna herhangi bir bölünme aşamasına bu protokolü uygulamak mümkün olmalıdır (07-08 Mayıs aşamaları).
4. 2. Gün: Kesip Tek Hücreler
- FASW sığ bir tabaka ile Sylgard kaplı Petri çanak doldurun. Değiştirilmemiş bir 15 cm Pasteur pi kullanınpette plakasına tek bir embriyo transfer etmek.
- Künt forseps kullanılarak, hafifçe ablasyon edilecek olan hücre (Şekil 2A ve 2B) tanımlamak için embriyo döndürün. Germ hattı ön g küçük macromere Mav üstüne oturur micromere küçük olarak tespit edilebilir. Buna ek olarak, doğrudan g mezoderm ön micromeres ml mr payı olarak embriyonun ortasında bir sınır hücre. Mr g sağındaki blastomere olup, bunun üzerine doğrudan karşısında micromere olan en hücreyi temas ve etmez mi g solundaki micromere olduğunu. Mr, ml, ve EN kardeş macromeres ektoderm öncüleri sırasıyla Er, El ve Ep vardır.
- LEF forseps ilearaştırmacı sağ elini ise t el (veya sağ elinde araştırmacı sol elini ise), sağa ilgi hücre ile embriyo şark (veya sola araştırmacı sol elini ise), ve yavaşça stabilize forseps arasında embriyo kavramak.
- Çekilmiş bir cam iğne (yukarıdaki adım 1.5, Şekil 4) kullanılarak, yumuşak, ilgi konusu bir hücreyi delinme. Komşu hücrelere veya ilgi hücrenin altında iğne itin şekilde değil, çok uzak iğne takmayın. İğne sadece koryon ve temel hücre zarı delinme vardır ve ablasyon üzere hücre içine derin uzatmak gerekmez.
- Alışverişi para cezası ile bir ağız pipet cam sonu için embriyo delmek için kullanılan iğne Pasteur pipet (yukarıdaki adım 1.4) çekti. Ilgi hücrede oluşturulan deliğe yakın pipet ucu tutun ve çok hafif bir emme uygulanır.
- Çok hafifçe forseps ile embriyo sıkmak. Blasto içeriği itibariylesadece, adım 4.4 oluşturulan delikten koryon dışına itti embriyo engelsiz bir görünüm sağlamak için ağız pipet içine emmek. Delik yeterince büyükse, delinmiş bir hücrenin çekirdeğinde de ortaya görülebilir. Bu tüm hücre içeriğini kaldırıldı ve rejenere olamaz emin olmak için iyi bir kontroldür.
- Ilgi blastomere kaldırılır dikkatle embriyo gözlemlemek. Delinmiş hücrenin sınır görünür yatan hücrelerinin kavşak yapım, koryon delikten doğru kayacaktır. Ilgilenilen blastomer tüm kaldırıldı kadar basınç uygulamaya devam edilir. Yan yana gelen embriyo rulo forseps kullanın ve görsel ilgi blastomer hepsi gitti olduğunu onaylayın.
- Değiştirilmemiş bir 15 cm Pasteur pipeti kullanılarak, (FASW + 1 mg / ml amfoterisin B, 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin) FASW + temizlemek için embriyo transferi.
- Bireysel kuyularda blastomere-ablasyon embriyolar kaldırınFASW + temiz bir 48-çukurlu plaka içinde, günlük antibiyotik takviye FASW +% 50 değiştirilmesi. Elimizde embriyo hayatta ve 18-28 ° C arasında bir sıcaklık aralığında, daha iyi takip ablasyonu geliştirmek Araştırmacılar minimal rahatsızlık ile embriyolar yükseltmek için bir temiz (ama mutlaka steril değil) bir yüzeye sahip olduğu için bir sıcaklıkta kendi embriyolar yükseltmek gerekir. Kontrolleri ile blastomer ablasyon embriyoların gelişimsel olayların zamanlamasını karşılaştırma yapabilmek için, 18 º C 4, 25 º C 4 yetiştirilen embriyo için kullanılabilir detaylı gelişimsel hazırlama bilgilere okuyucu bakın, ve 26 º C 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir üçüncü bölge P. başarı ablasyon sonra Bu protokol daha önce tarif edildiği gibi, kısmen kesilip alınmış blastomer tarafından işgal edilen alanı işgal edecek şekilde hawaiensis micromeres, kalan micromeres yavaş yavaş hafif konumlarını kayması. G kaldırıldığında Örneğin, blastomerler MR komşu ve biraz vardiya ve g ile doğrudan temas (Şekil 2A ve 2C karşılaştırın) eskiden olduğu yanal hücre sınırlarını paylaşmak için gelmek ml. Başarılı ablasyon ardından, kalan blastomerlerin dördüncü bölünme girmeden önce (en az bir saat) hafif bir gecikme görüntüleyebilir, ancak daha sonra aynı bölünme modellerini ve en az gastrulasyon kadar unmanipulated embriyolar görüntülenen olacağını zamanlama 23 aşamaları devam etmelidir . Dört micromeres, kalan blasto soyundan herhangi takiben ablasyonmeres ayrıca "rozet" ve Gastrulasyon hareketleri 23'ün başlatılması olarak adlandırılan bir özellik hücre düzeneğinin oluşumu dahil olmak üzere normal hücre bölünme zamanlama ve davranışları, göstermelidir. Kuluçka üzerine ablasyon prosedürü ve tam embriyojenezi hayatta embriyo oranı başlangıçta tekniği yeni bir araştırmacı için yaklaşık% 10 mertebesinde olabilir, ama tecrübeye sahip yaklaşık% 50 oranında ortalama olmalıdır ve% 75 kadar yüksek olabilir blastomere ablasyon ardından embriyoların uygulama ve uyanık dikkatle. Tablo 1. ablazeydi embriyo sayıları ve hayatta kalma oranlarının ilk birkaç için genellikle en az% 80 gösteren aynı araştırmacı tarafından yapılan ardışık ablasyon deneyler bir dizi için sağkalım oranları örneklerini gösterir gün araştırmacı artan deneyimi ile artış kuluçka kadar ablasyon, ve hayatta kalma oranlarını takip.
Eksik blastomere kaldırma olacaktırhala embriyonun koryon içinde yer alan membran bileşenleri, sitoplazma, ya da yumurta sarısı granülleri, içerebilir ablazeydi olmalıdır blastomer kalıntıları görülmeye değerdir. Iki saatten fazla, ya da düzensiz bölünme desen veya kalan blastomerlerin soyundan hücresel davranışları dördüncü bölünme bir gecikme, aynı zamanda başarısız ablasyon gösterebilir. Bu olgular ablasyon işlemi sırasında diğer blastomerlere neden hasar sonucu olabilir. Ablasyon ekran morfolojik anormallikler için hedeflenen bir veya hasar daha sonra tekrar parçalanır dışındaki blastomerler olasılıkla ablasyon işlemi sırasında diğer blastomerlere neden olmuşsa.
Hücre kaderinin belirteçleri kaderleri düzenleyici değiştirme tabi olmayan belirli üçüncü bölünme blastomer soyundan etiket varsa, başarılı ablasyon sonra ek onay, bu belirteçlerin Follo ile etiketleme manipüle embriyolar elde edilebilmektedirkanat ablasyon. Bazı mezodermal ve ektodermal toprakları belirteçleri embriyogenezin 8,14,15 geç safhalarda orta ila tarif edilmiştir. Bu germ hem de kurucusu blastomerlerin 25 birinin kaybı üzerine düzenleyici yerine geçmesi çünkü Ancak, bu belirteçler açıkça ablasyon başarılı blastomere olmadığını belirlemek olmayabilir. Germ hattı ön-madde g durumunda, onun tüm soyu vasa transkript 12 ve embriyojenez boyunca 4 protein ekspresyonu ile işaretlenmiş ve erken tohum bandı, en az olmaması ile germ hücreleri ablasyon edildiği g embriyolar 4 aşamaları vardır. G Başarılı ablasyon böylece embriyojenezin sonraki aşamalarında ablasyonu (Şekil 5) Aşağıdaki vaza ifadeyi inceleyerek teyit edilebilir.
src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/51073/51073fig1.jpg" />: fo th = "5in"
Şekil 1. Yetişkin Parhyale kadın ve embriyolar hawaiensis. (A) bir yetişkin dişi P. Yanal hawaiensis, coxal plakaları (oklar) gösteren, göğüs uzantılar (ok başları) ve şeffaf coxal plakaları (mavi noktalı anahat) aracılığıyla, pembe veya mor küremsilerden gibi görünen embriyolar. Anterior solunda. Bir yetişkin dişi P. (B) alttan görünüşü hawaiensis yavru kese (mavi noktalı anahat) görünür embriyoları gösteren. Anterior solunda. Yavru kese salınan (C) embriyolar FASW normal gelişir. . S1 tarama aşamaları arasında değişen çeşitli gösterilmiştir, Browne ve ark 5 Ölçü bar = 1 (A) 'mm ve (B)' ye göre aşamalı, (C) 'de 500 um.51073/51073fig1highres.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. P. sekiz hücre aşamasında embriyoların hawaiensis. (A) dört micromeres (küçük hücre) ve dört macromeres (büyük hücreleri) ihtiva eden, (aşama S4 5) unmanipulated embriyonun sekiz-hücre aşamasına canlı. (B) floresan marker 6 göre izleme soyu ortaya koyduğu gibi, bir vahşi tip embriyo Tüm blastomerlerin hücre hayati belirtme gösteren sekiz hücreli evre embriyo şematik. (C), mevcut protokolü kullanılarak kaldırıldı g blastomer olmuştur S4 evresindeki embriyonun canlı. Daire bölge eskiden g blastomer tarafından işgal bölgesini göstermektedir;Kalan micromeres hafifçe g ablasyon sonucu pozisyon değiştirdi. Ölçeği (A) = 250 mikron bar ve (C). , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3,. Kuluçka kesesinden embriyolar çıkarılması için kullanılan tel araç. Burada gösterilen aracı hafif bir eğri forseps kullanılarak tanıtmak için, daha sonra, bir Pasteur pipeti dar ucuna bir tungsten teli yerleştirilmesi ve hafifçe yerinde mühür teli, cam eritme tarafından yapıldı tel haline. Damızlık kese embriyolar kaldırmak için uygun diğer araçlar köreltilmiş forseps ya da mühürlü ve düzeltti sonunda bir cam kılcal bulunmaktadır. Sc= 1 cm ale bar.
Şekil 4. Cam iğne ablasyon işlemi sırasında blastomerlerdir delme için kullanılır. Burada gösterilen iğne parametreleri 2 x bir program kullanarak bir Sutter P97 iğne çektirmesi çekildi (ısı = 566, = 100 çekin, hız = 20, zaman = 250) + 1 x (ısı = 566, zaman = 250, hız = 100, = 100 çekin). Diğer araçlar veya programları sürece burada gösterilenden ile aynı genel şekle sahip olarak, ayırma için müsait iğneler çekmek için kullanılabilmektedir. Ölçek çubuğu = 1 cm.
Şekil 5,. Blastomere a sonuçlarını değerlendirmekblation Embriyogenez sırasında. (A) kısa bir anti-Vasa immünoboyamayla (ok başları) tarafından etiketli germ hücreleri gösteren, kuluçka önce vahşi bir türü aşama S29 embriyonun Gonad bölgesi. Burada kullanılan bir anti-Vasa antikoru P. özgüdür hawaiensis Vasa (Linsler, Alwes ve Extavour, yayınlanmamış veri). (B) gonad bölgesi (ok başları) belirli anti-Vasa sinyalinin olmaması ile ortaya koyduğu gibi germ hücreleri olmadığını gösteren sekiz hücreli aşamada uzaklaştırılmıştır g blastomer olan bir aşama S29 embriyo Gonad bölgesi. Ölçeği (A) = 100 mikron bar ve (B) için de geçerlidir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
| Ablasyon yuvarlak | # Ablasyon | # (%) Atlattı% 50 gelişme | # (%)% 90-100 gelişimine atlattı |
| 1 | 49 | 41 (83.7) | 6 (12.2) |
| 2 | 48 | 46 (95.8) | 17 (35.4) |
| 3 | 31 | 25 (80.6) | 22 (71.0) |
| 4 | 97 | 72 (74.2) | 56 (57.7) |
| 5 | 108 | 100 (92.6) | 65 (60.2) |
| 6 | 50 | 36 (72.0) | 37 (74.0) |
| TOPLAM | 383 | 320 (83.6) | 203 (53.0) |
Tablo 1. Temsilci ablasyon sağkalımistatistik. micromere ablasyon sonrasında, hayatta kalma (25 º C'de 10-12 gün) (25 º C'de 5-6 gün) gelişiminin ilk% 50 içinde ve daha sonra 90-100% gelişimine hem de gol oldu. Ablasyon 1-6 sekiz aylık süre boyunca kronolojik sırayla tek bir araştırmacı (AR Nast) tarafından gerçekleştirilen deneyler temsili örnekleridir yuvarlar. Tecrübesi ile% 90-100 geliştirme artış, burada sağkalım oranları gösterildiği gibi Araştırmacılar, bulmak gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz manuel ablasyon ve amphipod P. erken bölünme aşamalarında tek blastomerlerin tam fiziksel çıkarılması için bir protokol açıklar hawaiensis. Biz bir sekiz-hücreli aşamada embriyo tek germ hattı öncü hücre g kaldırarak bu protokolün kullanımını göstermek ve ablasyon sonra embriyojenezinde g 'nin kızı hücrelerin yokluğunu teyit başarılı olduğunu gösteriyor. Bu protokol, erken aşamalarında bölünme embriyo micromeres herhangi kaldırmak için kullanılabilir. Birinci veya ikinci bölünme aşamalarında bu aşamada macromeres veya blastomerlerdir kaldırmak için bu protokolü kullanmak için, kullanıcıların sadece adım 4.4 de koryon biraz daha büyük bir delik oluşturarak, ve uzun bir süre basınç ve emme uygulayarak hafif değişiklikler uygulayabilirsiniz adımında 4.6 hücre içeriğinin daha büyük bir hacim kaldırın. Bu protokol kullanımından sonra, ayırma sonra kalan blastomerlerin un geliştirilmesi olduğunu bulduken az 23 gastrulasyon zamanına kadar bölünmesi ve hücre hareketi kalıpları ile ilgili olarak etkilemiştir.
Bu protokol, bu amphipod erken bölünme blastomer gelişim potansiyeli de devam soruşturma için yararlı olabilir. Birçok soru bazı hücreler değil, diğerleri ablazeydi blastomerlerin olanlar yerine kaderlerini değiştirmek neden dahil, bu alanda cevaplanması gereken kalır, ve bu düzenleyici değişikliklerin hassas zamanlama ve mekanizmaları. Bu protokol, aynı zamanda, sadece ilgi konusu blastomerlerde ardışık adımları 4,2-4,7 tekrarlayarak, birden fazla hücrenin ablasyon uyum sağlamak için modifiye edilebilir.
Bu erken bölünme blastomerlerdir görüntülemek ve doğru bir şekilde tespit etmek amacıyla, uygun aydınlatma ile, yüksek kaliteli bir stereomikroskop kullanılması önemlidir. Biz bir fiber optik soğuk ışık kaynağı yanal gelen beyaz ışık, bu amaç için en yararlı olduğunu bulmak. Doğrudan specim yukarıda Olay ışıkiletilen ışık embriyoların blastomer ve yoğun sarısı nüfuz başarısız olurken tr, hücresel morfoloji ve sınırları belirsiz olabilir yansımalar oluşturur bu nedenle ayırt etmek zordur. Bu soluk embriyolar için en iyi kontrast sağlar gibi, saat camı veya siyah bir yüzeyi yerine beyaz veya şeffaf bir cam yüzey üzerine yerleştirilmek üzere embriyoları içeren bir Petri kabı için en faydalı olacaktır.
Bu protokol bir sınırlama ilgi blastomere doğru ve net bir şekilde prosedürü başlamadan önce tanımlanmış olmasıdır. Photoablation teknikleri araştırmacılar sistemine yeni için embriyolar floresan boya 28 enjeksiyonu takiben bir kaç bölünme devir için geliştirmek için bırakılabilir ve enjekte blastomer kimlik sonrası enjeksiyon teyit beri, daha yararlı olabilir, ancak fotoablasyonundan önce, olur de, önceki hücre hattı olarak tarif edilmiştir hücre soyundan, bir örüntüye göreyaş 6,23 analizleri. Araştırmacılar P. öğrendiğinizde hawaiensis embriyo ve güvenle tüm blastomerlerdir belirleyebilir, burada açıklanan manuel ablasyon daha çok embriyo ölü hücre gövdesi çıkarmadan hücreyi öldürmek daha blastomer tam bir fiziksel kaldırılması, istenen uygulamalar için kullanılabilir.
Bu prosedür, ilke olarak, diğer holoblastically yaran kabuklular bölünme aşamasındaki embriyolar ya da kimin chorions veya gübreleme zarlar kolayca silinemez diğer deniz veya tatlı su omurgasız tek blastomerlerdir kaldırmak için uygulanabilir. Değişiklikler, uygun özelliklere sahip tuzluluk kuluçka ortamını kullanarak ve daha hassas membranlar (daha uzun ve daha ince iğneler) veya daha sağlam embriyonik kaplamaları (daha kısa, hızlı bir şekilde iğne konik) uyum sağlamak için iğne şeklini değiştirerek içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz, kamera çalışması için Tripti Gupta ve Frederike Alwes hücre ablasyon tekniği rafine yardım için, ve veri, video ve yazının geri bildirim için Extavour laboratuvar üyeleri Reyhan Arif ve Hassaan Shahawy teşekkür ederim. Bu çalışma kısmen Harvard Kök Hücre Enstitüsü tarafından desteklenmiştir (Tohum Hibe numarası SG-0057-10-00) Ellison Tıp Vakfı (New Scholar Ödülü numarası AG-NS-07010-10) JFMO için, ve Harvard Üniversitesi Araştırma Programı ödül için ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-630 VWR | For transferring intact and blastomere-ablated embryos from dish to dish. |
| 22 cm Pasteur pipette | Wheaton | 53499-632 VWR | For making mouth pipette tips. |
| 3 cm Petri dishes | Thermo Scientific | 25382-334 VWR | Use some unaltered to collect and store embryos; coat some with a layer of Sylgard (see below) to create a working surface for blastomere ablations. |
| 48-well Plates | Greiner Bio-One | 82051-004 VWR | For culturing embryos following ablation. |
| Bottle top filters 0.2 µm | Nalge Nunc International | 28199-296 VWR | For creating FASW (See below). |
| Bunsen burner | VWR | 89038-530 VWR | For creating tungsten wire tool and fine tip of mouth pipette. |
| Diamond scribe | Musco Sports Lighting | 52865-005 VWR | For creating wide-mouthed Pasteur pipettes for collecting couples. |
| Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 Fine Science Tools | For holding anaesthetized females during removal of embryos from brood pouch. These do not have to be fine-tipped Dumont forceps - the tips can be at least as blunt as those of the forceps for which the catalogue number is listed here. |
| Fungizone-Amphotericin B | Sigma | A2942 Sigma Aldrich | Add to FASW to a final concentration of 1 mg/ml, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Glass capillaries 4 in long, 1/0.58 OD/ID (mm) | World Precision Instruments | 1B100-4 World Precision Instruments | For making needles for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Glass watchglass 300 mm diameter | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 Electron Microscopy Sciences | For use in removing embryos from the brood pouch of anesthetized females. |
| Instant Ocean Artificial Sea Water (ASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Make ASW by dissolving salt in deionized water to a salinity of 1.022-1.024. |
| Instant Ocean Filtered Artificial Sea Water (FASW) | Instant Ocean | IS160 Aquatic EcoSystems | Use 0.2 µm filters to sterilize ASW. Make up in small amounts (< 250 ml) as needed. |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 21905-026 VWR | For safely breaking off the fine end of Pasteur pipettes modified for collecting couples. |
| Mouth pipette adaptor | Drummond Labware | A5177-5EA Sigma Aldrich | Insert the fine pulled Pasteur pipette tip into this end, to be used for removing extruded cell contents during the ablation procedure. |
| Mouth pipette tubing | Aldrich | Z280356 Sigma Aldrich | Cut this to be long enough to comfortably hang around your neck during the ablation procedure. |
| Needle Puller | Sutter Instrument Company | P97 Sutter Instrument Company | For making needles from glass capillaries for puncturing the blastomere to be ablated. |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Mediatech | 45000-650 VWR | Add to FASW to a final concentration of 100 units/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and use this solution to culture blastomere-ablated embryos. |
| Rubber bulb | Electron Microscopy Sciences | 100488-418 VWR | For using Pasteur pipettes to transfer embryos from dish to dish. |
| Sylgard 184 | K. R. Anderson, Inc. | NC9659604 Fisher Scientific | Make up according to manufacturer's instructions. Pour a layer 2-5 mm thick into a 3cm petri dish to create a working surface for blastomere ablations. |
| Tungsten wire 0.004 inches diameter | A-M Systems | 719000 A-M Systems | Use this to make a tool for removing embryos from the brood pouch of anaesthetized females. |
References
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H.
- Sander, K. Pattern formation in insect embryogenesis: the evolution of concepts and mechanisms. Int. J.Insect Morphol. Embryol. 25, 349-367 (1997).
- Regier, J. C., et al. Arthropod relationships revealed by phylogenomic analysis of nuclear protein-coding sequences. Nature. 463, 1079-1083 (2010).
- Extavour, C. G. The fate of isolated blastomeres with respect to germ cell formation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 277, 387-402 (2005).
- Browne, W. E., Price, A. L., Gerberding, M., Patel, N. H. Stages of embryonic development in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Genesis. 42, 124-149 (2005).
- Gerberding, M., Browne, W. E., Patel, N. H. Cell lineage analysis of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis reveals an early restriction of cell fates. Development. 129, 5789-5801 (2002).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Fixation and dissection of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Price, A. L., Patel, N. H. Investigating divergent mechanisms of mesoderm development in arthropods: the expression of Ph-twist and Ph-mef2 in Parhyale hawaiensis. J. Exp. B. Dev. Evol. 310, 24-40 (2008).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. In situ hybridization of labeled RNA probes to fixed Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Browne, W. W., Schmid, B. G. M., Wimmer, E. A., Martindale, M. Q. Expression of otd orthologs in the amphipod crustacean, Parhyale hawaiensis. Dev. Genes Evol. 216, 581-595 (2006).
- Prpic, N. M., Telford, M. J. Expression of homothorax and extradenticle mRNA in the legs of the crustacean Parhyale hawaiensis: evidence for a reversal of gene expression regulation in the pancrustacean lineage. Dev. Genes Evol. 218, 333-339 (2008).
- Kizil, G., Havemann, J., Gerberding, M. Germ cells in the crustacean Parhyale hawaiensis depend on Vasa protein for their maintenance but not for their formation. Dev. Biol. 327, 320-239 (2009).
- Liubicich, D. M., et al. Knockdown of Parhyale Ultrabithorax recapitulates evolutionary changes in crustacean appendage morphology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13892-13896 (2009).
- Pavlopoulos, A., et al. Probing the evolution of appendage specialization by Hox gene misexpression in an emerging model crustacean. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13897-13902 (2009).
- Vargas-Vila, M. A., Hannibal, R. L., Parchem, R. J., Liu, P. Z., Patel, N. H. A prominent requirement for single-minded and the ventral midline in patterning the dorsoventral axis of the crustacean Parhyale hawaiensis. Development. 137, 3469-3476 (2010).
- Simanton, W., et al. Conservation of arthropod midline netrin accumulation revealed with a cross-reactive antibody provides evidence for midline cell homology. Evol. Dev. 11, 260-268 (2009).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Antibody staining of Parhyale hawaiensis embryos. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Pavlopoulos, A., Averof, M. Establishing genetic transformation for comparative developmental studies in the crustacean Parhyale hawaiensis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7888-7893 (2005).
- Kontarakis, Z., et al. A versatile strategy for gene trapping and trap conversion in emerging model organisms. Development. 138, 2625-2630 (2011).
- Zeng, V., et al. De novo assembly and characterization of a maternal and developmental transcriptome for the emerging model crustacean Parhyale hawaiensis. BMC Genom. 12, 581 (2011).
- Zeng, V., Extavour, C. G. ASGARD: an open-access database of annotated transcriptomes for emerging model arthropod species. Database. , (2012).
- Nestorov, P., Battke, F., Levesque, M. P., Gerberding, M. The Maternal Transcriptome of the Crustacean Parhyale hawaiensis Is Inherited Asymmetrically to Invariant Cell Lineages of the Ectoderm and Mesoderm. PLoS ONE. 8, (2013).
- Alwes, F., Hinchen, B., Extavour, C. G. Patterns of cell lineage, movement, and migration from germ layer specification to gastrulation in the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 139, 110-123 (2011).
- Ewen-Campen, B., Schwager, E. E., Extavour, C. G. The molecular machinery of germ line specification. Mol. Reprod. Dev. 77, 3-18 (2010).
- Price, A. L., Modrell, M. S., Hannibal, R. L., Patel, N. H. Mesoderm and ectoderm lineages in the crustacean Parhyale hawaiensis display intra-germ layer compensation. Dev. Biol. 341, 256-266 (2010).
- Fraser, S. E., Harland, R. M. The molecular metamorphosis of experimental embryology. Cell. 100, 41-55 (2000).
- Olsson, L. A clash of traditions: the history of comparative and experimental embryology in Sweden as exemplified by the research of Gösta Jägersten and Sven Hörstadius. Theory Biosci. 126, 117-129 (2007).
- Rehm, E. J., Hannibal, R. L., Chaw, R. C., Vargas-Vila, M. A., Patel, N. H. Injection of Parhyale hawaiensis blastomeres with fluorescently labeled tracers. Cold Spring Harbor Protoc. 2009, (2009).
- Chaw, R., Patel, N. H. Independent migration of cell populations in the early gastrulation of the amphipod crustacean Parhyale hawaiensis. Dev. Biol. 371, 94-109 (2012).
- Schmitz, E. H. Crustacea Microscopic Anatomy of Invertebrates. Microscopic Anatomy of Invertebrates. Harrison, F. W. 9, Wiley-Liss, Inc.. 443-528 (1992).
