Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie

doi: 10.3791/51074 Published: May 10, 2014

Summary

Dit artikel geeft een stap voor stap handleiding om de fluctuatie analysetechniek k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) voor het meten van diffusiecoëfficiënten van fluorescent gelabelde plasmamembraan eiwitten in levende cellen van zoogdieren.

Abstract

Laterale diffusie en compartimentering van plasmamembraan eiwitten worden strak gereguleerd in cellen en dus, het bestuderen van deze processen zullen nieuwe inzichten onthullen plasmamembraaneiwit functie en regulatie. Onlangs, k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) 1 is ontwikkeld om routinematige metingen van diffusiecoëfficiënten staat rechtstreeks van beelden van fluorescent gelabelde plasmamembraaneiwitten, dat systematische fouten geïntroduceerd door sonde fotofysica vermeden. Hoewel de theoretische basis voor de analyse is complex, kan de werkwijze worden uitgevoerd door nonexperts met een vrij verkrijgbaar code diffusie coëfficiënten van proteïnen te meten. KIG berekent een tijd correlatie functie van een fluorescentie microscopie afbeelding stapel na Fourier transformatie van elk beeld om wederzijdse (k-) ruimte. Vervolgens circulaire middeling, natuurlijke logaritme transformeren en lineaire past om de correlatie functie levert de diffusiecoëfficiënt. Dezepapier zorgt voor een stap-voor-stap handleiding voor de beeldanalyse en meting van diffusiecoëfficiënten via KIG's.

Eerst wordt een hoge framesnelheid beeld sequentie van een fluorescent gemerkt plasmamembraaneiwit verkregen met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Vervolgens wordt een regio van belang (ROI) te vermijden intracellulaire organellen, bewegende blaasjes of uitstekende membraan regio geselecteerd. De ROI stack wordt geïmporteerd in een vrij beschikbare code en een aantal gedefinieerde parameters (zie methode sectie) ingesteld voor de KIG analyse. Het programma genereert vervolgens een "helling pistes" plot van de k-ruimte tijd correlatie functies, en de diffusie coëfficiënt wordt berekend uit de helling van het perceel. Hieronder is een stap-voor-stap KIG procedure om de diffusie coëfficiënt van een membraan eiwit meten met behulp van de renale waterkanaal aquaporine-3 gelabeld met EGFP als een canonieke voorbeeld.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De vierdimensionale spatiotemporele organisatie en laterale mobiliteit van plasmamembraaneiwitten zijn strak gereguleerd en kan een rol spelen in eiwitfunctie, activiteit en eiwit-eiwit interacties. Laterale diffusie van plasmamembraan eiwitten, is van oudsher bestudeerd door het berekenen diffusiecoëfficiënten voor enkele deeltjes van time-lapse imaging van quantum dot of kleurstof gelabelde plasmamembraaneiwitten 2-4. Deze benadering vereist het inbrengen van een extracellulair tag in de plasmamembraan eiwit quantum dot of kleurstof etikettering, die eiwitvouwing en functie kunnen beschadigen en derhalve niet kan worden bereikt voor sommige eiwitten. Het sterische volume van een quantum dot is aangetoond vertragen diffusie van het proteïne 5 en bovendien slechts een fractie van de eiwitten in de populatie zijn gelabeld met quantum dots, en het is niet bekend of deze fractie is representatief voor de totale pool van plasmamembraaneiwitten. Enkel deeltje tracking (SPT) metingen van diffusiecoëfficiënten uit beeld-serie van quantum dot gelabelde eiwitten betreft het in kaart brengen van de afgebeelde top posities van de deeltjes met twee dimensionale Gauss-fits gevolgd door uitgebreide analyse algoritmen. De analyse is computationeel zeer intensief, die uitgebreide niet-lineaire curve fitting in elk beeld frame van een time-lapse volgorde om benaderingen van de microscoop puntspreidingsfunctie (meestal twee dimensionale ruimtelijke Gaussians) en daaropvolgende koppeling van deeltje posities in deeltjestrajecten beschrijven van de beweging van enkele moleculen 6,7.

Een recent ontwikkelde beeldcorrelatie techniek, k-Ruimte Beeld Correlatie Spectroscopie (KIG's) maakt relatieve eenvoudige metingen van diffusiecoëfficiënten van fluorescent gelabeld plasmamembraan eiwitten. De mogelijkheid om routinematig berekenen diffusiecoëfficiënten van membraaneiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten door KIG is een unieke tool die houdteen aantal voordelen ten opzichte van traditionele quantum dot SPT analyse: geen invoeging van extracellulaire tags en tijdrovend extracellulaire etikettering vereist (cellijnen die fluorescerende eiwitten kunnen worden gebruikt); diffusie coëfficiënten worden uit de totale verzameling van fluorescente proteïnen ten opzichte van een subset gelabeld met quantum dots; analyse is eenvoudig zonder dat enige proteïnen volgen en de analyse kan worden uitgevoerd met een bestaande code zonder behoefte aan extra gebruikersprogrammering. De werkwijze is snel omdat het een gemiddelde techniek die snelle berekening en de berekening van diffusiecoëfficiënten maakt. Deze snelle verspreiding metingen voor het eiwit bevolking aanvulling op de meer gedetailleerde informatie moleculair transport voor een subset van de populatie verkregen door het zorgvuldige SPT methoden.

KIG tijd correleert fluorescentie microscopie afbeelding sequenties die van tevoren zijn omgevormd tot Fourier ruimte, en daardoor scheidt fluorescence schommelingen als gevolg van fotofysica uit die als gevolg van moleculaire vervoer 1. Hierdoor kan het aantal KIG dichtheid te bepalen, luchtsnelheid en verspreiding van fluorescent gelabelde moleculen terwijl onpartijdige door complexe fotobleken of knipperen van de fluoroforen. Dit maakt KIG een nuttig hulpmiddel voor het snel de verspreiding dynamiek van fluorescent gelabelde celmembraan eiwitten bepalen zonder aangepaste schrijven algoritmen. Naast fluorescent gelabelde eiwitten KIG kan ook worden toegepast op quantum dot-gemerkte membraaneiwitten 8.

Dit document biedt een stap-voor-stap introductie van hoe KIG gebruiken om diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten halen door aan te tonen hoe het gewas te plaatsen, hoe je de code en hoe u de gegenereerde percelen, te evalueren gebruiken waaruit diffusie coëfficiënten worden gewonnen. Als voorbeeld, gegevens verkregen door het draaien van schijf-microscopie set in semi-totale interne reflectie fluorescerenNVU (TIRF) modus van een nier waterkanaal eiwit aquaporin-3 (AQP3) getagged met EGFP wordt gepresenteerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Verwerving van EGFP-gelabeld eiwitten in de plasmamembraan van KIG analyse kan worden uitgevoerd op een epifluorescentie microscoop, een TIRF setup of op een draaiende schijf microscoop ingesteld om beelden van het membraan plaats verwerven. De camera pixelgrootte en de tijd tussen beeldframes nodig is voor de analyse. Afbeelding sequenties van 100-1200 frames met een beeldsnelheid van 4-30 Hz kan worden gebruikt voor de analyse. Tijdens de overname, is het belangrijk om het membraan in focus tijdens de duur van de beeldvorming en focus op een fractie van de vlakke membraan waarin de fluorescentie wordt gelijkmatig verdeeld. Moving blaasjes, uitstekende membraan regio's en celorganellen kan later in het analyseproces worden uitgesneden. De acquisitie tijd moet worden gekozen dat er geen drift of beweging van de cel.

Om de KIG code scripts voor MATLAB krijgen, contact opnemen met Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). De eerste keer dat de KIG code wordt gebruikt, geopend MATLAB en klik file en stel pad, klik voegen met submappen en vind de map op de computer waarin de KIG code zich bevindt. Klik vervolgens op OK, opslaan en sluiten. Ga nu verder met de analyse van gewassen in de volgende punten beschreven.

1. Importeer de afbeelding sequentie van belang in een Imaging Analysis Program als een TIFF Stack

Sla het bestand met de naam: stack1.tif.

  1. Selecteer een rechthoekig gebied van belang (ROI) op het vlakke gedeelte van het membraan zonder bewegende celorganellen en uitstekende membraan regio. Het gewas omvang wordt gekozen, zodat er voldoende statistieken worden gegenereerd ten goede k 2 percelen.
  2. Snijd de regio en sla het gewas als een TIFF-bestand in een geschikte map. Als er verschillende gewassen uit dezelfde film, gebruiken een aantal increment, bijvoorbeeld "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
  3. Plaats de map met de gewassen lokaalop de computer, niet op een server, terwijl het doen van KIG analyse.

2. Importeer de gewassen in de Analysis Software One by One om de analyses uit te voeren

  1. Open MATLAB en typ "icsgui" in het commando venster en druk op ENTER. ICS GUI is het uitvoerbare naam voor de afbeelding correlatie spectroscopie grafische gebruikersinterface programma.
  2. In de ICS GUI klik op het tabblad "KIG's". Een beeld van het analysevenster wordt getoond in figuur 1.
  3. Zoek de map met de naam van de map "MATLAB-code" en blader naar het bestand met de bestandsnaam "Scripts" en open deze door erop te dubbelklikken. Of klik rechtermuisknop op het bestand en kies "openen met MATLAB" of ga naar bestand, open in MATLAB en open de scripts bestand. Dit bestand heet Editor.
  4. In de Editor scroll naar "Load KIG data sets", deze te kopiëren of naam bestandstype en de map locatie in de opdrachtregel die begintmet img = bijvoorbeeld "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". In de opdrachtregel onder de map locatie stelt u het aantal frames te analyseren - bijv. [1:500]. Gebruik dezelfde instellingen voor alle opeenvolgende films in de gegevensreeks. Als er aandacht drift in latere frames, moeten deze van de analyse uitgesloten.
  5. In de editor klik op "opslaan" en klik vervolgens op "cel te evalueren". De dataset is nu geladen in in de analyse software.
  6. In het venster KIG Analyse in de GUI, voert u de instellingen voor de analyse:
    1. Unclick "T-cel" dozen.
    2. Voer het aantal vertragingen te analyseren. Het aantal keer dat vertragingen (τ) zal effect hebben op de verspreiding perceel en moet worden gekozen dat de diffusie perceel is lineair. Begin met het invoeren van 25 en dan af naar de plaats waar de diffusie plot is lineair. τ is het aantal er tijd verloopt de KIG analyse vergelijkt en een vertraging is de tijd bussen een frame en het volgende. De kleinste waarde die een lineaire grafiek geeft worden gekozen. Het maximum aantal vertragingen wordt gekozen dat een lineaire passing wordt verkregen, het kiezen van een hogere waarde gegevens die niet lijn worden gemonteerd produceren.
    3. Voer de maximale k 2-waarde (zie cirkel 1 in figuur 1), is het meestal 20-50. Een goede k 2 perceel is een perceel waar er veel datapunten die zijn verdeeld langs een lijn. Begin met het invoeren van 70 en dan af na de k 2 en diffusie percelen te hebben geëvalueerd en kies de laagste waarde waar de datapunten cluster rond een rechte lijn. De k2 waarde is de gekwadrateerde grootte van de ruimtelijke k-vector in Fourierruimte.
      In eerste instantie moet de analyse worden herhaald tot de beste waarden worden bepaald, gebruik dan dezelfde instellingen voor alle opeenvolgende films in de data-serie, maar altijd controleren of de geselecteerde instellingen geven een goede match met de gegevens: goede k 2 percelenen een lineaire diffusie plot.
    4. Klik op "Instellingen opslaan en verder".
    5. Klik op "ja" om alle grafieken tonen.
    6. Klik op "Load image serie" (zie cirkel 2 in figuur 1) en klik op 'werkruimte'.
    7. Selecteer "imgSerCrop", klik op "Importeren uit Workspace".
    8. Voer het imaging systeem collectie instellingen. In het vak "pixelgrootte" voer het geprojecteerde pixelgrootte voor de imaging-systeem waarin het beeld stapels worden verworven. Voor AQP3-EGFP, 0.111 gebruikt. In het vak "Voer de tijd (s) tussen frames", 0,1150 werd gebruikt voor AQP3-EGFP.
    9. Klik op "selecteer ROI", voert u "1", klik op OK en "gebruiken gehele beeld".
    10. Klik op "Do KIG analyse" en klik op Ja om "immobiel filtering" doen. De resultaten zullen automatisch open als afbeeldingen.
    11. Het venster instellingen te minimaliseren, het minimaliseren van de cel info Window, en het minimaliseren van het venster fotofysica. In het venster dynamiek, controleer dan of de dynamiek plot geeft grafisch weer een lineaire fit van de gegevens aan een lijn met een negatieve helling betekent dat de gegevens correleren en gratis verspreiding kan worden aangenomen. Noteer de diffusiecoëfficiënt van de specifieke vertraging en k 2 instellingen (het is niet nodig de standaardafwijking van de pasvorm noot). De gegevens in de k 2 percelen moet worden geclusterd rond de lijn voor de gegeven tijd loopt.
    12. Vakje "Opslaan geopend cijfers als afbeeldingen" en klik op 'Opslaan geopend cijfers als afbeeldingen "te redden leiden bestanden. Opslaan in een nieuwe map onder C: Users Documents AQP3diffusion. Klik op "clear huidige gegevens" en ga verder met de analyse van de volgende oogst.

3. Gemiddelde van het berekende diffusiecoëfficiënt wordt berekend om een ​​overzicht van de geanalyseerde gegevens ophalen

  1. Voer de individuele diffusiecoëfficiënten uit elke ROI in een SPREadsheet (zorg ervoor dat de τ noot en k 2 waarden), gebruik maken van de namen van de gewassen zoals hierboven uiteengezet.
  2. Bereken de gemiddelde diffusiecoëfficiënt en de standaarddeviatie met behulp van een spreadsheet programma.
  3. Voer een Kolmogorov-Smirnov test of een student t-test statistische verschillen te evalueren met behulp van een 5% significantie niveau. Kwantitatieve vergelijkingen tussen cellen (bijvoorbeeld behandelde versus onbehandelde) kunnen worden gemaakt.
  4. Open de spreadsheet versie van de diffusie percelen die werd gegenereerd door de analysesoftware voor elk gewas en de gemiddelde gegevens voor elke voorwaarde voor elke vertraging. Genereer een nieuwe gemiddelde diffusie plot voor de presentatie in kranten of presentaties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Om geschikte afbeelding stapels worden geanalyseerd met de KIG te verwerven, kunnen verschillende microscoop systemen worden gebruikt. Het is mogelijk om beeldsequenties van een epi-fluorescentiemicroscoop en een TIRF of draaiende schijf opstart analyseren. Het membraan moet vlak zijn, zonder grote bewegende celorganellen of bewegende blaasjes / objecten. Dit document presenteert een time lapse sequentie van beelden van AQP3 gelabeld met EGFP in levende MDCK cellen afgebeeld op een draaiende schijf microscoop met focus ingesteld op het plasmamembraan op een frame rate van 9,2 Hz. De focus is ingesteld op de basale (onderste) plasmamembraan. De data is onlangs gepubliceerd AJP Cell 13.

Figuur 2A toont een afbeelding van de cel. De scalebar is 10 mm en bijvoorbeeld ROI gewassen zijn gemarkeerd in rechthoeken. Voor de selectie van gewassen is het belangrijk te snijden aan de omtrek van de cel waarbij het membraan gelijkmatig en vlak dus slechts een tweedimensionale diffusie wordt gevisualiseerd. Cell organellen, blaasjes en membraan projecties moeten worden vermeden en het is belangrijk voor de analyse dat er geen drift gedurende het tijdsverloop. Voorbeelden van gewassen die uit de analyse wordt uitgesloten worden weergegeven in figuren 2B en 2C. Bewegende vesicles bijdragen aan de correlatie (figuur 2B) en gaten in het membraan dat in dit geval iets bewegen (figuur 2C) uiteraard niet worden opgenomen in de analyse. Het is ook belangrijk dat de ROI gewas groot genoeg om voldoende ruimtelijke bemonstering voor analyse (voor beeldvorming met een hoge NA objectieflens minimale lineaire afmeting van 32 pixels een redelijke leidraad) hebben. Voor deze dataset een 60X (NA 1,40) gebruikt.

Figuur 3A toont de verspreiding plot van een gewas gegenereerd met de KIG's. Deze methode kan worden gebruikt om de diffusiecoëfficiënt van een eiwit gelabeld met EGFP (of een ander fluorescerend eiwit) zien, een kleurstofof quantum dots. De helling van de curve bij de verspreiding plot is gewoon de negatieve van de diffusiecoëfficiënt. In dit geval, de diffusiecoëfficiënt van AQP3-GFP was 0,0104 ± 0,0040 micrometer 2 / s. Figuur 3B is een berekende diffusie perceel met teveel vertragingen, in casu de analyse werd vernieuwd maar met minder vertragingen zodat de diffusie plot lineair.

Figuur 4A presenteert een typische k 2 plot. Dit is de radiaalgemiddelde en ln getransformeerde correlatie curve voor een geselecteerde vertraging. Uit deze k2 percelen de helling wordt uitgezet tegen de vertragingen en het resultaat is de diffusie grafiek zoals getoond in figuur 3A. Bij de inspectie van de k 2 plaatsen, is het belangrijk dat de pasvorm wordt geëvalueerd. Figuur 4B is een voorbeeld van ak 2 Plot waarvan kan worden geconcludeerd dat het gewas te klein en kon niet worden geanalyseerd zoals het hoorteen negatieve helling en verval lineair een ruisvloer. Figuur 4C is een voorbeeld van AK 2 perceel dat moet worden opnieuw geanalyseerd met een verminderde maximale k2 waarde als de pasvorm niet meer goed (zoals beoordeeld door de toenemende residuen bij grotere k 2 waarden). In dit geval moet de analyse worden uitgevoerd opnieuw invoeren van een lager maximum k 2 waarde, in dit geval 25.

Figuur 5 toont een gemiddelde diffusie plot gemiddeld over 10 gewassen. De diffusie perceel werd gevonden in het Excel-bestand uit de analyse, en al diffusie plots het kan nu worden gemiddeld voor alle gewassen van hetzelfde experiment. De resulterende grafiek diffusie verschillende behandelingen van de cel kan worden gecombineerd in dezelfde figuur. Evenwijdige trendlijnen zijn gelijk diffusiecoëfficiënten en non parallelle trendlijnen geven ongelijke diffusie. In deze figuur is de AQP3-EGFP diffusiecoëfficiënt berekend (gegevens AJP Cell 13).


Figuur 1. Screen shot van de KIG's analyse venster. In dit venster de KIG's analyse wordt gedaan. De cirkels geven welke knoppen in te drukken voor de individuele stappen in het protocol. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2
Figuur 2. Schijfkopie van een cel die GFP Spinning. (A) representatief beeld van een MDCK stabiel tot expressie AQP3-GFP en representatieve gewassen getoond. Het beeld wordt verkregen op een draaiende schijf microscoop met focus dicht bij de basale plasmamembraan. (B) Repres woordiger gewas, die werd uitgesloten van analyse KIG omdat het bewegende blaasjes, die kan bijdragen tot de diffusiecoëfficiënt. (C) Een voorbeeld van een gewas waarbij er een gat in het membraan, dus dit gewas werd uitgesloten van analyse. Alle schaal bars zijn 10 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 3
Figuur 3. Diffusion percelen. (A) Een vertegenwoordiger diffusie plot waarin alle punt dicht bij de lijn pasvorm. Dit is een goede diffusie plot omdat de gegevens zijn lineair. (B) Een voorbeeld van een diffusie perceel waarvoor de analyse moet worden overgedaan met een lager aantal timelags. 3highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 4
Figuur 4. Voorbeelden van k 2 percelen. (A) Een voorbeeld van een goede k 2 grafiek waarin de gegevenspunten gelijk verdeeld aan weerszijden van de lijn passen. (B) Een voorbeeld van ak 2 plot voor een gewas kleiner dan de optimale grootte. In deze k 2 plot, de helling van de lijn pasvorm is positief, moet het negatieve en dus het gewas wordt uitgesloten van de analyse. (C) Deze k 2 plot laat zien dat het onderzoek moet worden overgedaan met een lagere maximale k 2 waarde om het deel van de k 2 plot selecteren waren de gegevens worden gelijk verdeeld aan weerszijden van de lijn pasvorm.oad/51074/51074fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 5
Figuur 5. Averaged diffusie plot. Een gemiddelde diffusie plot dat is gemiddeld meer dan 10 gewassen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deze paper gepresenteerd uitvoerige stap-voor-stap overzicht van hoe de KIG analysemethode gelden voor diffusie coëfficiënt te bepalen van microscopie beelden van eiwitten gelabeld met fluorescerende eiwitten. De analyse is onafhankelijk probe keuze met een zeer breed dynamisch bereik etikettering dichtheid en kan dus ook worden toegepast op eiwitten gelabeld met quantum dots en kleurstoffen en fluorescerende eiwitten zoals EGFP.

Geldige diffusie coëfficiënten voor de berekening van eiwitten, zijn er verschillende kritische stappen, die zijn geoptimaliseerd. Het is essentieel om het gelabelde eiwitten alleen op het membraan. Als er nog meer objecten zoals het verplaatsen blaasjes of celorganellen in de afbeelding die moet worden geanalyseerd, zullen deze bijdragen tot de berekende diffusiecoëfficiënt waardoor onder-of overschatting van de diffusiecoëfficiënt.

Naar aanleiding van de bovenstaande stappen, de GUI code voor de KIG's is gebruiksvriendelijk eennd analyse is snel. Het omvat een aantal van gemiddeld stappen: met inbegrip van zowel de circulaire middeling en de berekening van de helling van hellingen diffusie plot als functie van de tijd blijft, waardoor een snelle vorming van een gemiddelde en statistisch significante waarde voor de diffusiecoëfficiënt vergemakkelijkt. Zo is in vergelijking met de uitgebreide analyse die nodig is om diffusiecoëfficiënten berekenen van SPT experimenten, KIG is gebruiksvriendelijk, snel en kan worden uitgevoerd zonder gespecialiseerde opleiding in de biofysica.

Als de analyse resulteert in een negatieve diffusiecoëfficiënt of een horizontale diffusie plot, trouble-shooting omvat visuele inspectie van het gewas te zien of het voldoet aan alle hier beschreven eisen. Gewassen die te klein zijn kan onfysische negatief diffusiecoëfficiënten opleveren en moet worden weggegooid. Om een ​​diffusiecoëfficiënt berekenen, is het vaak mogelijk om een ​​nieuw gewas elders maken in de dataset die geschikt is voor analyse of gewoon verhogen gewasgrootte indien mogelijk.

Deze techniek kan worden toegepast op de meeste datasets maar nog kan KIG analyse alleen worden de gemiddelde diffusiecoëfficiënt en geen ander eiwit migratiepatronen onderscheiden of het genereren trajecten. Met KIG kan diffusie coëfficiënten gemakkelijk worden geëxtraheerd en verspreiding van een eiwit kan worden vergeleken bijvoorbeeld tussen behandelde en niet-behandelde cellen of tussen een wildtype eiwit en een mutant, die blijken of behandeling van mutaties verschillen in diffusie en dus eventueel in eiwit-eiwit en / of eiwit-lipide interacties. Plasmamembraan diffusie van AQP2 gemeten FRAP bleek af te nemen bij toevoeging van forskoline, een cAMP agonist 10, en bovendien, in het ER, een gemuteerde versie van AQP2 veroorzaken nefrogene diabetes insipidus, anders dan wildtype AQP2 9 verspreid.

Hoewel het mogelijk is om diffusie coëfficiënten te berekenen uit een deeltje data behulp gemiddelde kwadraat verplaatsing, stapgrootte analyse of particle image correlatie spectroscopie 2,11,12, kunnen deze analysemethoden computationeel veeleisend en vereisen vaak op maat geschreven computer algoritmes. Het voordeel van de KIG protocol hier gepresenteerde is dat het relatief onafhankelijk etikettering dichtheid en computationeel eenvoudig. Deze wandeling door KIG's analyse zal dus bruikbaar voor vele celbiologen, die gemakkelijk kunnen toepassen op hun membraan eiwit van belang zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door een Lundbeck Junior groepsleider Fellowship te LNN. PWW erkent subsidies steun van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC). We danken ook de Deense Molecular Bioimaging Center aan de Universiteit van Zuid-Denemarken voor de toegang tot spinning disk microscopie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 31600-083
FBS Invitrogen 10082147
Penicilin   Sigma 13752
Kanamycin Gibco 15160070
Streptomycin Gibco 11860038
Phenol red free medium Gibco 11880-028
DMSO Sigma D8418
HEPES Gibco 15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope Nikon Ti Eclipse
EMCCD Camera Andor Ixon+

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kolin, D. L., Ronis, D., Wiseman, P. W. k-Space image correlation spectroscopy: A method for accurate transport measurements independent of fluorophore photophysics. Biophysical Journal. 91, 3061-3075 (2006).
  2. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 26, 373-399 (1997).
  3. Bannai, H., Levi, S., Schweizer, C., Dahan, M., Triller, A. Imaging the lateral diffusion of membrane molecules with quantum dots. Nat Protoc. 1, 2628-2634 (2006).
  4. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nat Methods. 5, 695-702 (2008).
  5. Pinaud, F., et al. Dynamic partitioning of a glycosyl-phosphatidylinositol-anchored protein in glycosphingolipid-rich microdomains imaged by single-quantum dot tracking. Traffic. 10, 691-712 (2009).
  6. Wieser, S., Axmann, M., Schutz, G. J. Versatile analysis of single-molecule tracking data by comprehensive testing against Monte Carlo simulations. Biophys J. 95, 5988-6001 (2008).
  7. Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology. Journal of Structural Biology. 151, 182-195 (2005).
  8. Durisic, N., et al. Detection and correction of blinking bias in image correlation transport measurements of quantum dot tagged macromolecules. Biophys J. 93, 1338-1346 (2007).
  9. Umenishi, F., Verbavatz, J. M., Verkman, A. S. cAMP regulated membrane diffusion of a green fluorescent protein-aquaporin 2 chimera. Biophys J. 78, 1024-1035 (2000).
  10. Levin, M. H., Haggie, P. M., Vetrivel, L., Verkman, A. S. Diffusion in the endoplasmic reticulum of an aquaporin-2 mutant causing human nephrogenic diabetes insipidus. The Journal of biological chemistry. 276, 21331-21336 (2001).
  11. Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys J. 92, 613-621 (2007).
  12. Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys J. 65, 1135-1146 (1993).
  13. Marlar, S., Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Løcke, E. M., Christensen, B. M., Nejsum, L. N. Elevated cAMP increases aquaporin-3 plasma membrane diffusion. Am J Physiol Cell Physiol. 306, (2014).
Gemakkelijk Meting van diffusiecoëfficiënten van EGFP-gelabeld plasmamembraaneiwitten gebruik van K-Space Beeld Correlatie Spectroscopie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).More

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter