Summary
Verlies van de oprichtende reflex heeft lang gediend als een standaard gedrags surrogaat voor bewusteloosheid, ook wel hypnose, bij proefdieren. Veranderingen in vluchtige anesthetische gevoeligheid door farmacologische middelen kunnen worden gedetecteerd met een zorgvuldig geregelde high-throughput beoordelingssysteem, dat kan worden aangepast voor levering van elke geïnhaleerde therapeutische.
Abstract
Een wenselijk eindpunt van algehele anesthesie is de staat van bewusteloosheid, ook wel bekend als hypnose. Het definiëren van de hypnotische toestand bij dieren is minder eenvoudig dan het is in menselijke patiënten. Een veel gebruikt gedrags surrogaat voor hypnose bij knaagdieren is het verlies van oprichtreflex (LORR), of het punt waarop het dier niet meer reageert op hun aangeboren instinct om de kwetsbaarheid van dorsale decubitus te voorkomen. We hebben een systeem om LORR gelijktijdig beoordelen in 24 muizen, terwijl een zorgvuldige controle voor potentiële verwart, inclusief temperatuurschommelingen en wisselende gasstromen ontwikkeld. Deze kamers staan betrouwbare beoordeling van verdoving gevoeligheid zoals gemeten door latentie om terug te keren van de oprichtende reflex (RORR) volgens een vast verdoving blootstelling. Als alternatief, het gebruik van een stapsgewijze toename (of afname) in verdoving concentratie, de kamers bepalen van de gevoeligheid van een bevolking aan inductie (of ontstaan) ook in staat stellen, zoals gemeten doorEC 50 en Hill helling. Tenslotte kan de gecontroleerde klimaatkamers hier beschreven worden aangepast voor verschillende alternatieve toepassingen, waaronder geïnhaleerde afgifte van andere geneesmiddelen, toxicologie studies en simultane real-time monitoring van de vitale functies.
Introduction
Algemene anesthetica worden gedefinieerd door hun vermogen om een omkeerbare staat van hypnose in een grote verscheidenheid van soorten, maar een uitleg over hoe zo'n diverse klasse van geneesmiddelen kan alle ontlokken een bijzondere eindpunt blijft ongrijpbaar veroorzaken. Een aantal theorieën geponeerd door de jaren heen, te beginnen met de Meyer-Overton correlatie tussen verdoving potentie en lipide-oplosbaarheid, die algemene membraan verstoringen voorgesteld als basis voor hypnose 1,2. Meer recente gegevens blijkt dat eiwit targets die neuronale signalering bijdragen aan verdovende effecten. Muizen hebben bewezen een onmisbare model verkennen deze theorieën door de homologie tussen muis en mens verdoving responsiviteit zijn. Hoewel een muis niet kan worden gevraagd over de subjectieve bewustzijn onder narcose, bepaalde primitieve reflexen dienen als bruikbare alternatieve middelen van knaagdier hypnose. In de eerste paar dagen na de geboorte, muizen ontwikkelen een reflexieve oprichtende response dat verhindert dat deze passief geplaatst in een liggende positie 3. De dosis van anesthesie waarbij een muis verliest zijn oprichtreflex correleert goed met de menselijke hypnotische doses 4.
Beoordeling van het verlies van oprichtreflex (LORR) is uitgegroeid tot een veel gebruikte laboratorium standaard voor het testen van narcose gevoeligheid in muizen, evenals een groot aantal andere soorten, waaronder ratten, cavia, konijn, fret, schapen en hond 5-8. De dosis van een gegeven verdoving waarbij Lorr optreedt voor leden van een soort is zeer consistent, maar kan aanzienlijk worden verschoven door omgevingsfactoren. Bijvoorbeeld, slaaptekort ratten zijn gevoelig voor zowel vluchtige en intraveneuze anesthetica 9 en ratten met een hoge aërobe capaciteit minder gevoelig voor isofluraan 10. Hypothermie is ook aangetoond dat de dosis van talrijke anesthetica ten behoeve hypnose in een breed spectrum van soorten 11-14 verminderen. In ordede verdoving dosis waarbij Lorr optreedt in een groep proefdieren betrouwbaar te identificeren, is het essentieel dat de testomgeving zorgvuldig gecontroleerd strakgetrokken, euthermia onderhouden en leveren gelijke hoeveelheden geneesmiddel voor alle vakken. Niet verrassend, zijn genetische factoren ook bekend om verdoving gevoeligheid 15-18 veranderen. Daarom moet een zorgvuldige afweging worden besteed aan het controleren voor genetische achtergrond 19.
We hebben een apparaat dat identieke gasvormige verdoving levering aan elk van de 24 muizen zorgt voor behoud van een constante 37 ° C omgeving ontwikkeld. De transparante cilindrische ontwerp van onze expositiekamers maakt een snelle LORR beoordeling en eenvoudige integratie van telemetrische fysiologische metingen. Dit systeem is aangetoond dat isofluraan, halothaan en sevofluraan inductie EC50 en tijd ontstaan in wild-type muizen 20 nauwkeurig te meten. We hebben ookdit systeem om veranderingen in anesthetische gevoeligheid in acht muizen met genetische mutaties en gerichte hypothalamus laesies 21-23. Hier beschrijven we twee manieren anesthetische gevoeligheid kan worden vastgesteld na een farmacologische interventie met onze gecontroleerde omgeving inrichting. Steady-state fenotypering van vluchtige verdoving inductie en de opkomst gevoeligheid vereist 8-10 uur en is daarmee het beste op maat gemaakt voor studies waarin experimentele omstandigheden niet veranderen, zoals bij chronische of langwerkende farmacologische interventies. Echter, voor kortwerkende behandelingen waarvan de gevolgen aanzienlijk verdwijnen na verloop van tijd presenteren we ook een eenvoudige procedure om veranderingen in oprichtreflex volgende stereotactisch-gerichte micro-injecties of intraveneuze behandeling met geneesmiddelen die een belangrijke invloed verdoving opkomst evalueren. Deze testen vormen een kleine subset van de mogelijke toepassingen van deze gecontroleerde omgeving, dat kan worden aangepast voor een aantal Subjects van een aantal soorten elk type van geïnhaleerde therapeutische ontvangen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren die hier worden genoemd zijn goedgekeurd door de Universiteit van Institutional Animal Care en gebruik Comite Pennsylvania.
1. Overzicht van de testapparatuur
- Het testapparaat bestaat uit 24 helder acryl cilindrische kamers 10 cm lang en 5 cm diameter (totaal volume van 200 ml). Deze maat is geschikt voor een typische 25 g volwassen muis. Chambers hebben havens waartussen voor gas-en uitlaat. Het eindstuk is afneembaar zodat dieren gemakkelijk in de kamer kan worden geladen. Gaspoort openingen zijn zorgvuldig afgedicht met teflon tape, terwijl de rubber O-ring pakkingen gebruikt om het verwijderbare uiteinde van de cilindrische kamers dichten.
- Elke kamer is gemonteerd op een rek, dat zit in een waterbad. Het rek wordt aangebracht zodat alleen het onderste gedeelte van de kamers (onder de gasinlaten) is ondergedompeld. Voor de stabiliteit, de achterkant van de kamer rust op een steun zodat de hele chamber zit horizontaal. Dit zorgt voor een gelijkmatige contact van de hele kamer met het bad.
- Polyethyleen buis verbindt een zuurstoftank een verdoving verdamper en vervolgens door een 10 L / min debiet meter. De buis splitst in 25 kleine diameter weerstanden van gelijke lengte een gelijke stroom wordt geleverd aan elk van de 24 kamers en een agent analysator.
- Vacuümleidingen verlaten elke kamer aan de andere kant van de gasinlaat. Dit bevordert unidirectionele stroming die opnieuw inademen van uitgeademde kooldioxide elimineert. Het vacuüm lijnen te combineren op een spruitstuk te verbinden met een in-house zuigleiding. Een pop-off ventiel langs de belangrijkste vacuüm lijn zorgt voor atmosferische druk omstandigheden in elke kamer.
- Het bad is gevuld met genoeg water om volledig contact met de bodem van elke kamer. Het water wordt gecirculeerd door het bad en op een constante 37 ° C door een pomp.
2. Controleer het systeem voorafgaand aan blootstelling
- CHeck dat de temperatuur van het waterbad 37 ° C in het bad.
- Stroom zuurstof met een snelheid van 5 l / min (200 ml / min per kamer + middel analyzer). Dompel elke kamer onder water en kijk voor bellen of het binnendringen van water in de kamer, die beide zijn een indicatie van lekkage. Seal eventuele lekken voor het begin van het experiment.
- Voor elke kamer, sluit u een 500 ml / min flow meter in de lijn na de kamer om ervoor te zorgen dat de stromen in evenwicht zijn over elk van de 25 gasleidingen. Dit zorgt ervoor dat de ingang 5 L / min stromen gelijkmatig verdeeld zodat elke kamer ontvangt 200 ml / min stroomsnelheid. Elke kamer niet ontvangen van de verwachte stroom moet haar in-en uitstroom buizen gecontroleerd op obstakels hebben.
- Kalibreer de agent analyzer om een meting van 0,00% isofluraan bij 100% zuurstof stroomt verzekeren.
3. Implantaat Temperatuur Transponder
- Een week voorafgaand aan gewenning, verdoven elke muis met 2% isofluraan.
- Steriliseer de dorsale nek met betadine.
- Injecteer een temperatuur transponder subcutaan tussen de schouderbladen met de steriele, voorverpakte injector naald.
- Toezicht houden op de injectieplaats dagelijks voor infectie en migratie van de transponder.
4. Wennen dieren te testen Chambers
- Vier dagen voor de eerste meting plaats alle muizen in afzonderlijke kamers voor 2 uur met 100% zuurstof stroomt.
- Herhaal stap 4.1 daags gedurende de vier dagen voor de meting aan de verstorende effecten van stress voorkomen door een nieuwe omgeving.
5. Voer de farmacologische interventie die u wilt testen voor effecten op het verdoving Gevoeligheid
- Deze ingreep kan een stereotaxische injectie in een specifiek deel van de hersenen 24, intraveneuze of intraperitoneale injectie 25 of afgifte van een geneesmiddel aan een bepaald hersengebied worden via een canule 26.
- Omdat deze procedures zelf verdoving gevoeligheid kan veranderen ten opzichte van naïeve dieren, moet een goede controlegroep dezelfde procedure ondergaan met drager injecties.
- Zorg ervoor dat de farmacologische interventie heeft een voldoende lange werkingsduur als u van plan bent om een stapsgewijs verhogen en / of verlagen van de bepaling van verdoving gevoeligheid zoals in stap 6 hieronder doen, anders gaat u naar stap 7.
6. Beoordelen verdoving Gevoeligheid behulp van de stapsgewijze EC 50 Bepaling voor Inductie en Emergence
- Plaats elk dier in afzonderlijke kamers met 100% zuurstof stroomt.
- Stel de isofluraan concentratie tot 0,4% * gedurende 15 minuten. Tijdens de laatste 2 minuten van deze periode, beoordeelt oprichtende reflex van elk dier door zacht glooiende de kamer totdat de muis op zijn rug wordt geplaatst. De oprichtende reflex wordt beschouwd als intact als en slechts als de muis in staat is om alle te herstellenhaar poten op de vloer van de kamer binnen 2 minuten.
- * Merk op dat 0,4% isofluraan is een subhypnotic dosis in C57BL/6J-muizen. Als een muizen verliezen hun oprichtende reflex bij de eerste stap, de eerste dosis was te groot en moet verlaagd worden op de volgende dagen.
- Noteer de stand van oprichtreflex voor elke muis en scan elke muis voor temperatuurgegevens. Een template record wordt getoond in tabel 1.
- Verhoog de isofluraan concentratie door ~ 0,05% gedurende 15 minuten en herhaal stap 7.2. Blijf dit doen totdat alle dieren hun oprichtende reflex hebben verloren.
- Optioneel: de procedure herhalen voor het verminderen van stapsgewijze isoflurane doses totdat alle dieren hun oprichtende reflex hebben herwonnen (zie stap 6.3).
- Om het experiment te beëindigen, schakelt u de isofluraan en spoel het hele systeem met 100% zuurstof gedurende 15 minuten. Dit zal helpen om hypoxie te voorkomen als de muizen herstellen voordat ze terug naar hun kooien en zal de experime beschermennter van enige verdoving blootstelling.
- Optioneel: indien het aantal dieren of het aantal verdoving concentraties worden beperkt als gevolg van resource of tijdsdruk, de curve-fit parameterschattingen-vooral de Hill helling kunnen ondergewaardeerd, valselijk lage foutschatting hebben. In dergelijke gevallen kan het nodig zijn om de anesthesie gevoeligheid meting stappen 6,1-6,6 op nog eens twee dagen experimentele parameter de werkelijke helling en de bijbehorende fout schatting volledig verkrijgen beschreven herhalen.
7. Beoordelen op korte termijn veranderingen in verdovende Gevoeligheid met Time to Emergence
- Plaats elk dier in afzonderlijke kamers met 100% zuurstof stroomt.
- Stel de isofluraan concentratie 1,2%, wat overeenkomt met de inductie ED 99 voor wildtype C57BL/6J-muizen 20. Behouden gedurende 30-60 min, afhankelijk van de verwachte duur van de actie van de acute interventie.
- Bevestigen LORR inalle dieren door zacht glooiende elke kamer tot muizen worden op hun rug gelegd.
- Schakel isofluraan en flow 100% zuurstof. Meet de tijd totdat elk dier herwint haar oprichtende reflex. Dit wordt bepaald door de plaatsing van alle vier poten op de vloer van de kamer en bevestigd door de aanwezigheid van drie opeenvolgende metingen met een intacte oprichtreflex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de bruikbaarheid van de stapsgewijze Lorr gekwantificeerd door langetermijneffecten van een farmacologische interventie. Iboteenzuur (IBA) een agonist van de glutamaterge N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor die vaak wordt gebruikt als een excitotoxinen permanente neuronale letsels veroorzaken. Hier geïnjecteerd we 10 nl van 1% IBA bilateraal in de ventrolaterale preoptic gebied (VLPO) van C57BL/6J-muizen een week voorafgaand aan het testen. De meerderheid van de neuronen in deze kern vertonen lage tarieven van vuren tijdens het wakker en specifiek hun activiteit te verhogen tijdens de non-rapid eye movement slaap, rapid eye movement slaap, en met de blootstelling aan hypnotische doses algemene anesthetica 23,27-29. Succesvolle laesies in de VLPO moet weerstand veroorzaken isofluraan geïnduceerde hypnose. Op elk toenemende isofluraan, de fractie van muizen die de oprichtreflex verloren werd uitgezet tegen de concentratie verdoving op een log schaal 10. GegevensVoor elke groep muizen (auto-injectie en IBA-geïnjecteerde) werd vervolgens fit met sigmoïdale dosis-respons curve. Omdat deze test begint altijd met alle dieren rechtop en altijd eindigt met dieren hebben verloren de oprichtreflex, onder en boven constanten werden beperkt tot 0 en 1 respectievelijk. De resterende vrije parameters van de curven zijn de EC50 of de concentratie van anesthesie waarbij 50% van de muizen oprichtreflex verloren, en de helling, die de populatievariantie weerspiegelt tijdens de hypnotische toestandsovergang. Een F-test werd gebruikt om een query of een inductie curve met gedeelde EC 50 en Hill hellingsparameters beste past zowel voertuig en IBA groepen of dat afzonderlijke inductie bochten met verschillende parameters beter passen bij de data. De vrijheidsgraden in deze test voortvloeien uit de ruwe datapunten onderliggende curve fit en dus afhangen van het aantal verdoving concentraties getest en het aantal parameters dat fit-EC 50 en Hill helling in dit geval. Stapsgewijze opkomst gegevens werden geanalyseerd en hetzelfde model tot gegevens voor inductie. Merk op dat de EC50 voor opkomst vrijwel altijd lager dan die van inductie door verdoving hysterese ook bekend als neurale traagheid 30. Anders dan verwachte resultaten, dieren die IBA ontvangen in de VLPO toonde geen significante verschillen in de EC 50 of helling inductie of ontstaan in vergelijking met draagstof geïnjecteerde controles (F 2,80 = 1,73 en p = 0,184 voor inductie, F 2, 88 = 2.89 en p = 0,061 voor opkomst). Dit geeft aan dat muis VLPO neuronen bestand tegen laesie met 1% IBA, wat bevestigd wordt met post-mortem histologische (niet getoond). Lu et al.. hebben eerder aangetoond dat een dosis van 10% IBA is vereist om de rat VLPO 31, maar histologisch onderzoek van de muis VLPO laesie na injectie van 10% IBA toonden ook geen significantcant cel verlies (niet getoond). De VLPO rat staat bekend als NMDA-receptoren 32 uiten. Aangezien 10% IBA is in staat om een acuut effect op de verdoving gevoeligheid uitoefenen wanneer ingespoten in de VLPO (zie figuur 2, bespreking hieronder), deze stelt dat de muis VLPO ook moeten beschikken over de NMDA-receptoren die nodig zijn voor de acties van IBA. Dus de reden voor de discrepantie tussen soorten blijft onduidelijk. Succesvolle muis VLPO beschadigingen zijn bereikt met behulp van een gerichte galanin-saporine 23.
Hoewel IBA geen langdurige gevolgen isofluraan gevoeligheid wanneer geïnjecteerd in de VLPO, zou de acute prikkelende aard van het geneesmiddel worden verwacht VLPO neuronen stimuleren en tijdelijk verhogen verdoving gevoeligheid. In figuur 2 hebben we de tijd gebruikt om het ontstaan van een proef grote acute verschuiving isofluraan gevoeligheid onmiddellijk na bilaterale IBA micro-injectie in de VLPO blijkens aanzienlijk verlengd aantonenhypnose na beëindiging van anesthesie levering (p <0,001). Omgekeerd, micro-injectie van IBA in de buurt mediale septum geen verandering in tijd ontstaan veroorzaakte vergeleken met vehikel geïnjecteerd controles (p> 0,05). Deze bevinding voegt een interessant facet van eerdere werk waaruit blijkt dat inactivatie van deze kern verlengt tijd tot opkomst 33,34. Gegevens voor experimentele en controlegroepen in de tijd om te ontstaan test is gemiddeld en vergeleken met een one-way ANOVA.
| Tijd | Isofluraan (% atm) | Muis # 1 | Muis # 2 | Muis # 3 | ... |
| 0.4 | - | - | - | - | |
| 12:15 | 0.45 | - | X | - | - |
| 12:30 | 0.5 | - | X | X | - |
| 12:45 | 0,55 | - | X | X | |
| ... | 0.6 | - | X | X | X |
. Tabel 1 Voorbeeld van een Logboek Blad voor de lange termijn verdoving Gevoeligheid Beoordeling: Elke 15 min de verdoving dosis werd verhoogd met 0,05% en oprichtreflex werd beoordeeld voor elk dier. "X" geeft dieren die hun oprichtreflex verliest voor een gegeven tijdstip en "-" geeft die de oprichtreflex gehandhaafd.
Figuur 1. Beoordeling van de oprichtreflex een week na iboteenzuur Injectie in de ventrolaterale preoptic NucLeus: De langdurige verdoving gevoeligheid test werd uitgevoerd op muizen met ofwel drager of iboteenzuur (IBA) geïnjecteerd in de ventrolaterale preoptic gebied (VLPO) een week voorafgaand aan het testen. Inductie en ontstaan voor elke groep te voorzien van een sigmoïdale dosis-responscurve (inductie in getrokken lijnen, ontstaan in stippellijnen) met het 95% betrouwbaarheidsinterval bracketing de best passende curves (gearceerde staven). Verdoving concentratie werd uitgezet op een schaal log 10. Overlappende 95% betrouwbaarheidsintervallen zijn weergegeven in paars. De sigmoïdale dosis-repsonse past voor zowel voertuigen en IBA groepen suggereren dat er geen bewijs is voor verschillende best-fit curves op basis van EC 50 en Hill helling. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Tijd om Evermenging na lokale micro-injectie van iboteenzuur: Onmiddellijk vóór evaluatie ontvingen muizen een micro-injectie van N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor agonist iboteenzuur (IBA) in de ventrolaterale preoptic kern (VLPO). Dit gebied staat bekend tijdens-isofluraan geïnduceerde hypnose te worden geactiveerd. IBA injectie leidde tot een scherpe toename van de tijd tot terugkeer van oprichtreflex vergelijking met draagstof geïnjecteerde controles (p <0,001). Tijd om opkomst voor dieren met IBA geïnjecteerd in mediale septum niet verschilde van controles (p> 0.05). Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de beoordeling van LORR in een enkele muis is een schijnbaar eenvoudige taak, het is niettemin essentieel om identieke fysiologische omstandigheden tussen onderwerpen handhaven om betrouwbare gegevens van een groep dieren te verzamelen. De strak gereguleerd, high-capacity LORR apparaat hier gepresenteerde biedt een manier om experimenten te standaardiseren en het maximaliseren van de efficiëntie. Door het volgen van de basisprincipes van de thermoregulatie en gelijke verdeling stroom, kan dit systeem eenvoudig worden herschapen en aangepast aan de behoeften van individuele onderzoekers 'fit. Kamer grootte kan worden geschaald andere soorten, zoals ratten en extra kamers kunnen worden opgevangen door het aanbrengen van meer vertakkingspunten de instroom en vacuüm. Alle onderwerpen zijn goed zichtbaar door de doorzichtige acryl kameren, die het mogelijk maakt om video op te nemen experimenten voor secundaire bevestiging post-hoc van de resultaten. De acryl is ook compatibel met radiofrequentie telemetrie systemen die kunnen worden gebruikt tempera bewakentuur, bloeddruk, en biopotentialen.
We presenteren twee verschillende methoden voor de beoordeling verdoving gevoeligheid na een farmacologische interventie. Zowel de tijd ontstaan en de stapsgewijze inductie test moet de onderzoeker om de aanwezigheid of afwezigheid van de oprichtreflex scoren. Zelfs met een expliciete definitie van LORR, zoals "niet in staat om alle vier de poten binnen twee minuten op zijn rug wordt uitgerold leggen op de kamer vloer", assessment kan enigszins subjectief zijn. Het is het beste om dezelfde behandeling verblind individuele scoren elk dier voor de duur van het experiment te zorgen voor samenhang. Bij het kiezen van welke test moet worden gebruikt voor verdoving gevoeligheid beoordeling moet de verwachte lengte van de ingang van de farmacologische interventie de beslissende factor zijn. Veel geneesmiddelen hebben een korte werkingsduur, waarbij de acute tijd ontstaan paradigma nuttige informatie over anesthesie gevoeligheid in een beperkte periodevan de tijd. Kan echter een geneesmiddel bij voorkeur beïnvloeden de gevoeligheid van een dier om inductie van hypnose in plaats van opkomst, veranderingen in de tijd op inductie zijn vaak moeilijk te detecteren omdat inductie treedt snel en vereist dus permanente evaluatie. Hoe langer stapsgewijze test voor EC 50 van inductie en de opkomst kan informatie geven over zowel de ingang en uitgang van hypnose. De totale lengte van het experiment zal afhangen van de stapgrootte waarmee verdoving concentratie gewijzigd bij elke stap, met typische inductie + opkomst testen gedurende ongeveer 8 uur. Verlaging van de verdoving stapgrootte rondom de verwachte EC50 en het aantal dieren in elke groep een beter geschikt dosis-responscurve geven maar ook verlengen de tijd die nodig is om de analyse te voltooien.
Sommige farmacologische interventies kunnen differentieel veranderen de minuut ventilatie van proefdieren in vergelijking met hun controles. TZijn veroorzaken ene groep naar de vluchtige anesthetische sneller dan de andere uitademen in de tijd ontstaan test, waardoor de resultaten verwarren. Solt et al.. beschrijven een goede alternatieve testmethode voor verdoving gevoeligheid in dit scenario 35. In hun experiment, wordt systemische methylfenidaat geleverd tijdens constante isofluraan blootstelling bij dieren die al in evenwicht gebracht met verdoving. Potentiële verstorende effecten op de minuut ventilatie zijn dus uitgesloten tijdens continue verdoving blootstelling als anestheticum opname en distributie tijdens steady-state condities juist zijn evenwicht gehouden door het metabolisme en de eliminatie. De kamers beschrijven we konden eenvoudig worden aangepast met een extra gasdichte poort om doorgang van buizen zorgen voor intraveneuze of intracerebrale drug delivery. Voorts zij opgemerkt dat de beschreven 15 min equilibreren tot elke concentratie verdoving de stapsgewijze assay niet voldoende zijn in bepaalde gevallen. Anesthetics met een hogere oplosbaarheid dan isofluraan, zoals halothaan, zal het langer duren om hun volledige concentratie in het weefsel te bereiken. Grotere dieren en dieren die grotere stappen in verdoving concentratie ondergaan, kunnen ook meer tijd in evenwicht nodig. Om te bepalen of 15 min echt geschikt voor equilibratie, moet verdoving weefselniveau in dezelfde concentratie anesthesie zowel opgaande of neergaande ledematen blootstelling gemeten.
Wanneer het vermogen van het dier verplaatsen fysisch of farmacologisch belemmerd, kan Lorr niet als een goede alternatieve middel van hypnose. De meest betrouwbare en meest gebruikte alternatief corticale elektro-encefalogram (EEG) opnamen. Hoewel EEG beter kunnen halen meer subtiele veranderingen in anesthetische gevoeligheid kan zijn, is aanzienlijk duurder te installeren dan de inrichting beschrijven we. Implantatie EEG-elektroden is een invasieve en tijdrovende procedure en de mogelijkheid om obtain gegevens uit meerdere muizen tegelijk wordt vaak beperkt door beschikbaarheid van de producten. Bovendien, de analyse van EEG-registraties is conceptueel meer abstract en moeilijk te interpreteren dan de eenvoudige binaire uitgang van LORR assessment. Daarom gedragstesten zoals die hier beschreven zijn vaak bruikbare methodes voor het snel screenen verdoving gevoeligheid. Merk op dat EEG-patronen die wijzen op opwinding en hypnose niet goed correleren met gedrag. LORR en EEG zijn verschillende eindpunten die beide waarschijnlijk bevatten nuttige informatie over verdoving gevoeligheid.
Naast de potentiële geneesmiddel geïnduceerde veranderingen in minuutventilatie en mobiliteit, zijn er verschillende andere beperkingen de hierin beschreven werkwijzen. Hoewel LORR is een standaard surrogaat voor hypnose over het veld, de criteria en methoden gebruikt voor de meting verschillen tussen laboratoria. Sommigen pleiten dat muizen worden geroteerd met een constante snelheid naar de oprichtreflex beoordelen. Permanente evaluatie logisch vernauwt de precieze timing waarmee de oprichtende reflex is verloren en / of winst, maar het kan de handeling worden gedraaid liggende stimulerender dan alleen overgebleven rugligging zijn. Bovendien stapsgewijze Lorr assessment is een tijdrovende test die verder kan worden verlengd indien 15 minuten equilibratie bij elke stap onvoldoende blijken te zijn.
Ondanks deze beperkingen, de mogelijke toepassingen voor dit protocol tot ver buiten de specifieke voorbeelden die we hebben gepresenteerd. Duidelijk, farmacologische interventies niet de enige methode waarmee narcose gevoeligheid kan worden gewijzigd; gericht laesies, anatomische afwijkingen en genetische mutaties kunnen allemaal worden getest met dezelfde stapsgewijze EC50 bepalen. De gecontroleerde omgeving systeem gepresenteerde kunnen worden gebruikt om elke vorm van geïnhaleerd geneesmiddel, zoals corticosteroïden, antibiotica of experimentele therapieën leveren. De mogelijkheid om veel muizen blootgesteld aan dezelfde amount van drugs in een keer maakt deze opstelling ideaal voor toxicologische studies. Bovendien, kamers dienen als een ideale post-operatieve herstel omgeving met gereguleerde omgevingstemperatuur en verse zuurstof flow. Dit apparaat is nuttig voor elke geval waarin fundamentele dierlijke vitale functies moeten worden bewaakt en gecontroleerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door R01 GM088156 en T32 HL007713-18. Wij willen Bill Pennie en Michael Carman bedanken van de Universiteit van Pennsylvania Onderzoek Instrumentatie Shop voor hun hulp bij het samenstellen van onze oprichtreflex apparaat.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
- Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , Fischer. Jena. (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R.
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
