Nem Måling af diffusionskoefficienter af EGFP-tagget plasmamembranproteiner Brug k-Space Billede korrelationsspektroskopi
Summary
Dette dokument indeholder en trin for trin guide til udsving analyse teknik k-Space Billede korrelationsspektroskopi (VIF) til måling diffusionskoefficienter af fluorescens-mærkede plasmamembranproteiner i levende pattedyrceller.
Abstract
Lateral spredning og opdeling af plasmamembranproteiner er stramt reguleret i celler og dermed vil studere disse processer afslører nye indsigter til plasmamembranprotein funktion og regulering. For nylig, k-Space Billede korrelationsspektroskopi (VIF) 1 blev udviklet for at muliggøre rutinemæssige målinger af diffusionskoefficienter direkte fra billeder af fluorescens mærkede plasma membranproteiner, der undgås systematiske afvigelser indført ved sonde fotofysik. Selv om det teoretiske grundlag for analysen er kompleks, kan fremgangsmåden gennemføres ved nonexperts ved hjælp af en frit tilgængelig kode til at måle diffusionskoefficienterne af proteiner. VIF'er beregner tidsmæssig sammenhæng funktion fra en fluorescensmikroskopi billedstak efter Fourier transformation af hvert billede til gensidig (k-) rum. Efterfølgende cirkulær gennemsnitsberegning, naturlige logaritme transformere og lineær passer til korrelationsfunktionen giver den diffusionskoefficient. Detpapir giver en trin-for-trin guide til billedet analyse og måling af diffusionskoefficienter via VIF'erne.
Først foretages en høj rammehastighed billedsekvens for fluorescensmærket plasmamembranprotein erhvervet ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Derefter er en region af interesse (ROI) at undgå intracellulære organeller, flytte blærer eller udstående membran regioner valgt. Stak ROI importeres til en frit tilgængelig kode og flere definerede parametre (se metode afsnit) er indstillet for VIF'er analyse. Programmet genererer derefter en "hældning af skråninger" plot fra k-rums tid korrelationsfunktioner, og diffusionskoefficienten beregnes ud fra hældningen af plottet. Nedenfor er en trin-for-trin VIF'er procedure til at måle diffusionskoefficient en membran protein ved renal vand kanal aquaporin-3 tagget med EGFP som en kanonisk eksempel.
Introduction
De fire dimensionelle Spatiotemporal organisation og laterale mobilitet plasmamembranproteiner er stramt reguleret, og kan spille en rolle i proteinfunktion, aktivitet og protein-protein interaktioner. Lateral diffusion af plasmamembranproteiner, er traditionelt blevet undersøgt ved at beregne diffusionskoefficienter for enlige partikler fra time-lapse billeddannelse af kvantepunktet eller farvestof mærkede plasmamembranproteiner 2-4. Denne tilgang kræver indsættelse af en ekstracellulær tag i plasmamembranprotein for kvantepunktet eller farvestof mærkning, som kan kompromittere protein foldning og funktion og dermed ikke kan opnås for nogle proteiner. Den steriske volumen af en kvantepunkt har vist sig at bremse udbredelsen af proteinet 5 og i øvrigt er det kun en lille brøkdel af proteinerne i populationen mærket med kvantepunkter, og det vides ikke, om denne fraktion er repræsentativ for den samlede pulje af plasmamembranproteiner. Enkelt partikel tracking (SPT) målinger af diffusionskoefficienter fra billede serie af kvantepunktet mærkede proteiner indebærer kortlægning af de afbildede peak positioner af partikler med todimensional Gauss passer efterfulgt af en omfattende analyse algoritmer. Analysen er beregningsmæssigt meget intensiv, der kræver en omfattende ikke-lineær kurvetilpasning i hvert billede billede af en time-lapse-sekvens til tilnærmelser af mikroskop punktspredningsfunktionen (typisk to dimensionelle rumlige Gaussians) og efterfølgende sammenkobling af partikel positioner i partikelbaner beskriver bevægelse af enkelte molekyler 6,7.
En nylig udviklet billede korrelation teknik, k-Space Billede korrelationsspektroskopi (VIF) gør det muligt relative simple målinger af diffusionskoefficienter af fluorescens mærkede plasmamembranproteiner. Muligheden for at rutinemæssigt beregne diffusionskoefficienter af membranproteiner mærket med fluorescerende proteiner ved VIF'er er et unikt værktøj, som holderflere fordele i forhold til traditionelle quantum dot SPT analyse: nr. indsættelse af ekstracellulære tags og tidskrævende ekstracellulære mærkning er påkrævet (cellelinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner kan anvendes); diffusionskoefficienter er udvundet fra den samlede pulje af fluorescerende proteiner i forhold til en delmængde mærket med quantum dots; analyse er enkel uden behov for at spore enkelt proteiner og analysen kan udføres ved hjælp af en eksisterende kode uden krav om ekstra bruger programmering. Metoden er hurtig, fordi det er en gennemsnitsberegning teknik, som muliggør hurtig beregning og beregning af diffusionskoefficienter. Disse hurtige diffusion målinger for proteinet befolkning supplerer de mere detaljerede molekylære transport af oplysninger indhentet til en delmængde af populationen af de omhyggelige SPT metoder.
VIF'er tid korrelerer fluorescens mikroskopi billede sekvenser, der først er blevet forvandlet til Fourier rummet, og derved adskiller fluorescence udsving på grund af fotofysik fra dem på grund af molekylære transport 1.. Som et resultat heraf kan VIF bestemme antallet tæthed, flow hastighed og diffusion af fluorescensmærkede molekyler samtidig være upåvirkede af komplekse fotoblegning eller blinker af fluoroforer. Dette gør VIF'er et nyttigt værktøj til hurtigt at afgøre diffusion dynamik fluorescens-mærket cellemembranproteiner uden behov for brugerdefinerede skrive algoritmer. Udover fluorescensmærkede proteiner kan VIF også anvendes til quantum dot-mærkede membranproteiner 8.
Dette papir giver en trin-for-trin introduktion af, hvordan man bruger VIF'erne at udtrække diffusionskoefficienter af EGFP-mærkede plasmamembranproteiner ved at demonstrere, hvordan du placerer afgrøden, hvordan at bruge koden, og hvordan man vurderer de genererede plots, hvorfra diffusion koefficienter er udvundet. Som et eksempel, data opnået ved spinding disk-mikroskopi sæt i semi-total indre refleksion fluorescerernce (TIRF) tilstanden af en nyre vand kanal protein aquaporin-3 (AQP3) tagget med EGFP præsenteres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir fremlagde en detaljeret trin-for-trin oversigt over hvordan man anvender VIF'erne analysemetode til at bestemme diffusionskoefficienter fra mikroskopi billeder af proteiner mærket med fluorescerende proteiner. Analysen er uafhængig af sondens valg med et meget bredt dynamikområde ved mærkning tæthed og kan således også anvendes til proteiner mærket med quantum dots samt farvestoffer og fluorescerende proteiner, såsom EGFP.
At beregne gyldige diffusionskoefficienter f…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en Lundbeck Junior Group Leader Fellowship til LNN. PWW erkender tilskud støtte fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (NSERC). Vi takker også de danske Molekylær Bioimaging Center på University of Southern Danmark for adgang til spinding disk mikroskopi.
Materials
References
- Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
- Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
- Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
- Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
- Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
- Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
- Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
- Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
- Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
- Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
- Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
