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Biology

Einfache Messung des Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembranproteine ​​Mit k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie

doi: 10.3791/51074 Published: May 10, 2014

Summary

Dieses Papier bietet eine Schritt für Schritt Anleitung, um die Fluktuationsanalyse-Technik k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) zur Messung der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenz in lebenden Säugerzellen gekennzeichnet Plasmamembranproteinen.

Abstract

Lateral Diffusion und Kompartimentierung der Plasmamembran-Proteine ​​sind fest in Zellen reguliert und damit das Studium dieser Prozesse werden neue Erkenntnisse zur Plasmamembran-Protein-Funktion und Regulation offenbaren. Kürzlich, k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) wurde entwickelt, um ein Routine-Messungen der Diffusionskoeffizienten direkt aus Bildern von fluoreszierend markierten Plasmamembran-Proteine, die von Photophysik Sonde eingeführt systematischer Fehler vermieden zu ermöglichen. Obwohl die theoretische Grundlage für die Analyse kompliziert ist, kann das Verfahren durch Nicht-Experten unter Verwendung einer frei verfügbaren Code zum Diffusionskoeffizienten von Proteinen messen implementiert werden. KIC berechnet eine Zeitkorrelationsfunktion von einem Fluoreszenzmikroskopie Bildstapel nach Fourier-Transformation jedes Bild, um gegenseitige (k-) Raum. Anschließend Kreismittelung, natürlichen Logarithmus-Transformation und lineare passt zu der Korrelationsfunktion ergibt sich die Diffusionskoeffizienten. DiesPapier bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Bildanalyse und Messung von Diffusionskoeffizienten über KIC.

Zuerst wird eine hohe Bildrate Bildsequenz eines fluoreszierend markierten Plasmamembranprotein mit einem Fluoreszenzmikroskop erfasst. Dann wird ein Bereich von Interesse (ROI) zu vermeiden intrazellulären Organellen, Vesikel bewegt oder hervorMembranBereiche ausgewählt. Die ROI-Stapel in einem frei verfügbaren Code importiert und mehreren definierten Parameter (siehe Abschnitt Methode) sind für die KIC Analyse gesetzt. Das Programm erzeugt dann einen "Hang Pisten" Handlung aus den k-Raum-Zeit-Korrelationsfunktionen und der Diffusionskoeffizient wird aus der Steigung des Grundstücks berechnet. Unten finden Sie eine Schritt-für-Schritt-Verfahren, um die KIC Diffusionskoeffizient eines Membranproteins messen mit der renalen Wasserkanal Aquaporin-3 mit EGFP als kanonische Beispiel verschlagwortet.

Introduction

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Die vierdimensionale Raum-Zeit-Organisation und die seitliche Beweglichkeit der Plasmamembran-Proteine ​​sind streng reguliert und können in Protein-Funktion, Aktivität und Protein-Protein-Wechselwirkungen eine Rolle spielen. Die laterale Diffusion von Plasmamembranproteinen, wird traditionell von der Berechnung Diffusionskoeffizienten für Einzelpartikel aus Zeitraffer-Bildgebung von Quantenpunkt-oder Farbstoff markierte Plasmamembran-Proteine ​​2-4 untersucht. Dieser Ansatz erfordert das Einführen eines extrazellulären Tag in der Plasmamembranprotein für Quantenpunkt oder Farbstoffmarkierung, die die Proteinfaltung und die Funktion beeinträchtigen können und daher nicht für einige Proteine ​​erreicht werden. Die sterische Volumen einer Quantenpunkt ist gezeigt worden, um die Diffusion des Proteins 5 zu verlangsamen und weiterhin nur ein winziger Bruchteil der Proteine ​​in der Bevölkerung mit Quantenpunkten markiert ist, und es ist nicht bekannt, ob diese Fraktion repräsentativ ist für die Gesamt Pool von Plasmamembranproteinen. Einzelpartikel tracking (SPT) Messungen der Diffusionskoeffizienten von Bild-Serie von Quantenpunkt-markierten Proteine ​​beinhaltet Zuordnung der abgebildeten Spitzenpositionen der Partikel mit zweidimensionalen Gauß-Anfälle durch umfangreiche Analysealgorithmen gefolgt. Die Analyse ist sehr rechenintensiv und erfordert umfangreiche nicht-lineare Kurvenanpassung in jedem Einzelbild einer Zeitraffersequenz, um Näherungen der Objektpunktverteilungsfunktion (typischerweise zweidimensionale räumliche Gauß) und anschließender Verknüpfung der Partikelpositionen in Trajektorien beschreiben die Bewegung einzelner Moleküle 6,7.

Eine kürzlich entwickelte Bildkorrelationsverfahren, k-Raum-Bild-Korrelations-Spektroskopie (KIC) ermöglicht relativ einfachen Messungen der Diffusionskoeffizienten von fluoreszenzmarkierten Plasmamembranproteinen. Die Möglichkeit, routinemäßig berechnen Diffusionskoeffizienten von Membranproteinen mit fluoreszierenden Proteinen markiert durch KIC ist ein einzigartiges Werkzeug, das hältmehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen Quantenpunkt SPT Analyse: Keine Insertion von extrazellulärem Tags und zeitaufwendig extrazelluläre Markierung erforderlich ist (Zelllinien, die fluoreszierende Proteine ​​verwendet werden können); Diffusionskoeffizienten aus dem Gesamtpool von fluoreszierenden Proteinen im Vergleich zu einer Teilmenge mit Quantenpunkten markiert extrahiert; Analyse ohne die Notwendigkeit, einzelne Proteine ​​verfolgt einfach und die Analyse kann unter Verwendung einer vorhandenen Code ohne Erfordernis zusätzlicher Anwenderprogrammierung durchgeführt werden. Das Verfahren ist schnell, da es eine Mittelungstechnik, die eine schnelle Berechnung und die Berechnung der Diffusionskoeffizienten ermöglicht. Diese schnellen Diffusionsmessungen für das Protein Bevölkerung ergänzen die detaillierte Informationen molekularen Transport durch die sorgfältige SPT Methoden für eine Teilmenge der Bevölkerung erhalten.

KIC Zeit korreliert Fluoreszenzmikroskopie Bildfolgen, die als erste Fourierraum transformiert worden sind, und dadurch trennt fluorescence Schwankungen durch Photophysik von den zur molekularen Transport ein. Als Ergebnis kann die Anzahl KIC Dichte zu bestimmen, Durchflussgeschwindigkeit und Diffusion von fluoreszenzmarkierten Molekülen während unvoreingenommene durch komplexe Photobleichen oder blinkt der Fluorophore. Dies macht KIC ein nützliches Werkzeug für die schnelle Bestimmung der Diffusionsdynamik des fluoreszenzmarkierten Zellmembranproteinen, ohne dass individuelle Schreib Algorithmen. Neben der fluoreszenzmarkierten Proteine, KIC auch auf Quantenpunkt-markierten Membranproteine ​​8 angewendet werden.

Dieses Papier bietet eine Schritt-für-Schritt-Einführung, wie man KIC verwenden, um Diffusionskoeffizienten von EGFP-markierten Plasmamembran-Proteine ​​durch den Nachweis, wie man die Ernte zu platzieren, wie man den Code und wie man die generierten Plots, auszuwerten extrahieren, aus dem Diffusions Koeffizienten extrahiert. Als Beispiel Daten durch Spinning-Disk-Mikroskopie-Set im internen Halbtotalreflexion erhalten fluoreszierennce (TIRF)-Modus, einer Nieren-Wasser-Kanal-Protein Aquaporin-3 (AQP3) mit EGFP markiert wird vorgestellt.

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Protocol

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Erwerb von EGFP-markierte Proteine ​​in der Plasmamembran für die KIC-Analyse kann auf einem Epifluoreszenzmikroskop, einem TIRF-Setup oder auf einem Spinning-Disk-Mikroskop eingestellt, um Bilder der Membran von Interesse erwerben geführt werden. Das Kamerapixelgröße sowie der Zeit zwischen Einzelbildern ist für die Analyse benötigt. Bildsequenzen von 100-1,200 Rahmen mit einer Rahmenrate von 4-30 Hz für die Analyse verwendet werden. Während der Erfassung, ist es wichtig, um die Membran scharf während der gesamten Dauer der Bilderzeugungs halten und sich auf einen Bruchteil der Flachmembran, in der die Fluoreszenz gleichmäßig verteilt. Umzug Vesikel, hervorstehende Membranbereiche und Zellorganellen kann später im Analyseprozess beschnitten werden. Die Erfassungszeit sollte so gewählt werden, dass es keine Drift oder Bewegung der Zelle.

KIC-Code Skripte für MATLAB zu erhalten, wenden Paul Wiseman (Paul.Wiseman @ McGill.ca). Das erste Mal die KIC-Code verwendet wird, geöffnet MATLAB und klicken Sie auf Datei, dann set path, klicken Sie dann auf Add mit Unterordnern und finden Sie den Ordner auf dem Computer, in dem die KIC-Code befindet. Dann klicken Sie auf OK, speichern und schließen. Jetzt mit der Analyse von Kulturen in den nächsten Punkten beschrieben fortsetzen.

1. Importieren Sie die Bildsequenz in der Nähe in einem Imaging-Analyse-Programm als TIFF-Stapel

Speichern Sie die Datei mit dem Namen: stack1.tif.

  1. Wählen Sie eine rechteckige Region of Interest (ROI) auf dem flachen Teil der Membran ohne bewegliche Zellorganellen und hervorstehende Membran Regionen. Die Erntemenge wird so gewählt, dass genügend Statistiken sind für eine gute k 2 Grundstücke erzeugt.
  2. Schneiden Sie das Region und speichern Sie die Ernte als TIFF-Datei in einem entsprechenden Ordner. Wenn es mehrere Pflanzen aus dem gleichen Film, verwenden Sie eine Reihe Schritt, z. B. "stack1crop.tif", "stack1crop2.tif", "stack1crop3.tif".
  3. Legen Sie den Ordner lokal mit den Kulturenauf dem Computer, nicht auf einem Server, während Sie KIC-Analyse.

2. Importieren Sie die Feldfrüchte in die Analyse-Software One by One, um die Analyse durchzuführen

  1. Offene MATLAB und geben Sie "icsgui" im Befehlsfenster, und drücken Sie ENTER. ICS-GUI ist die ausführbare Namen für das Bild-Korrelationsspektroskopie grafische Benutzerschnittstellenprogramm.
  2. In der ICS-GUI auf die Registerkarte "KIC". Ein Screenshot des Analysefensters ist in Fig. 1 gezeigt.
  3. Suchen Sie den Ordner mit dem Namen des Ordners "MATLAB-Code" und navigieren Sie zu der Datei mit dem Dateinamen "Scripts" und öffnen Sie diese durch Doppelklick. Alternativ der rechten Maustaste auf die Datei und wählen Sie "Öffnen mit MATLAB" oder gehen Sie zu Datei, in MATLAB offen und öffnen Sie das Script-Datei. Diese Datei wird als Editor.
  4. Im Editor navigieren Sie zu "Load KIC Datensätzen", dann kopieren oder Typ Dateinamen und Ordner in die Kommandozeile, die beginntmit img = zB "C: Users Documents AQP3dynamics stack1crop.tif". In der Kommandozeile unter dem Ordner die Anzahl der Frames analysiert werden - z. B. [1:500]. Verwenden Sie die gleichen Einstellungen für alle Folge-Filme in der Datenreihe. Wenn es Fokusdrift in späteren Bildern, sollten diese von der Analyse ausgeschlossen werden.
  5. Im Editor klicken Sie auf "Speichern" und dann auf "bewerten Zelle". Der Datensatz wird nun in in die Analyse-Software geladen.
  6. In der KIC Analyse-Fenster in der GUI, geben Sie die Einstellungen für die Analyse:
    1. Unclick "T cell"-Boxen.
    2. Geben die Anzahl der Zeitverzögerungen zu analysieren. Die Anzahl der Zeitverzögerungen (τ) wird Einfluss auf die Diffusions Grundstück haben und muss so gewählt werden, dass die Diffusion Handlung ist linear sein. Beginnen Sie mit der Eingabe 25 und dann, wo die Diffusions Handlung ist linear abnehmen. τ ist die Anzahl der Zeitverzögerungen der KIC-Analyse vergleicht und eine Zeitverzögerung ist die Zeit, bwischen einem Rahmen und die nächste. Der kleinste Wert, der eine lineare Handlung gibt gewählt werden. Die maximale Anzahl von Zeitverzögerungen ist so gewählt, daß eine lineare Regression erhalten wird, die Wahl eines höheren Wertes werden die Daten, die nicht Leitung angebracht werden können herzustellen.
    3. Geben Sie die maximale k 2-Wert (siehe Kreis 1 in Fig. 1), ist es in der Regel 20-50. Eine gute k 2 Grundstück ist ein Plot, in dem es viele Datenpunkte, die entlang einer Linie verteilt sind. Beginnen Sie mit der Eingabe 70 und dann ausgewertet, nachdem die k 2 und Diffusion Grundstücke zu verringern, und wählen Sie den niedrigsten Wert, wo die Datenpunkte gruppieren sich um eine gerade Linie. Der k-2-Wert ist der eckige Größe der k-Raumvektor im Fourierraum.
      Zunächst sollte die Analyse wiederholt, bis die besten Werte ermittelt werden, dann verwenden Sie die gleichen Einstellungen für alle folgenden Filme in der Datenreihe aber immer überprüfen, ob die gewählten Einstellungen geben eine gute Anpassung an die Daten werden: gut k 2 Grundstückeund einer linearen Diffusions Handlung.
    4. Klicken Sie auf "Einstellungen speichern und fahren".
    5. Klicken Sie "Ja", um alle Grafiken zeigen.
    6. Klicken Sie auf "Load Bild-Serie" (siehe Kreis 2 in Abbildung 1), dann klicken Sie auf "Arbeitsplatz".
    7. Wählen Sie "imgSerCrop", klicken Sie dann auf "Import aus Workspace".
    8. Geben Sie die Einstellungen für die Erfassung Abbildungssystem. In der Box "Pixelgröße" geben Sie die projizierten Pixelgröße für die Imaging-System, mit der die Bildstapeln erworben werden. Für AQP3-EGFP, 0,111 verwendet. Geben Sie im Feld "Geben Sie die Zeit (en) zwischen den Bildern", 0,1150 für AQP3-EGFP verwendet.
    9. Klicken Sie auf "Wählen ROIs", geben Sie "1", klicken Sie auf OK und "ganze Bild zu verwenden."
    10. Klicken Sie auf "Do KIC Analyse" und klicken Sie auf Ja zu "unbeweglich Filterung" zu tun. Die Ergebnisse werden automatisch als Bilder zu öffnen.
    11. Minimieren Sie das Einstellungsfenster, minimieren die Zelle info window, und das Fenster Photophysik zu minimieren. Im Fenster Dynamik, überprüfen Sie, dass die Dynamik Plot zeigt eine lineare Anpassung der Daten auf eine Linie mit einer negativen Steigung bedeutet, dass die Datenpunkte korrelieren und freie Diffusion ausgegangen werden. Aufzeichnen des Diffusionskoeffizienten für den bestimmten Zeitverzögerung und K 2 Einstellungen (es ist nicht notwendig zu beachten die Standardabweichung der Anpassung). Die Datenpunkte in den k 2 Grundstücke müssen auf der ganzen Linie für die gegebene Zeitverzögerungen geclustert werden.
    12. Tick ​​Feld "Speichern offenen Zahlen als Bilder", klicken Sie dann auf "Speichern offenen Zahlen als Bilder", um zu speichern Ergebnisdateien. Speichern Sie in einem neuen Ordner unter C: Users Dokumente AQP3diffusion. Klicken Sie auf "klare aktuellen Daten" und weiter mit der Analyse des nächsten Ernte.

3. Durchschnitts des berechneten Diffusionskoeffizient berechnet, um eine Übersicht über die analysierten Daten Get

  1. Geben Sie die einzelnen Diffusionskoeffizienten von jedem ROI in einem spreadsheet (stellen Sie sicher zu beachten die τ und k 2-Werte), verwenden Sie die Namen der Pflanzen, wie oben dargelegt.
  2. Berechnen Sie die durchschnittliche Diffusionskoeffizienten und Standardabweichung mit einem Tabellenkalkulationsprogramm.
  3. Führen Sie einen Kolmogorov-Smirnov-Test oder t-Test auf statistische Unterschiede zu bewerten mit einem 5%-Signifikanzniveau. Quantitave Vergleiche zwischen Zellen (beispielsweise gegen nicht-behandelten behandelt) hergestellt werden kann.
  4. Öffnen Sie die Tabelle Version der Diffusionsstücke, die durch die Analyse-Software für jede Kultur erzeugt wurde, und der Mittelwert der Daten für jeden Zustand für jede Zeitverzögerung. Erstellen Sie einen neuen gemittelten Diffusions Grundstück für die Präsentation in Papiere oder Präsentationen.

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Representative Results

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Geeignete Bildstapeln mit KIC analysiert erwerben können unterschiedliche Mikroskopsystemen verwendet werden. Es ist möglich, Bildsequenzen aus einem Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskop sowie ein TIRF-oder Spinning-Disk-Setup zu analysieren. Die Membran muss ohne großen bewegten Zellorganellen oder beweglichen Vesikel / Objekte flach sein. Dieser Beitrag stellt eine Zeitraffer-Bildfolge von AQP3 mit EGFP markiert live MDCK Zellen auf einer sich drehenden Scheibe Mikroskop mit Fokus auf der Plasmamembran mit einer Bildrate von 9,2 Hz eingestellt abgebildet. Der Fokus wurde auf der basalen (unten) Plasmamembran gesetzt. Die Daten wurden vor kurzem in AJP Zelle 13 veröffentlicht.

Fig. 2A zeigt ein Bild der Zelle. Die Maßstabsleiste ist 10 mm und beispielsweise ROI Pflanzen werden in Rechtecke markiert. Für die Auswahl der Pflanzen ist es wichtig, an der Peripherie der Zelle, wo die Membran einheitlich und flach, so dass nur eine zweidimensionale Diffusions visualisiert beschneiden. Cell Organellen, Vesikel und Membran Vorsprünge vermieden werden und es ist wichtig für die Analyse, dass es keine Drift während der Zeitspanne. Beispiele von Pflanzen, die von der Analyse ausgeschlossen werden würden, werden in den 2B und 2C dargestellt. Bewegen Vesikel Beitrag zur Korrelation (Fig. 2B) und die Löcher in der Membran, die in diesem Fall geringfügig bewegen (Fig. 2C) offensichtlich nicht in die Analyse einbezogen werden. Es ist auch wichtig, dass der ROI Ernte ist groß genug, um eine ausreichende räumliche Abtastung für die Analyse (für die Bildgebung mit einer hohen NA Objektiv eine Mindest linearen Größe von 32 Pixel ist eine vernünftige Richtlinie) zu haben. Für dieses Datensatzes ein 60X (NA 1.40) verwendet wurde.

3A zeigt die Diffusion Grundstück von einer Ernte mit KIC erzeugt. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um den Diffusionskoeffizienten eines Proteins mit EGFP (oder einem anderen fluoreszierenden Protein) markiert finden werden, einen Farbstoffoder Quantenpunkte. Die Steigung der Kurve in der Diffusionsstück ist einfach die Negativen der Diffusionskoeffizient. In diesem Fall ist der Diffusionskoeffizient von AQP3-GFP war 0,0104 ± 0,0040 &mgr; m 2 / s ist. 3B ist eine berechnete Diffusionsstück mit zu vielen Zeitverzögerungen in diesem Fall die Analyse wiederholt wurde, jedoch mit weniger Zeitverzögerungen, so daß die Diffusions Grundstück linear ist.

4A stellt eine typische k 2 Grundstück. Dies ist der radial gemittelten und ln transformiert Korrelationskurve für eine ausgewählte Zeitverzögerung. Von diesen k 2 Grund die Neigung gegen die Zeit aufgetragen nacheilt und das Ergebnis ist die Diffusionsstück wie in 3A gezeigt. Bei der Überprüfung der k 2 Grundstücke, ist es wichtig, dass die Passform wird ausgewertet. 4B ist ein Beispiel für ak 2 Grundstück, für die kann geschlossen werden, dass die Ernte ist zu klein und konnte nicht, wie es sollte analysiert werden,haben eine negative Steigung und Verfall linear bis zu einem Rauschen. 4C ist ein Beispiel für ak 2 Grundstück, das mit einem reduzierten maximalen k 2 Wert wie die Passform erneut analysiert werden muss, ist nicht mehr gut (wie durch die Erhöhung der Reststoffe in größeren k beurteilt 2 Werte). In diesem Fall muss die Analyse ausgeführt werden wieder die Eingabe einer geringeren maximalen k 2-Wert, in diesem Fall 25.

Abbildung 5 zeigt eine gemittelte Diffusions Grundstück, gemittelt über 10 Kulturpflanzen. Der Diffusions Grundstück wurde in der Excel-Datei aus der Analyse gefunden, und alle Diffusions Plots können jetzt für alle Pflanzen aus dem gleichen Versuch gemittelt werden. In der daraus resultierenden Diffusions Grundstück verschiedene Behandlungen der Zelle kann in der gleichen Figur kombiniert werden. Parallel Trendlinien sind gleich Diffusionskoeffizienten und nicht parallelen Trendlinien zeigen ungleiche Diffusion. In dieser Figur ist die AQP3-EGFP Diffusionskoeffizienten (Daten von AJP Zelle 13) berechnet.


Abbildung 1. Screenshot der KIC Analysefenster. In diesem Fenster die KIC-Analyse durchgeführt wird. Die Kreise zeigen an, welche Tasten für die einzelnen Schritte in dem Protokoll zu drücken. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 2
Abbildung 2. Disk-Image einer Zelle, die GFP Spinning. (A) Repräsentatives Bild eines MDCK-Zell stabil exprimieren AQP3-GFP und repräsentativen Kulturen gezeigt. Das Bild wird auf einer Drehscheibe Mikroskop mit Fokus in der Nähe des basalen Plasmamembran erworben. (B) Repres entative Ernte, die von der Analyse ausgeschlossen wurde in KIC, da es sich bewegenden Bläschen, die auf die Diffusionskoeffizienten beitragen können. (C) Ein Beispiel für eine Kultur, in der es ein Loch in der Membran, damit diese Kultur wurde von der Analyse ausgeschlossen. Alle Maßstabsbalken sind 10 um. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 3
Abbildung 3. Diffusion Parzellen. (A) Ein Vertreter Diffusions Grundstück, in dem alle Punkt sind nahe an der Linie fit. Dies ist eine gute Diffusions Grundstück, weil die Daten sind linear. (B) Ein Beispiel für eine Diffusions Grundstück, für das die Analyse muss mit einer geringeren Anzahl von timelags erneuert werden. 3highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Fig. 4
4. Beispiele für k 2 Grund. (A) Ein Beispiel für ein gut k 2 Diagramm, in dem die Datenpunkte gleichmäßig auf beiden Seiten des Linienanpassung verteilt. (B) Ein Beispiel von ak 2 Grundstück für eine Ernte kleiner als die optimale Größe. In diesem k 2 Grundstück, ist die Neigung der Linie fit positiv, sollte es negativ und damit die Ernte wird von der Analyse ausgeschlossen werden. (C) Das k 2 Plot zeigt, dass die Analyse muss mit einer geringeren maximalen k 2-Wert, um den Teil des k 2 Grundstück wählen wiederholt werden waren die Daten gleichmäßig auf beiden Seiten der Linie fit verteilt.oad/51074/51074fig4highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

Figur 5
Abbildung 5. Gemittelten Diffusions Handlung. Gemittelten Diffusions Ein Grundstück, das über 10 Kulturen gemittelt wurde.

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Discussion

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Dieses Papier präsentiert eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Überblick darüber, wie die KIC Analyseverfahren gelten für Diffusionskoeffizienten von Mikroskopiebilder von Proteinen mit fluoreszierenden Proteinen markiert bestimmen. Die Analyse ist unabhängig von der Wahl Sonde mit einem sehr breiten Dynamikbereich bei der Etikettierung Dichte und kann somit auch Proteine ​​mit Quantenpunkten sowie Farbstoffe und fluoreszierende Proteine ​​wie EGFP angewendet werden.

Gültige Diffusionskoeffizienten für die Proteine ​​zu berechnen, gibt es mehrere wichtige Schritte, die optimiert wurden. Es ist wichtig, Bild markierten Proteine ​​nur auf der Membran. Wenn es zusätzliche bewegte Objekte wie Bläschen oder Zellorganellen in der Bildfolge analysiert werden, werden diese auf den berechneten Diffusionskoeffizienten, die in Unter-oder Überschätzung der Diffusionskoeffizienten führt bei.

Nach den oben aufgeführten Schritte, ist die GUI-Code für die KIC benutzerfreundlich einnd Analyse ist schnell. Es umfasst mehrere Schritte durchschnittlich: sowohl der Kreismittelung und die Berechnung der Steigung der Piste Diffusions Grundstück als Funktion der Zeitverzögerungen, die schnelle Erstellung eines durchschnittlichen und statistisch signifikanten Wert für den Diffusionskoeffizienten erleichtert. So wird im Vergleich zu der umfassenden Analyse erforderlich, um Diffusionskoeffizienten von SPT Versuche, KIC berechnen ist benutzerfreundlich, schnell und kann ohne spezielle Ausbildung in der Biophysik durchgeführt werden.

Wenn die Analyse ergibt sich ein negativer Diffusionskoeffizienten oder einer horizontalen Diffusion Grundstück umfasst die Fehlersuche visuelle Inspektion der Ernte zu sehen, ob es alle hier beschriebenen Anforderungen erfüllt. Kulturen, die zu klein sind, können unphysikalischen negativen Diffusionskoeffizienten ergeben und muss entsorgt werden. Um einen Diffusionskoeffizienten berechnen, ist es oft möglich, eine neue Ernte an anderer Stelle in der Datenmenge, die für Analyse oder erhöhen Sie einfach die Ernte machenGröße, wenn möglich.

Diese Technik kann auf die meisten Datensätze angewendet werden, aber derzeit können KIC Analyse nur die Berechnung der durchschnittlichen Diffusionskoeffizienten und können nicht unterscheiden verschiedene Protein Migrationsmuster erzeugen oder Bahnen. Mit KIC können Diffusionskoeffizienten leicht extrahiert werden und Diffusion eines Proteins kann beispielsweise zwischen behandelten und nicht-behandelten Zellen oder zwischen einem Wildtyp-und ein mutiertes Protein, das zeigen wird, wenn die Behandlung von Mutationen induzieren Unterschiede in der Verbreitung und damit verglichen werden möglicherweise in Protein-Protein-und / oder Protein-Lipid-Wechselwirkungen. Plasmamembran durch Diffusion von AQP2 FRAP gemessen wurde gezeigt, dass bei der Zugabe von Forskolin, einer cAMP-Agonisten 10 zu verringern, und darüber hinaus im ER, eine mutierte Version von AQP2 verursacht Diabetes insipidus, anders als Wildtyp AQP2 9 diffundiert.

Obwohl es möglich ist, Diffusionskoeffizienten aus einzelnen Teilchen d berechnenata mit mittleren quadratischen Verschiebung, Schritt-oder Partikelgrößenanalyse Bildkorrelationsspektroskopie 2,11,12, können diese Analyseverfahren rechenintensive und häufig erfordern benutzerdefinierte geschrieben Computeralgorithmen. Der Vorteil der hier vorgestellten KIC-Protokoll ist, dass es relativ unabhängig von Markierungsdichte und rechnerisch einfach ist. Dieser Spaziergang durch KIC Analyse wird daher nützlich für viele Zellbiologen, die leicht an ihrer Membran-Protein von Interesse kann es sein, gelten.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von einem Lundbeck Junior Group Leader-Stipendium für LNN unterstützt. PWW erkennt Zuschussfinanzierung Unterstützung von den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Wir danken auch den dänischen Molekulare Bildgebung in der Biophotonik Center an der University of Southern Denmark für den Zugriff auf Spinning-Disk-Mikroskopie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco 31600-083
FBS Invitrogen 10082147
Penicilin   Sigma 13752
Kanamycin Gibco 15160070
Streptomycin Gibco 11860038
Phenol red free medium Gibco 11880-028
DMSO Sigma D8418
HEPES Gibco 15630056
Apparatus
Spinning Disk Microscope Nikon Ti Eclipse
EMCCD Camera Andor Ixon+

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References

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Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).More

Arnspang, E. C., Koffman, J. S., Marlar, S., Wiseman, P. W., Nejsum, L. N. Easy Measurement of Diffusion Coefficients of EGFP-tagged Plasma Membrane Proteins Using k-Space Image Correlation Spectroscopy. J. Vis. Exp. (87), e51074, doi:10.3791/51074 (2014).

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