Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Nem Måling af diffusionskoefficienter af EGFP-tagget plasmamembranproteiner Brug k-Space Billede korrelationsspektroskopi

doi: 10.3791/51074 Published: May 10, 2014

Summary

Dette dokument indeholder en trin for trin guide til udsving analyse teknik k-Space Billede korrelationsspektroskopi (VIF) til måling diffusionskoefficienter af fluorescens-mærkede plasmamembranproteiner i levende pattedyrceller.

Abstract

Lateral spredning og opdeling af plasmamembranproteiner er stramt reguleret i celler og dermed vil studere disse processer afslører nye indsigter til plasmamembranprotein funktion og regulering. For nylig, k-Space Billede korrelationsspektroskopi (VIF) 1 blev udviklet for at muliggøre rutinemæssige målinger af diffusionskoefficienter direkte fra billeder af fluorescens mærkede plasma membranproteiner, der undgås systematiske afvigelser indført ved sonde fotofysik. Selv om det teoretiske grundlag for analysen er kompleks, kan fremgangsmåden gennemføres ved nonexperts ved hjælp af en frit tilgængelig kode til at måle diffusionskoefficienterne af proteiner. VIF'er beregner tidsmæssig sammenhæng funktion fra en fluorescensmikroskopi billedstak efter Fourier transformation af hvert billede til gensidig (k-) rum. Efterfølgende cirkulær gennemsnitsberegning, naturlige logaritme transformere og lineær passer til korrelationsfunktionen giver den diffusionskoefficient. Detpapir giver en trin-for-trin guide til billedet analyse og måling af diffusionskoefficienter via VIF'erne.

Først foretages en høj rammehastighed billedsekvens for fluorescensmærket plasmamembranprotein erhvervet ved hjælp af et fluorescensmikroskop. Derefter er en region af interesse (ROI) at undgå intracellulære organeller, flytte blærer eller udstående membran regioner valgt. Stak ROI importeres til en frit tilgængelig kode og flere definerede parametre (se metode afsnit) er indstillet for VIF'er analyse. Programmet genererer derefter en "hældning af skråninger" plot fra k-rums tid korrelationsfunktioner, og diffusionskoefficienten beregnes ud fra hældningen af ​​plottet. Nedenfor er en trin-for-trin VIF'er procedure til at måle diffusionskoefficient en membran protein ved renal vand kanal aquaporin-3 tagget med EGFP som en kanonisk eksempel.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De fire dimensionelle Spatiotemporal organisation og laterale mobilitet plasmamembranproteiner er stramt reguleret, og kan spille en rolle i proteinfunktion, aktivitet og protein-protein interaktioner. Lateral diffusion af plasmamembranproteiner, er traditionelt blevet undersøgt ved at beregne diffusionskoefficienter for enlige partikler fra time-lapse billeddannelse af kvantepunktet eller farvestof mærkede plasmamembranproteiner 2-4. Denne tilgang kræver indsættelse af en ekstracellulær tag i plasmamembranprotein for kvantepunktet eller farvestof mærkning, som kan kompromittere protein foldning og funktion og dermed ikke kan opnås for nogle proteiner. Den steriske volumen af en kvantepunkt har vist sig at bremse udbredelsen af proteinet 5 og i øvrigt er det kun en lille brøkdel af proteinerne i populationen mærket med kvantepunkter, og det vides ikke, om denne fraktion er repræsentativ for den samlede pulje af plasmamembranproteiner. Enkelt partikel tracking (SPT) målinger af diffusionskoefficienter fra billede serie af kvantepunktet mærkede proteiner indebærer kortlægning af de afbildede peak positioner af partikler med todimensional Gauss passer efterfulgt af en omfattende analyse algoritmer. Analysen er beregningsmæssigt meget intensiv, der kræver en omfattende ikke-lineær kurvetilpasning i hvert billede billede af en time-lapse-sekvens til tilnærmelser af mikroskop punktspredningsfunktionen (typisk to dimensionelle rumlige Gaussians) og efterfølgende sammenkobling af partikel positioner i partikelbaner beskriver bevægelse af enkelte molekyler 6,7.

En nylig udviklet billede korrelation teknik, k-Space Billede korrelationsspektroskopi (VIF) gør det muligt relative simple målinger af diffusionskoefficienter af fluorescens mærkede plasmamembranproteiner. Muligheden for at rutinemæssigt beregne diffusionskoefficienter af membranproteiner mærket med fluorescerende proteiner ved VIF'er er et unikt værktøj, som holderflere fordele i forhold til traditionelle quantum dot SPT analyse: nr. indsættelse af ekstracellulære tags og tidskrævende ekstracellulære mærkning er påkrævet (cellelinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner kan anvendes); diffusionskoefficienter er udvundet fra den samlede pulje af fluorescerende proteiner i forhold til en delmængde mærket med quantum dots; analyse er enkel uden behov for at spore enkelt proteiner og analysen kan udføres ved hjælp af en eksisterende kode uden krav om ekstra bruger programmering. Metoden er hurtig, fordi det er en gennemsnitsberegning teknik, som muliggør hurtig beregning og beregning af diffusionskoefficienter. Disse hurtige diffusion målinger for proteinet befolkning supplerer de mere detaljerede molekylære transport af oplysninger indhentet til en delmængde af populationen af ​​de omhyggelige SPT metoder.

VIF'er tid korrelerer fluorescens mikroskopi billede sekvenser, der først er blevet forvandlet til Fourier rummet, og derved adskiller fluorescence udsving på grund af fotofysik fra dem på grund af molekylære transport 1.. Som et resultat heraf kan VIF bestemme antallet tæthed, flow hastighed og diffusion af fluorescensmærkede molekyler samtidig være upåvirkede af komplekse fotoblegning eller blinker af fluoroforer. Dette gør VIF'er et nyttigt værktøj til hurtigt at afgøre diffusion dynamik fluorescens-mærket cellemembranproteiner uden behov for brugerdefinerede skrive algoritmer. Udover fluorescensmærkede proteiner kan VIF også anvendes til quantum dot-mærkede membranproteiner 8.

Dette papir giver en trin-for-trin introduktion af, hvordan man bruger VIF'erne at udtrække diffusionskoefficienter af EGFP-mærkede plasmamembranproteiner ved at demonstrere, hvordan du placerer afgrøden, hvordan at bruge koden, og hvordan man vurderer de genererede plots, hvorfra diffusion koefficienter er udvundet. Som et eksempel, data opnået ved spinding disk-mikroskopi sæt i semi-total indre refleksion fluorescerernce (TIRF) tilstanden af ​​en nyre vand kanal protein aquaporin-3 (AQP3) tagget med EGFP præsenteres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Erhvervelse af EGFP-mærkede proteiner i plasmamembranen for VIF'er analyse kan udføres på et epifluorescensmikroskop en TIRF opsætning eller på en roterende skive mikroskopopstilling at erhverve billeder af membranen af ​​interesse. Kameraet pixelstørrelse samt tiden mellem billedfelter er nødvendig for analysen. Billede sekvenser af 100-1,200 rammer på en frame rate på 4-30 Hz kan bruges til analysen. Under købet, er det vigtigt at holde membranen i fokus under hele varigheden af ​​billedbehandling og fokusere på en brøkdel af den faste membran, hvor fluorescensen er ensartet fordelt. Flytning vesikler, udstående membran regioner og celleorganeller kan beskæres senere i analysen processen. Overtagelsen tid bør vælges således, at der ikke er nogen afdrift eller bevægelse af cellen.

For at få VIF'erne kode scripts til MATLAB, skal du kontakte Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). Første gang VIF'erne koden anvendes, åben MATLAB og klik fil, derefter indstille sti, klik derefter på Tilføj med undermapper og finde den mappe på computeren, hvor VIF-koden er beliggende. Klik derefter på OK, gemme og lukke. Fortsæt nu med analysen af ​​afgrøder, der er beskrevet i de næste punkter.

1.. Importer billedsekvens af interesse i et Imaging Analysis Program som en TIFF Stack

Gem filen med navnet: stack1.tif.

  1. Vælg et rektangulært område af interesse (ROI) på den flade del af membranen eksklusive bevægelige celleorganeller og fremskudt membran regioner. Afgrøden størrelse er valgt således, at nok Statistikken er genereret for god k 2 parceller.
  2. Beskær regionen og gem afgrøden som en TIFF-fil i en passende mappe. Hvis der er flere afgrøder fra samme film, skal du bruge en række tilvækst, fx "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
  3. Placer mappen med afgrøderne lokaltpå computeren, ikke på en server, mens du gør VIF'er analyse.

2.. Importer Afgrøder i Analysis Software én efter én at udføre analysen

  1. Åbent MATLAB og skriv "icsgui" i kommando-vinduet og tryk på ENTER. ICS GUI er det eksekverbare navn til billedet korrelationsspektroskopi grafisk brugerflade program.
  2. I ICS GUI klikke på fanen "VIF'er". Et skærmbillede af analysen vinduet vist i figur 1.
  3. Find mappen med mappen navnet "MATLAB kode" og rulle til filen med filnavnet "Scripts" og åbne denne ved at dobbeltklikke på det. Alternativt kan du højreklikke på filen og vælge "Åbn med Matlab" eller gå til filen, åbne i Matlab og åbn scripts fil. Denne fil hedder Editor.
  4. I Editor rulle til "Load VIF'er datasæt", derefter kopiere eller skriv filnavn og mappe placering i kommandolinjen som begyndermed img = fx "C: Users Dokumenter AQP3dynamics stack1crop.tif". I kommandolinjen under mappen placering angive antallet af frames der skal analyseres - fx [1:500]. Brug de samme indstillinger for alle på hinanden følgende film i dataserien. Hvis der er fokus afdrift i senere rammer, skal disse være udelukket fra analysen.
  5. I editoren klik på "gem" og derefter klikke på "evaluere celle". Datasættet er nu lagt i ind i analyse software.
  6. I VIF'erne Analyse vinduet i GUI, indtaste indstillingerne for analyse:
    1. Unclick "T-celle" bokse.
    2. Indtast antallet af tidsforskydninger, der skal analyseres. Antallet af tidsintervaller (τ) vil have indvirkning på spredningen plot og skal vælges således at diffusionen plot er lineær. Start med at indtaste 25 og derefter falde til hvor diffusion plot er lineær. τ er antallet af lang reaktionstid VIF'erne analyse sammenligner og en tidsforskydning er den tid between én ramme og den næste. Den mindste værdi, som giver et lineært plot bør vælges. Det maksimale antal af tidsforskydninger er valgt således, at en lineær fit er opnået, at vælge en højere værdi vil producere data, som ikke kan linje monteret.
    3. Indtast den maksimale k 2-værdi (se cirkel 1 i figur 1), er det normalt 20-50. En god k 2 plot er et plot, hvor der er mange datapunkter, der er fordelt langs en ​​linie. Start med at indtaste 70 og derefter falde efter at have evalueret de k 2 og diffusion plots og vælg den mindste værdi, hvor datapunkter klynge omkring en lige linje. K 2-værdien er den kvadrerede modulus af det rumlige k-vektoren i Fourier rummet.
      I første omgang bør analysen gentages, indtil de bedste værdier bestemmes derefter bruge de samme indstillinger for alle på hinanden følgende film i dataserier, men altid kontrollere, at de valgte indstillinger giver en god pasform til data: god k 2 parcellerog en lineær diffusion plot.
    4. Klik på "Gem indstillinger og fortsætte".
    5. Klik på "Ja" for at vise alle grafer.
    6. Klik på "Load billedserier" (se cirkel 2 i figur 1), og klik derefter på "arbejdsområdet".
    7. Vælg "imgSerCrop", og klik derefter på "Importer fra arbejdsområdet".
    8. Indtast indstillingerne for billedbehandlingssystem indsamlingsordninger. I boksen "pixel size" indtaste den forventede pixel-størrelse til imaging system, hvormed billedstakke erhverves. For AQP3-EGFP blev 0.111 anvendes. I feltet "Indtast tid (s) mellem rammer", blev 0,1150 brugt til AQP3-EGFP.
    9. Klik på "vælg ROIs", indtast "1", klik ok og "brug hele billedet".
    10. Klik på "Do VIF-analyse", og klik ja til at gøre "immobile filtrering". Resultaterne vil åbne automatisk som billeder.
    11. Minimer vinduet med indstillinger minimere celle info window, og minimere fotofysik vinduet. I dynamikken vinduet kontrollere, at dynamikken plot viser en lineær tilpasning af data til en linie med negativ hældning betyder, at datapunkter korrelerer og kan antages fri diffusion. Optag diffusionskoefficient for den specifikke tidsforsinkelse og k 2 indstillinger (det er ikke nødvendigt at bemærke standardafvigelsen af fit). Datapunkterne i K 2 parceller skal grupperet omkring linjen for givet tidsforskydninger.
    12. Afkrydsningsfeltet "Gem åbne tal som billeder", og klik derefter på "Gem åbne tal som billeder" for at gemme resultatet filer. Gem i en ny mappe under C: Users Dokumenter AQP3diffusion. Klik på "klar aktuelle data" og fortsætte med analysen af ​​den næste afgrøde.

3.. Gennemsnittet af den beregnede diffusionskoefficient beregnes til at få et overblik over de analyserede data

  1. Indtast de enkelte diffusionskoefficienter fra hver ROI i et spreadsheet (sørg for at notere τ og k 2 værdier), skal du bruge navnene på de afgrøder, som er angivet ovenfor.
  2. Beregn den gennemsnitlige diffusionskoefficient og standardafvigelse ved hjælp af et regnearksprogram.
  3. Udfør en Kolmogorov-Smirnov test eller studerende t-test til at evaluere statistiske forskelle ved hjælp af et signifikansniveau på 5%. Quantitave sammenligninger mellem celler (for eksempel behandlet vs ubehandlet) kan foretages.
  4. Åbn regnearket version af diffusions parceller, som blev genereret af analyse software for hver afgrøde, og gennemsnittet i data for hvert enkelt betingelse for hver forsinkelse. Generer en ny gennemsnit diffusion plot til at præsentere i papirer eller præsentationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

At erhverve egnede billedstakke der skal analyseres med VIF'erne kan forskellige mikroskopsystemer anvendes. Det er muligt at analysere billedsekvenser fra et epi-fluorescensmikroskop samt en TIRF eller roterende disk setup. Membranen skal være flade uden nogen store bevægelse celleorganeller eller flytte vesikler / objekter. Denne artikel præsenterer en tidsforskydning billede sekvens af AQP3 tagget med EGFP i levende MDCK celler afbildes på en roterende disk mikroskop med fokus sat til plasmamembranen på en frame rate på 9,2 Hz. Fokus blev sat på den basale (nederst) plasmamembranen. Dataene er for nylig blevet offentliggjort i AJP Cell 13.

Figur 2A viser et billede af cellen. Den scalebar er 10 mm og eksempel ROI afgrøder er fremhævet i rektangler. Ved udvælgelsen af ​​afgrøder, er det vigtigt at beskære ved periferien af ​​den celle, hvor membranen er ensartet og flad, så kun en todimensional diffusion visualiseres. Cell organeller, vesikler og membran fremspring bør undgås, og det er vigtigt for den analyse, der ikke er nogen afdrift i tidsforløbet. Eksempler på afgrøder, som ville være udelukket fra analysen er præsenteret i figur 2B og 2C. Flytning vesikler bidrager til sammenhængen (figur 2B), og huller i membranen, som i dette tilfælde bevæger lidt (figur 2C) naturligvis bør ikke medtages i analysen. Det er også vigtigt, at ROI afgrøden er stor nok til at have tilstrækkelig fysisk prøveudtagning til analyse (til billeddannelse med en høj NA objektiv mindst lineær størrelse på 32 pixel er en rimelig retningslinje). Til dette datasæt en 60X (NA 1,40) blev anvendt.

Figur 3A viser udbredelsen plot af én afgrøde genereret med VIF'erne. Denne metode kan bruges til at finde diffusionskoefficienten af ​​et protein mærket med EGFP (eller et andet fluorescerende protein), et farvestofeller quantum dots. Hældningen af ​​kurven i diffusion plot er simpelthen negativ af diffusionskoefficienten. I dette tilfælde diffusionskoefficient AQP3-GFP var 0,0104 ± 0,0040 mM 2 / sek. 3B er en beregnet diffusion plot med alt for mange tidsforskydninger, i dette tilfælde analysen var redone men med færre tidsforskydninger således at diffusion plot er lineær.

Figur 4A viser en typisk k 2 plot. Dette er den radialt gennemsnit og ln transformeret korrelation kurve for et udvalgt tidsforskydning. Fra disse k 2 plots hældningen afsættes mod tiden halter og resultatet er udbredelsen plottet som vist i figur 3A. Ved inspektion af k 2 parceller, er det vigtigt, at pasformen er evalueret. Figur 4B er et eksempel på ak 2 plot, for hvilke det kan konkluderes, at afgrøden er for lille og ikke kunne analyseres som det skalhar en negativ hældning og forfald lineært til en støj gulv. figur 4C er et eksempel på ak 2 plot, som skal analyseres igen med en reduceret maksimal k 2 værdi som pasformen er ikke længere godt (som bedømmes af de stigende residualer på større k 2 værdier). I dette tilfælde skal køres analysen igen at indtaste en lavere maksimal k 2 værdi, i dette tilfælde 25.

Figur 5 viser et gennemsnit diffusion plot gennemsnit over 10 afgrøder. Den diffusion plot blev fundet i Excel-filen fra analysen, og alle diffusions plots kan nu i gennemsnit for alle afgrøder fra samme eksperiment. I den resulterende diffusion plot forskellige behandlinger af cellen kan kombineres i den samme figur. Parallel tendens linjer er lige diffusionskoefficienter og ikke parallel tendens linjer angiver ulige diffusion. I denne figur er AQP3-EGFP diffusionskoefficient beregnet (data fra AJP Celle 13).


Figur 1.. Screen shot af VIF'ernes analyse vinduet. I dette vindue VIF'erne analysen er færdig. Cirklerne angiver, hvilke knapper til at presse på for de enkelte trin i protokollen. Klik her for at se større billede.

Figur 2
Figur 2.. Spinning disk image af en celle, der udtrykker GFP. (A) Repræsentant billede af en MDCK celle stabilt udtrykker AQP3-GFP og repræsentative afgrøder, er vist. Billedet er erhvervet på en roterende disk mikroskop med fokus tæt på den basale plasmamembran. (B) repræsen entative afgrøde, som blev udelukket fra analysen i VIF'er, da der er bevægelige vesikler, som kan bidrage til diffusionskoefficienten. (C) Et eksempel på en afgrøde, hvor der er et hul i membranen, således denne afgrøde blev udelukket fra analysen. Alle skala barer er 10 mM. Klik her for at se større billede.

Figur 3
Figur 3.. Diffusion plots. (A) en repræsentant diffusion plot, hvor alle peger ligger tæt på linjen pasform. Dette er en god diffusion plot, fordi dataene er lineær. (B) Et eksempel på en diffusion plot, som analysen skal laves om ved hjælp af et lavere antal timelags. 3highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Figur 4
Figur 4.. Eksempler på k 2 parceller. (A) Et eksempel på en god k 2 plot, hvor datapunkterne er ligeligt fordelt på hver side af linjen pasform. (B) Et eksempel på ak 2 plot for en afgrøde mindre end den optimale størrelse. I denne k 2 plot, hældningen af linien fit er positiv, bør det være negativt, og derfor afgrøden er udelukket fra analysen. (C) Denne k 2 plot viser, at analysen skal redone med en lavere maksimal k 2 værdi for at vælge den del af k 2 plot var dataene er ligeligt fordelt på hver side af linjen pasform.oad/51074/51074fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Figur 5
Figur 5.. Averaged diffusion plot. Et gennemsnit diffusion plot, der var i gennemsnit over 10 afgrøder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dette papir fremlagde en detaljeret trin-for-trin oversigt over hvordan man anvender VIF'erne analysemetode til at bestemme diffusionskoefficienter fra mikroskopi billeder af proteiner mærket med fluorescerende proteiner. Analysen er uafhængig af sondens valg med et meget bredt dynamikområde ved mærkning tæthed og kan således også anvendes til proteiner mærket med quantum dots samt farvestoffer og fluorescerende proteiner, såsom EGFP.

At beregne gyldige diffusionskoefficienter for de proteiner, der er flere kritiske trin, som er blevet optimeret. Det er vigtigt, at billedet mærkede proteiner på kun membranen. Hvis der er yderligere genstande som bevæger vesikler eller celleorganeller i billedet sekvens, der skal analyseres, vil disse bidrager til den beregnede diffusionskoefficient, som resulterer i under-eller overvurdering af diffusionskoefficienten.

Efter ovenstående trin, GUI koden for VIF'er er brugervenlig ennd analyse er hurtig. Det omfatter flere gennemsnit trin: herunder både den cirkulære udjævning og beregning af hældningen på skråninger diffusion plot som funktion af tidsforskydninger, hvilket letter hurtig generering af et gennemsnit og statistisk signifikant værdi for diffusionskoefficient. Således i forhold til den omfattende analyse er nødvendig for at beregne diffusionskoefficienter fra SPT eksperimenter, VIF er brugervenlig, hurtig og kan udføres uden specialuddannelse i biofysik.

Hvis analysen resulterer i en negativ diffusionskoefficient eller en horisontal diffusion plot, fejlfinding omfatter besigtigelse af afgrøden for at se, hvis det opfylder alle krav, der beskrives her. Afgrøder, der er for lille kan give unphysical negative diffusionskoefficienter og skal kasseres. For at beregne en diffusionskoefficient, er det ofte muligt at lave en ny afgrøde andetsteds i datasættet som er egnet til analyse eller blot øge afgrødenstørrelse, hvis det er muligt.

Denne teknik kan anvendes på de fleste datasæt, men i øjeblikket kan VIF'er analyse kun beregne en gennemsnitlig diffusionskoefficient og kan ikke skelne mellem forskellige protein migrationsmønstre eller generere baner. Brug VIF'er kan diffusionskoefficienter let ekstraheres og diffusion af et protein kan sammenlignes for eksempel mellem behandlede og ikke-behandlede celler eller mellem en vild-type og en mutant-protein, der vil afsløre, hvis behandling af mutationer inducere forskelle i udbredelse og dermed potentielt protein-protein-og / eller protein-lipid-interaktioner. Plasma membran diffusion af AQP2 målt ved FRAP viste sig at falde efter tilsætning af forskolin, en cAMP-agonist 10, og i øvrigt, i ER, en muteret version af AQP2 forårsager nefrogen diabetes insipidus, diffust anderledes end vildtype AQP2 9.

Selv om det er muligt at beregne diffusionskoefficienter fra enkelt partikel data hjælp gennemsnitlig kvadreret forskydning, trin størrelse analyser eller partikel billede korrelationsspektroskopi 2,11,12, kan disse analysemetoder bør beregningsmæssigt krævende og kræver ofte skik skrevet computer algoritmer. Fordelen af ​​VIF'erne protokol, der præsenteres her, er, at det er relativt uafhængig af mærkning tæthed og beregningsmæssigt let. Denne tur gennem VIF'er analyse vil således være nyttig for mange cellebiologer, der nemt kan anvende det til deres membran protein af interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en Lundbeck Junior Group Leader Fellowship til LNN. PWW erkender tilskud støtte fra naturvidenskab og teknik Forskningsråd Canada (NSERC). Vi takker også de danske Molekylær Bioimaging Center på University of Southern Danmark for adgang til spinding disk mikroskopi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 31600-083
FBS Invitrogen 10082147
Penicilin   Sigma 13752
Kanamycin Gibco 15160070
Streptomycin Gibco 11860038
Phenol red free medium Gibco 11880-028
DMSO Sigma D8418
HEPES Gibco 15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope Nikon Ti Eclipse
EMCCD Camera Andor Ixon+

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
  2. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
  3. Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
  4. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
  5. Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
  6. Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
  8. Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
  9. Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
  10. Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
  11. Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
  12. Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
  13. Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
Nem Måling af diffusionskoefficienter af EGFP-tagget plasmamembranproteiner Brug k-Space Billede korrelationsspektroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).More

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter