Summary
La pérdida del reflejo de enderezamiento ha servido durante mucho tiempo como un sustituto de comportamiento estándar para la pérdida del conocimiento, también llamada la hipnosis, en animales de laboratorio. Las alteraciones en la sensibilidad anestésico volátil causadas por las intervenciones farmacológicas pueden ser detectados con un sistema de evaluación de alto rendimiento cuidadosamente controlado, que puede adaptarse para la entrega de cualquier terapéutica inhalada.
Abstract
Un punto final deseable de la anestesia general es el estado de inconsciencia, también conocida como la hipnosis. Definir el estado hipnótico en los animales es menos sencillo de lo que es en pacientes humanos. Un sustituto de comportamiento ampliamente utilizado para la hipnosis en roedores es la pérdida del reflejo de enderezamiento (LORR), o el punto en el que el animal ya no responde a su instinto innato para evitar la vulnerabilidad de decúbito dorsal. Hemos desarrollado un sistema para evaluar LORR en 24 ratones, mientras que al mismo tiempo cuidadosamente de controlar por factores de confusión potenciales, incluyendo fluctuaciones de temperatura y diferentes flujos de gas. Estas cámaras permiten una evaluación fiable de la anestesia la sensibilidad, medido por la latencia para volver del reflejo de enderezamiento (RORR) después de una exposición al anestésico fijo. Alternativamente, usando los aumentos paso a paso (o disminuye) en la concentración de anestésico, las cámaras también permiten la determinación de la sensibilidad de una población a la inducción (o la emergencia) según lo medido porCE 50 y pendiente de Hill. Finalmente, las cámaras ambientales controladas descritos aquí pueden adaptarse para una variedad de usos alternativos, incluyendo la entrega inhalado de otros fármacos, estudios de toxicología, y la monitorización simultánea en tiempo real de los signos vitales.
Introduction
La anestesia general se definen por su capacidad de causar un estado reversible de la hipnosis en una amplia variedad de especies, sin embargo, una explicación de cómo una clase tan diverso de drogas puede provocar todo un criterio de valoración singular sigue siendo difícil de alcanzar. Un número de teorías se han postulado largo de los años, a partir de la correlación de Meyer-Overton entre la potencia anestésica y solubilidad en lípidos, que sugirió interrupciones general de membrana como la base para el 1,2 hipnosis. La evidencia más reciente sugiere que los objetivos de proteínas que afectan a la señalización neuronal contribuyen a los efectos anestésicos. Los ratones han demostrado ser un modelo indispensable para la exploración de estas teorías debido a la homología entre murino y capacidad de respuesta anestésico humano. Aunque un ratón no puede ser preguntado por su conciencia subjetiva, bajo anestesia general, ciertos reflejos primitivos sirven medidas de sustitución como útiles de la hipnosis de los roedores. En los primeros días después del nacimiento, los ratones desarrollan una resp enderezamiento reflexivaOnse que éstos no pueden ser colocados de forma pasiva en una posición supina 3. La dosis de la anestesia en la que un ratón pierde su reflejo de enderezamiento se correlaciona bien con dosis hipnóticas humanos 4.
Evaluación de la pérdida de reflejo de enderezamiento (LORR) se ha convertido en un estándar de laboratorio ampliamente utilizado para las pruebas de sensibilidad anestésica en ratones, así como una variedad de otras especies, incluyendo rata, cobaya, conejo, hurón, ovejas, perro y 5-8. La dosis de un anestésico que se da en la que LORR se producirá para los miembros de una especie es extremadamente consistente, pero puede ser desplazado significativamente por factores ambientales. Por ejemplo, las ratas privadas de sueño son más sensibles tanto a los anestésicos volátiles e intravenosos 9 y ratas con alta capacidad aeróbica son menos sensibles a isoflurano 10. La hipotermia también se ha demostrado que disminuye la dosis de numerosos anestésicos necesarios para la hipnosis en un gran espectro de especies de 11-14. En ordenpara identificar de forma fiable la dosis de anestésico en el que LORR se produce en un grupo de animales experimentales, es crítico que el entorno de evaluación ser controlado cuidadosamente para minimizar el estrés, mantener euthermia, y entregar cantidades iguales de fármaco para todos los sujetos. Como era de esperar, también se conocen los factores genéticos para alterar la sensibilidad anestésica 15-18. En consecuencia, la consideración cuidadosa debe también tener en cuenta el control de los antecedentes genéticos 19.
Hemos desarrollado un aparato que asegura la administración de anestesia gaseosa idéntico a cada uno de 24 ratones, mientras que el mantenimiento de un ambiente constante 37 o C. El diseño cilíndrico transparente de nuestras cámaras de exposición permite una evaluación LORR rápido y fácil integración de las mediciones fisiológicas telemétricos. Este sistema ha sido mostrado para medir con precisión el isoflurano, halotano, y la inducción sevoflurano CE 50 y tiempo de emergencia en ratones de tipo salvaje 20. También hemos utilizadoeste sistema para observar los cambios en la sensibilidad anestésica en ratones con mutaciones genéticas y lesiones hipotalámicas dirigidos 21-23. Aquí se describen dos formas en las que la sensibilidad anestésico puede evaluarse después de una intervención farmacológica utilizando nuestro aparato de ambiente controlado. Fenotipado El estado de equilibrio de la inducción de la anestesia volátil y sensibilidad emergencia requiere 8-10 horas y es en consecuencia la mejor medida para estudios en los que las condiciones experimentales no cambian, como en las intervenciones farmacológicas crónicos o de larga duración. Sin embargo, para los tratamientos de corta acción cuyos efectos disiparse significativamente con el tiempo también presentamos un procedimiento simple para evaluar los cambios en los reflejos de recuperación siguientes microinyecciones estereotácticamente-específicas o tratamientos de drogas intravenosas que impactan significativamente la emergencia anestésico. Estas pruebas representan un pequeño subconjunto de las posibles aplicaciones de este sistema de ambiente controlado, lo que podría ser adaptado para cualquier número de subjECTS de una variedad de especies para recibir cualquier tipo de terapéutica inhalado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos con animales descritos en el presente documento han sido aprobados por la Universidad de Comité de Cuidado de Animales institucional y el uso de Pennsylvania.
1. Descripción general del aparato de ensayo
- El aparato de prueba consta de 24 cámaras cilíndricas transparentes de acrílico de 10 cm de largo y 5 cm de diámetro (volumen total de 200 ml). Este tamaño es apropiado para un típico 25 g de ratón adulto. Cámaras tienen puertos en cada extremo para la entrada y salida de gas. El extremo de salida es extraíble de modo que los animales pueden ser fácilmente cargados en la cámara. Aberturas del puerto de gas son cuidadosamente selladas con cinta de teflón, y juntas tóricas de goma se utilizan para sellar el extremo desprendible de las cámaras cilíndricas.
- Cada cámara está montada en un bastidor que se encuentra dentro de un baño de agua. El bastidor se monta de manera que se sumerge sólo la parte inferior de las cámaras (por debajo de las entradas de gas). Para la estabilidad, el extremo posterior de la cámara descansa sobre un soporte de modo que toda la chambER se encuentra en posición horizontal. Esto asegura un contacto uniforme de toda la cámara con el baño.
- Tubo de polietileno conecta un tanque de oxígeno a un vaporizador de anestésico, y luego pasa a través de una L / medidor de flujo 10 min. El tubo se divide en 25 resistencias de pequeño diámetro de igual longitud para garantizar la igualdad de flujo se entrega a cada una de las 24 cámaras y a un analizador agente.
- Líneas de vacío salir de cada cámara en el extremo opuesto de la entrada de gas. Esto promueve el flujo unidireccional que elimina reinspiración de dióxido de carbono exhalado. Las líneas de vacío se combinan en un colector para conectarse a una tubería de aspiración de la casa. Una válvula pop-off a lo largo de la línea principal de vacío asegura condiciones de presión atmosférica dentro de cada cámara.
- El baño se llena con agua suficiente para ponerse en contacto completamente la parte inferior de cada cámara. El agua se hace circular a través del baño y se mantuvo a una constante de 37 º C por una bomba.
2. Controle el sistema antes de la exposición
- Cdiablos que la temperatura del baño de agua es de 37 ° C en todo el baño.
- El flujo de oxígeno a una velocidad de 5 l / min (200 ml / min por la cámara + analizador de agente). Sumerja cada cámara bajo el agua y buscar burbujas o entrada de agua en la cámara, los cuales son indicativos de fugas. Selle todas las fugas antes de comenzar el experimento.
- Para cada cámara, conectar un medidor de flujo de 500 ml / min en la línea después de la cámara para asegurarse de que los flujos son equilibrados a través de cada una de las líneas de gas 25. Esto asegura que los flujos de entrada de 5 l / min se distribuirán de manera uniforme de modo que cada cámara recibe 200 de flujo ml / min. Cualquier cámara de no recibir el flujo esperado debería tener su entrada y el tubo de salida de comprobar si hay obstrucciones.
- Calibrar el analizador de agente para asegurar una lectura de 0.00% isoflurano cuando el 100% de oxígeno está fluyendo.
3. Implante Transponder Temperatura
- Una semana antes de la habituación, anestesiar a cada ratón con 2% de isoflurano.
- Esterilizar la zona dorsal del cuello con betadine.
- Inyectar por vía subcutánea transpondedor de temperatura entre los omóplatos utilizando el, aguja estéril del inyector preenvasados.
- Supervisar el sitio de la inyección diaria para la infección y la migración del transpondedor.
4. Habituar Animales Chambers Testing
- Cuatro días antes de la primera evaluación, coloque todos los ratones en cámaras individuales de 2 horas con 100% de oxígeno que fluye.
- Repita el paso 4.1 al día durante los cuatro días previos a la evaluación para evitar los efectos de confusión de estrés debido a un nuevo entorno.
5. Realizar la intervención farmacológica que desea probar los efectos de la anestesia Sensibilidad
- Esta intervención puede ser una inyección estereotáxica en una parte específica del cerebro 24, una inyección intravenosa o intraperitoneal 25, o la entrega de un fármaco a un área específica del cerebro a través de la cánula 26.
- Debido a que estos mismos procedimientos pueden cambiar la anestesia la sensibilidad en comparación con un animal no expuestos, un grupo de control adecuado debe someterse al mismo procedimiento con inyecciones de vehículo.
- Asegúrese de que la intervención farmacológica tiene una adecuada acción de larga duración si usted está planeando hacer un gradual aumento y / o disminución de determinación de la sensibilidad anestésica como se muestra en el paso 6 de abajo, de lo contrario, vaya al paso 7.
6. Evaluar Anestésico sensibilidad mediante el gradual CE 50 Determinación de inducción y emergencia
- Coloca cada animal en cámaras individuales con 100% de oxígeno que fluye.
- Ajustar la concentración de isoflurano al 0,4% * durante 15 min. Durante los últimos 2 minutos de este período, evaluar reflejo de enderezamiento de cada animal por suaves ondulaciones de la cámara hasta que el ratón se coloca sobre su espalda. El reflejo de enderezamiento se considera intacta si y sólo si el ratón es capaz de restaurar todosde sus patas a la baja de la cámara dentro de 2 min.
- * Tenga en cuenta que el 0,4% de isoflurano es una dosis subhipnóticas en ratones C57BL/6J. Si alguno de los ratones pierden su reflejo de enderezamiento en el primer paso, la dosis inicial era demasiado grande y debe reducirse en los días posteriores.
- Registre el estado del reflejo de enderezamiento para cada ratón y escanear cada ratón de los datos de temperatura. Se muestra un registro de plantilla en la Tabla 1.
- Aumenta la concentración de isoflurano por ~ 0,05% durante 15 minutos y repita el paso 7.2. Continúe haciendo esto hasta que todos los animales han perdido su reflejo de enderezamiento.
- Opcional: repita el mismo procedimiento para la disminución de las dosis de isoflurano gradual hasta que todos los animales han recuperado su reflejo de enderezamiento (véase el paso 6.3).
- Para finalizar el experimento, apague el isoflurano y lavar el sistema completo con oxígeno al 100% durante 15 min. Esto ayudará a prevenir la hipoxia como los ratones a recuperarse antes de ser devueltos a sus jaulas y protegerá la experimenter de cualquier exposición anestésico.
- Opcional: si el número de animales o el número de concentraciones anestésicas están limitados por falta de recursos o de tiempo, las estimaciones-en particular de los parámetros de la curva de ajuste de la pendiente-May Hill tener estimación del error poco apreciada, falsamente baja. En tales casos, puede ser necesario repetir la medición de la sensibilidad anestésica describe en los pasos 6.1 a 6.6 en un máximo de dos días experimentales adicionales para obtener totalmente parámetro de la verdadera pendiente de Hill y su correspondiente estimación de errores.
7. Evaluar los cambios a corto plazo en Anestésico sensibilidad con tiempo de emergencia
- Coloca cada animal en cámaras individuales con 100% de oxígeno que fluye.
- Ajustar la concentración de isoflurano al 1,2%, que corresponde a la inducción ED 99 para los ratones C57BL/6J de tipo salvaje 20. Mantener durante 30-60 minutos dependiendo de la duración esperada de la acción de la intervención aguda.
- Confirmar LORR entodos los animales por suaves ondulaciones cada cámara hasta que los ratones se colocan en la espalda.
- Apague el isoflurano y el flujo de oxígeno al 100%. Mida el tiempo hasta que cada animal recupera su reflejo de enderezamiento. Esto se define por la colocación de las cuatro patas en el suelo de la cámara y se confirmó por la presencia de tres pruebas consecutivas con un reflejo de enderezamiento intacta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La Figura 1 demuestra la utilidad del ensayo LORR por etapas para determinar los efectos a largo plazo de una intervención farmacológica. Ácido iboténico (IBA) es un agonista del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA) glutamatérgica que se utiliza a menudo como una excitotoxina para causar lesiones neuronales permanentes. Aquí se inyectó 10 nl de 1% IBA bilateralmente en el área preóptica ventrolateral (POVL) de ratones C57BL/6J una semana antes de la prueba. La mayoría de las neuronas de este núcleo presentan bajas tasas de despido durante la vigilia y, específicamente, a aumentar su actividad durante no el sueño REM, el sueño REM, y con la exposición a dosis hipnóticas de los anestésicos generales 23,27-29. Lesiones de éxito en el POVL deben causar resistencia a la hipnosis por el isoflurano. En cada nivel cada vez mayor de isoflurano, la fracción de ratones que habían perdido el reflejo de enderezamiento se representó frente a la concentración de anestésico en una escala log 10. Datospara cada grupo de ratones (inyectados con vehículo y se inyecta-IBA) era entonces de ajuste con una curva de dosis-respuesta sigmoidal. Debido a que este ensayo se inicia siempre con todos los animales en posición vertical y siempre termina con todos los animales que han perdido el reflejo de enderezamiento, inferior y superior constantes se veían obligados a 0 y 1, respectivamente. Los parámetros libres restantes de las curvas son la CE 50, o la concentración de anestésico en el que 50% de los ratones han perdido su reflejo de enderezamiento, y la pendiente de Hill, que refleja la varianza de la población durante su transición de estado hipnótico. Se utilizó una prueba F para consultar si una sola curva de inducción con CE compartida 50 y los parámetros cuesta de la colina se ajusten mejor el vehículo y los grupos IBA o si las curvas de inducción independientes con parámetros distintos mejor ajusta a los datos. Los grados de libertad en esta prueba surgen de los puntos de datos en bruto que se basa el ajuste de la curva y por lo tanto dependen del número de concentraciones anestésicas ensayados y el número de parámetros que se están fit-CE 50 y Hill pendiente en este caso. Fueron analizadas y modeladas de forma idéntica a los datos para la inducción de datos aparición escalonada. Tenga en cuenta que la CE 50 para la emergencia es casi siempre menor que la de la inducción debido a la histéresis anestésico también conocida como la inercia de los nervios 30. Contrariamente a los resultados esperados, los animales que recibieron IBA en el POVL no mostraron diferencias significativas en la CE 50 o pendiente de Hill para la inducción o aparición comparación con los controles inyectados con vehículo (F 2,80 = 1,73 y p = 0,184 para la inducción, F 2, 88 = 2,89 yp = 0,061 para la emergencia). Esto indica que las neuronas de ratón POVL son resistentes a la lesión con 1% de IBA, un hecho confirmado con histología post mortem (no mostrado). Lu et al. han demostrado previamente que se requiere una dosis de 10% IBA a lesionar la rata POVL 31, pero el examen histológico de la POVL ratón después de la inyección de 10% IBA también no mostró significativamentepérdida de células no puede (no mostrado). El POVL rata se sabe que expresa los receptores de NMDA 32. Dado que el 10% de la IBA es capaz de ejercer un efecto agudo en la sensibilidad a la anestesia cuando se inyecta en el POVL (véase la figura 2, más adelante), éste argumenta que la POVL ratón también debe poseer los receptores NMDA necesarios para las acciones de la IBA. Así, la razón de la discrepancia entre las especies aún no está claro. Lesiones POVL ratón exitosos se han cumplido con un galanina-saporina apuntado 23.
Aunque IBA no tiene un efecto a largo plazo sobre la sensibilidad isoflurano cuando se inyecta en el POVL, se esperaría que la naturaleza excitatoria aguda de este fármaco para estimular neuronas POVL y transitoriamente incrementar la sensibilidad anestésica. En la Figura 2, se ha utilizado el tiempo de prueba para demostrar la aparición de un gran cambio agudo en la sensibilidad isoflurano inmediatamente después de la microinyección bilateral IBA en el POVL como lo demuestra notablemente prolongadahipnosis después del cese de la administración de anestesia (p <0,001). Por el contrario, la microinyección de IBA en el septum medio cercano no causó ningún cambio en el tiempo de aparición comparación con los controles inyectados con vehículo (p> 0,05). Este hallazgo se suma una faceta interesante para trabajos anteriores que muestran que la inactivación de este núcleo se extiende el tiempo de aparición 33,34. Los datos correspondientes a los grupos experimentales y de control en el momento de la prueba aparición fue en promedio y en comparación con un ANOVA de una vía.
| Tiempo | El isoflurano (% atm) | Ratón # 1 | Ratón # 2 | Ratón # 3 | ... |
| 0.4 | - | - | - | - | |
| 24:15 | 0.45 | - | X | - | - |
| 24:30 | 0.5 | - | X | X | - |
| 24:45 | 0.55 | - | X | X | |
| ... | 0.6 | - | X | X | X |
. Tabla 1 Ejemplo de una hoja de registro para la Evaluación de la anestesia la sensibilidad a largo plazo: Cada 15 min la dosis anestésica se incrementó en un 0,05% y los reflejos de recuperación se evaluó para cada animal. "X" se refiere a animales que habían perdido su reflejo de enderezamiento para un punto de tiempo dado y "-" denota aquellas que mantuvieron su reflejo de enderezamiento.
Figura 1. Evaluación del reflejo de enderezamiento una semana después de la inyección de ácido iboténico en el ventrolateral preóptica NucLeus: El largo plazo ensayo de sensibilidad anestésica se llevó a cabo en ratones con vehículo o con ácido iboténico (IBA) inyecta en la zona preóptica ventrolateral (POVL) una semana antes de la prueba. Inducción y datos de emergencia para cada grupo se ajustan a una curva dosis-respuesta sigmoidal (inducción en líneas continuas, aparición de líneas discontinuas), junto con el intervalo de confianza del 95% horquillado las curvas de mejor ajuste (barras sombreadas). Concentración anestésica se representa en una escala log 10. La superposición de los intervalos de confianza del 95% se muestran en púrpura. La dosis-repsonse sigmoidal encaja para el vehículo y el IBA grupos sugieren que no hay evidencia de distintas curvas de mejor ajuste sobre la base de la CE 50 y pendiente de Hill. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Figura 2. Es hora de Eunificación después de la microinyección local de ácido iboténico: Inmediatamente antes de la evaluación, los ratones recibieron una microinyección de la N-metil-D-aspartato (NMDA) agonista del receptor de ácido iboténico (IBA) en el núcleo ventrolateral preóptica (POVL). Esta zona es conocida para ser activado durante la hipnosis por el isoflurano. Inyección IBA condujo a un aumento agudo en el momento de regresar del reflejo de enderezamiento en comparación con los controles inyectados con vehículo (p <0,001). Tiempo de aparición de animales con IBA inyecta en septum medial no difieren de los controles (p> 0,05). Haga clic aquí para ver la imagen más grande .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aunque la evaluación de LORR en un solo ratón es una tarea aparentemente sencilla, sin embargo es esencial para mantener las condiciones fisiológicas idénticas entre los sujetos con el fin de recopilar datos fiables a partir de un grupo de animales. El aparato LORR estrictamente regulados, de alta capacidad que aquí se presenta ofrece una manera de estandarizar los experimentos y maximizar la eficiencia. Siguiendo los principios básicos de la termorregulación y la distribución equitativa de flujo, este sistema puede ser recreado y personalizado para adaptarse a las necesidades individuales de los experimentadores fácilmente. Tamaño de la cámara puede ser escalado para otras especies, como las ratas, y las cámaras adicionales pueden ser acomodados uniendo más puntos de ramificación de la entrada y de vacío. Todos los sujetos son fácilmente visibles a través de las cámaras de acrílico transparente, que hace posible a los experimentos de registro de vídeo para la confirmación post-hoc de secundaria de los resultados. El acrílico es también compatible con los sistemas de telemetría de frecuencia de radio, que pueden ser utilizados para monitorear temperaturatura, la presión arterial, y biopotenciales.
Se presentan dos métodos diferentes para evaluar la sensibilidad de anestesia después de una intervención farmacológica. Tanto el tiempo de aparición y las pruebas de inducción por pasos requieren el experimentador para anotar la presencia o ausencia del reflejo de enderezamiento. Incluso con una definición explícita de LORR, tales como "no se puede colocar las cuatro patas en el suelo de la cámara dentro de los dos minutos de haber sido enrollado sobre su espalda", la evaluación puede ser algo subjetivo. Lo mejor es tener el mismo trato individual ciego anotar cada animal durante la duración del experimento para garantizar la coherencia. Al elegir qué prueba va a utilizar para la evaluación de la anestesia la sensibilidad, la duración prevista del efecto de la intervención farmacológica debe ser el factor decisivo. Muchos fármacos tienen una acción de corta duración, por lo que el tiempo de aguda a la aparición de paradigma puede proporcionar información útil sobre la sensibilidad a la anestesia en un período de tiempo limitadode tiempo. No obstante, un medicamento puede afectar preferentemente a la sensibilidad de un animal para la inducción de la hipnosis en lugar de la emergencia, los cambios en el tiempo de la inducción a menudo son difíciles de detectar debido a la inducción se produce rápidamente y por lo tanto requiere la evaluación continua. La prueba por etapas más tiempo para que la CE 50 de la inducción y la emergencia puede dar información tanto de entrada y salida de la hipnosis. La longitud total del experimento dependerá del tamaño del incremento por el cual la concentración de anestésico se altera en cada paso, con las pruebas de inducción + emergencia típicos dura cerca de 8 horas. Disminuir el tamaño de paso anestésico alrededor de la prevista CE 50 y aumentar el número de animales en cada grupo dará una curva de dosis-respuesta mejor equipada sino que también alargar el tiempo requerido para completar el ensayo.
Algunas intervenciones farmacológicas pueden alterar diferencialmente la ventilación minuto de animales de experimentación en comparación con sus controles. Tsu podría causar un grupo para exhalar el anestésico volátil en el tiempo de prueba de emergencia más rápidamente que el otro, confundiendo de este modo los resultados. Solt et al. describir un buen método alternativo para probar la sensibilidad anestésica en este escenario 35. En su experimento, el metilfenidato sistémica se entrega durante la exposición isoflurano constante en los animales que ya se han equilibrado con la anestesia. Efectos de confusión potenciales en la ventilación por minuto son así excluidos durante la exposición continua de anestésico como la captación de anestésico y la distribución en condiciones de estado estacionario son equilibradas precisamente por el metabolismo y la eliminación. Las cámaras que describimos podrían ser fácilmente modificados con un puerto hermético al gas adicional para permitir el paso de la tubería para la administración de fármacos por vía intravenosa o intracerebral. También hay que señalar que el descrito 15 min de equilibración a cada concentración de anestésico en el ensayo de paso a paso podría no ser suficiente en algunos casos. Anesthetics con una solubilidad mayor que el isoflurano, tales como halotano, tardarán más en llegar a su concentración completa en el tejido. Los animales más grandes y los animales que se someten a grandes pasos en la concentración de anestésico también pueden requerir más tiempo para equilibrar. Para determinar si 15 min es realmente adecuado para el equilibrado, se deben medir los niveles tisulares de anestesia a la misma concentración de anestésico tanto en el ascendente y descendente extremidades de la exposición.
En los casos en que la capacidad del animal para mover se ve obstaculizada físicamente o farmacológicamente, LORR no puede servir como una buena medida sustituta de la hipnosis. La alternativa más confiable y ampliamente utilizado es (EEG) corticales electroencefalográficos. Aunque EEG puede ser más capaz de detectar cambios sutiles en la sensibilidad a la anestesia, es significativamente más caro de instalar que el aparato se describe. La implantación de electrodos de EEG es un procedimiento invasivo y requiere mucho tiempo, y la capacidad de obtaen los datos de varios ratones al mismo tiempo que a menudo limitada por la disponibilidad del equipo. Por otra parte, el análisis de los registros de EEG es conceptualmente más abstracto y difícil de interpretar que la salida binaria sencilla de evaluación LORR. Por estas razones, las pruebas de comportamiento como los descritos aquí son a menudo métodos más viables para cribar rápidamente la sensibilidad anestésica. Tenga en cuenta que los patrones de EEG sugestivos de la excitación y la hipnosis pueden no correlacionarse bien con la conducta. LORR y EEG son puntos finales distintos que ambos probablemente proporcionen información útil con respecto a la anestesia la sensibilidad.
Además de los posibles cambios inducidos por fármacos en la ventilación minuto y la movilidad, hay varias otras limitaciones a los métodos descritos en el presente documento. Aunque LORR es un sustituto estándar para la hipnosis a través del campo, los criterios y la metodología utilizada para su medición difieren entre laboratorios. Algunos abogan que los ratones se deben rotar a una velocidad constante para evaluar el reflejo de enderezamiento. La evaluación continua se reduce lógicamente el momento preciso con el que el reflejo de enderezamiento se pierde y / o devoluciones, sin embargo, el acto de ser dado vuelta en posición supina puede ser más estimulante que simplemente permaneciendo en posición supina. Además, la evaluación por etapas LORR es un ensayo de tiempo que puede ser extendido si los 15 minutos de equilibrio a cada paso se encuentra para ser insuficiente.
A pesar de estas limitaciones, las posibles aplicaciones de este protocolo se extienden mucho más allá de los casos específicos que hemos presentado. Es evidente que las intervenciones farmacológicas no son el único método por el cual la anestesia la sensibilidad podría ser alterado; lesiones específicas, anormalidades anatómicas, y las mutaciones genéticas pueden ser probados utilizando el mismo paso a paso EC50 determinación. El sistema de ambiente controlado que aquí se presenta se puede utilizar para ofrecer cualquier tipo de medicamento inhalado, como los corticosteroides, antibióticos o terapias experimentales. La capacidad de exponer muchos ratones a la misma amount de drogas a la vez hace que esta configuración ideal para estudios de toxicología. Además, las cámaras sirven como un entorno de recuperación post-quirúrgica ideal, con temperatura ambiente regulado y el flujo de oxígeno fresco. Este aparato es útil para cualquier instancia en la que los signos vitales básicos de los animales deben ser supervisados y controlados.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta labor fue apoyada por R01 GM088156 y T32 HL007713-18. Nos gustaría dar las gracias a Bill Pennie y Michael Carman de la Universidad de Pennsylvania Investigación Instrumentación Shop por su ayuda en el montaje de nuestro aparato reflejo de enderezamiento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
- Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , Fischer. Jena. (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R.
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
