Summary
Perte du réflexe de redressement a longtemps servi comme un substitut de comportement standard pour la perte de conscience, aussi appelé l'hypnose, chez les animaux de laboratoire. Altérations de la sensibilité anesthésique volatil causés par des interventions pharmacologiques peuvent être détectés avec un système d'évaluation à haut débit soigneusement contrôlé, qui peut être adapté pour la livraison de toute thérapeutique inhalé.
Abstract
Un critère souhaitable de l'anesthésie générale est l'état d'inconscience, aussi connu comme l'hypnose. Définir l'état hypnotique chez les animaux est moins simple qu'elle ne l'est chez les patients humains. Un substitut du comportement largement utilisé pour l'hypnose chez les rongeurs est la perte du réflexe de redressement (LORR), ou le moment où l'animal ne répond plus à leur instinct inné d'éviter la vulnérabilité de décubitus dorsal. Nous avons développé un système d'évaluation LORR dans 24 souris simultanément tout en contrôlant soigneusement pour les facteurs de confusion potentiels, y compris les variations de température et différents flux de gaz. Ces chambres permettent une évaluation fiable de la sensibilité anesthésie mesurée par la latence pour revenir du réflexe de redressement (RORR) après une exposition anesthésie fixe. Sinon, en utilisant par étapes augmente (ou diminue) de la concentration anesthésique, les chambres permettent également la détermination de la sensibilité de la population à induction (ou l'émergence), telle que mesurée parCE 50 et la pente de Hill. Enfin, les chambres environnementales contrôlées décrites ici peuvent être adaptés pour une variété d'utilisations alternatives, y compris la livraison inhalé d'autres médicaments, des études de toxicologie et simultanée surveillance en temps réel des signes vitaux.
Introduction
Anesthésiques généraux sont définis par leur capacité à provoquer un état réversible de l'hypnose dans une grande variété d'espèces, encore une explication quant à la façon dont une telle classe diversifiée de médicaments peut tout obtenir un point de terminaison singulier reste insaisissable. Un certain nombre de théories ont été avancées au fil des ans, à partir de la corrélation entre Meyer-Overton pouvoir anesthésiant et solubilité dans les lipides, ce qui suggère des perturbations généraux de la membrane de base à l'hypnose 1,2. Des données plus récentes suggèrent que les cibles de protéines affectant la signalisation neuronale contribuent à des effets anesthésiants. Les souris se sont avérées être un modèle indispensable à l'exploration de ces théories en raison de l'homologie entre la souris et la réactivité de l'anesthésique humain. Bien que la souris ne peut pas être interrogé sur sa conscience subjective sous anesthésie générale, certains réflexes primitifs servent mesures de substitution utiles de rongeur hypnose. Dans les premiers jours suivant la naissance, les souris développent un redressement resp réflexiveonse qui les empêche d'être passivement placé en décubitus dorsal 3. La dose d'anesthésie au cours de laquelle une souris perd son réflexe de redressement est bien corrélée avec des doses hypnotiques humaines 4.
Évaluation de la perte de réflexe de redressement (LORR) est devenu un standard de laboratoire largement utilisé pour tester la sensibilité anesthésie chez les souris ainsi qu'une variété d'autres espèces, y compris chez le rat, cochon Guinée, lapin, furet, moutons, chien et 5-8. La dose d'un anesthésique administré à laquelle LORR aura lieu pour les membres d'une espèce est extrêmement cohérent, mais il peut être déplacé de manière significative par des facteurs environnementaux. Par exemple, les rats privés de sommeil sont plus sensibles à la fois aux anesthésiques volatiles et intraveineuse 9 et le rat avec la capacité aérobie élevée sont moins sensibles à l'isoflurane 10. L'hypothermie a également été montré une diminution de la dose de nombreux anesthésiques nécessaires à l'hypnose dans un large spectre d'espèces de 11 à 14. Pourà identifier de manière fiable la dose anesthésique à qui LORR se produit dans un groupe d'animaux de laboratoire, il est essentiel que l'environnement d'évaluation être soigneusement contrôlée pour minimiser le stress, maintenir euthermia, et de livrer des quantités égales de drogue à tous les sujets. Sans surprise, les facteurs génétiques sont également connus pour modifier la sensibilité anesthésie 15-18. Par conséquent, une attention particulière devrait également être accordée au contrôle pour le fond génétique 19.
Nous avons mis au point un appareil qui assure la livraison de gaz anesthésique identique à chacun des 24 souris tout en maintenant un environnement constant de C 37 o. Le design cylindrique transparente de nos chambres d'exposition permet une évaluation de LORR rapide et une intégration facile des mesures physiologiques télémétriques. Ce système a été montré pour mesurer avec précision l'isoflurane, halothane et le sévoflurane induction CE 50 et le temps de l'émergence de souris de type sauvage 20. Nous avons également utiliséce système pour observer les changements dans la sensibilité anesthésie chez la souris avec des mutations génétiques et des lésions hypothalamiques ciblées 21-23. Nous décrivons ici deux façons de sensibilité anesthésie peut être évaluée après une intervention pharmacologique utilisant notre appareil dans un environnement contrôlé. L'état d'équilibre de phénotypage volatile induction anesthésique et de la sensibilité de l'émergence nécessite 8-10 heures et est donc mieux adaptée pour des études dans des conditions expérimentales qui ne changent pas, comme dans les interventions pharmacologiques chroniques ou de longue durée d'action. Toutefois, pour les traitements à action rapide dont les effets se dissiper au fil du temps, nous présentons également une procédure simple pour évaluer les changements de réflexe de redressement suivantes microinjections stéréotaxique ciblées ou des traitements de drogues injectables qui ont une incidence significative émergence anesthésie. Ces tests représentent un petit sous-ensemble des applications potentielles de ce système dans un environnement contrôlé, qui pourrait être adapté pour n'importe quel nombre de subjects d'une variété d'espèces de recevoir tout type de thérapeutique par inhalation.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des animaux décrits ci-dessus ont été approuvés par l'Université du comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de la Pennsylvanie.
Une. Vue d'ensemble de l'appareil d'essai
- L'appareil d'essai se compose de 24 chambres claires acrylique cylindriques de 10 cm de longueur et de 5 cm de diamètre (volume total de 200 ml). Cette taille est appropriée pour une souris adulte typique de 25 g. Chambers ont des ports à chaque extrémité pour l'entrée et sortie de gaz. L'extrémité de sortie est amovible de sorte que les animaux peuvent être facilement chargés dans la chambre. les sabords de gaz sont soigneusement scellées avec du ruban téflon, tandis que les joints toriques en caoutchouc sont utilisés pour sceller l'extrémité amovible des chambres cylindriques.
- Chaque chambre est montée sur un support qui se trouve à l'intérieur d'un bain d'eau. Le support est monté de telle sorte que seule la partie inférieure des chambres (au-dessous des entrées de gaz) est immergée. Pour la stabilité, l'extrémité arrière de la chambre repose sur un support de telle sorte que l'ensemble de chamber se trouve horizontalement. Cette garantit un contact de l'ensemble de chambre à la salle de bain.
- un tube de polyéthylène relie un réservoir d'oxygène à un vaporisateur d'anesthésique, puis passe à travers un L / débitmètre 10 min. Le tube se divise en 25 résistances de faible diamètre d'une longueur égale à assurer un écoulement égal est délivré à chacun des 24 chambres et à un analyseur d'agent.
- Les conduites de vide sortent chaque chambre à l'extrémité opposée de l'entrée de gaz. Cela favorise un écoulement unidirectionnel qui élimine réinhalation de dioxyde de carbone expiré. Les lignes de vide se combinent à un collecteur de se connecter à une ligne d'aspiration en interne. Une valve pop-off le long de la ligne de vide principale assure des conditions de pression atmosphérique dans chaque chambre.
- Le bain est rempli avec suffisamment d'eau pour communiquer pleinement le fond de chaque chambre. L'eau est mise en circulation à travers le bain et maintenu à une température constante de 37 ° C par une pompe.
2. Vérifiez le système avant l'exposition
- Cdiable ce que la température du bain d'eau est de 37 ° C tout au long de la baignoire.
- Couler de l'oxygène à un débit de 5 L / min (200 ml / min par l'agent analyseur chambre +). Immerger chaque chambre sous l'eau et de chercher les bulles ou entrée d'eau dans la chambre, les deux qui sont indicatifs de fuites. Scellez toutes les fuites avant de commencer l'expérience.
- Pour chaque chambre, connecter un ml / min de 500 mètres d'écoulement en ligne après la chambre pour s'assurer que les flux sont équilibrés entre chacune des lignes de gaz 25. Cela assure que les flux d'entrée de 5 L / min seront distribués uniformément de sorte que chaque chambre reçoit l'écoulement 200 ml / min. Toute chambre pas recevoir le flux prévu devrait avoir son entrée et la sortie des tubes vérifier les obstructions.
- Calibrer l'analyseur d'agent pour assurer une lecture de 0,00% d'isoflurane quand 100% d'oxygène circule.
3. Implant Température transpondeur
- Une semaine avant l'accoutumance, anesthésier chaque souris avec 2% d'isoflurane.
- Stériliser la zone dorsale du cou avec de la bétadine.
- Injecter un transpondeur sous-cutanée de température entre les omoplates à l'aide de l'aiguille d'injecteur préemballé stérile.
- Surveiller le site d'injection par jour pendant l'infection et la migration du transpondeur.
4. Habituer les animaux de test Chambers
- Quatre jours avant la première évaluation, placer toutes les souris dans des chambres individuelles pour 2 heures avec un courant de 100% d'oxygène.
- Répétez l'étape 4.1 par jour pendant quatre jours avant l'évaluation pour éviter les effets de confusion de stress dû à un nouvel environnement.
5. Effectuer l'intervention pharmacologique que vous souhaitez tester pour les effets sur la sensibilité anesthésique
- Cette intervention peut être une injection stéréotaxique dans une partie spécifique du cerveau 24, une injection intraveineuse ou intrapéritonéale 25, ou à la livraison d'un médicament à une zone spécifique du cerveau par une canule 26.
- Du fait que ces procédures peuvent eux-mêmes modifier la sensibilité anesthésique par rapport à un animal naïf, un groupe témoin approprié devrait subir le même mode opératoire avec des injections de véhicule.
- Veiller à ce que l'intervention pharmacologique a une suffisamment longue durée d'action si vous envisagez de faire un pas à pas l'augmentation et / ou diminution de la détermination de la sensibilité anesthésique, comme indiqué à l'étape 6 ci-dessous, sinon, passez à l'étape 7.
6. Évaluer anesthésique sensibilité en utilisant le pas à pas CE 50 Détermination de l'induction et de l'émergence
- Placez chaque animal dans des chambres individuelles avec un courant de 100% d'oxygène.
- Régler la concentration d'isoflurane à 0,4% * pendant 15 min. Pendant les 2 dernières minutes de cette période, évaluer réflexe de redressement de chaque animal en roulant doucement la chambre jusqu'à ce que la souris est placé sur le dos. Le réflexe de redressement est considérée comme intacte si et seulement si la souris est capable de restaurer tousde ses pattes sur le plancher de la chambre à moins de 2 min.
- * Notez que 0,4% d'isoflurane est une dose subhypnotic chez les souris C57BL/6J. Si des souris perdent leur réflexe de redressement lors de la première étape, la dose initiale était trop grande et doit être réduite les jours suivants.
- Enregistrer l'état du réflexe de redressement pour chaque souris et analyser chaque souris pour les données de température. Un enregistrement de modèle est représenté dans le tableau 1.
- Augmenter la concentration d'isoflurane par ~ 0,05% pendant 15 minutes et répéter l'étape 7.2. Continuer ainsi jusqu'à ce que tous les animaux ont perdu leur réflexe de redressement.
- Facultatif: répétez la même procédure pour diminuer les doses isoflurane étape par étape jusqu'à ce que tous les animaux ont retrouvé leur réflexe de redressement (voir l'étape 6.3).
- Pour mettre fin à l'expérience, éteignez l'isoflurane et rincer tout le système avec 100% d'oxygène pendant 15 min. Cela aidera à prévenir l'hypoxie que les souris récupérer avant d'être retournées à leurs cages et protéger la experimenter de toute exposition anesthésique.
- Facultatif: si le nombre d'animaux ou le nombre de concentrations anesthésiques est limité en raison du manque de ressources ou de temps, les estimations, en particulier des paramètres de la courbe d'ajustement de la pente peuvent avoir sous-estimé la colline faussement estimation basse, d'erreur. Dans de tels cas, il peut être nécessaire de répéter la mesure de la sensibilité anesthésie décrit dans les étapes 6.1 à 6.6 sur un maximum de deux jours expérimentales supplémentaires pour obtenir pleinement le paramètre de la véritable pente de Hill et son estimation d'erreur correspondant.
7. Évaluer les changements à court terme dans anesthésique sensibilité avec le temps à l'émergence
- Placez chaque animal dans des chambres individuelles avec un courant de 100% d'oxygène.
- Régler la concentration d'isoflurane à 1,2%, ce qui correspond à l'induction ED 99 pour la souris C57BL/6J de type sauvage 20. Maintenir pendant 30-60 minutes en fonction de la durée prévue de l'action de l'intervention aiguë.
- Confirmez LORR danstous les animaux en roulant doucement chaque chambre jusqu'à ce que les souris sont placées sur le dos.
- Désactiver l'isoflurane et le débit 100% d'oxygène. Mesurer le temps jusqu'à ce que chaque animal retrouve son réflexe de redressement. Ceci est défini par la mise en place de l'ensemble des quatre pattes sur le plancher de la chambre et confirmé par la présence de trois essais consécutifs avec un réflexe de redressement intact.
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Representative Results
La figure 1 montre l'utilité du dosage LORR étape par étape pour déterminer les effets à long terme d'une intervention pharmacologique. Acide iboténique (IBA) est un agoniste de la glutamatergique N-méthyl-D-aspartate (NMDA) qui est souvent utilisé comme un excitotoxine à provoquer des lésions neuronales permanentes. Ici nous avons injecté 10 nl de 1% IBA bilatérale dans la zone préoptique ventro (VLPO) de souris C57BL/6J une semaine avant le test. La majorité des neurones dans ce noyau exposer taux de mise à feu bas pendant l'éveil et augmenter spécifiquement leur activité pendant la non-rapide sommeil paradoxal, le sommeil rapide mouvement des yeux, et l'exposition à des doses hypnotiques des anesthésiques généraux 23,27-29. Lésions de succès dans le VLPO devraient entraîner une résistance à l'hypnose induite par l'isoflurane. A chaque augmentation du niveau de l'isoflurane, de la fraction des souris qui avaient perdu le réflexe de redressement a été tracée en fonction de la concentration anesthésique sur une échelle log 10. Donnéespour chaque groupe de souris (véhicule à injection et IBA injection) était alors en forme avec une courbe dose-réponse sigmoïde. Parce que ce test commence toujours par tous les animaux debout et se termine toujours par tous les animaux ayant perdu le réflexe de redressement, inférieure et supérieure constantes ont été contraints de 0 et 1, respectivement. Les paramètres libres restants des courbes sont la CE 50, ou la concentration d'anesthésique à laquelle 50% des souris ont perdu leur réflexe de redressement, et la pente de Hill, qui reflète la variance de la population au cours de leur transition de l'état hypnotique. Un test F a été utilisé pour demander si une courbe d'induction simple avec partagée CE 50 et les paramètres de pente de Hill correspondent le mieux à la fois véhicule et les groupes IBA ou si des courbes d'induction distincts avec des paramètres distincts mieux ajusté aux données. Les degrés de liberté en ce test proviennent des points de données brutes qui sous-tendent l'ajustement de courbe et dépendent par conséquent du nombre de concentrations anesthésiques testés et le nombre de paramètres étant fit-CE 50 et la pente de Hill dans ce cas. Données de l'émergence progressive ont été analysées et modélisées de façon identique aux données pour l'induction. A noter que la CE 50 pour l'émergence est presque toujours inférieure à celle de l'induction due à l'hystérésis anesthésique également connu sous l'inertie de neurones 30. Contrairement aux résultats attendus, les animaux qui ont reçu IBA dans le VLPO montré aucune différence significative dans la CE 50 ou la pente de Hill pour l'induction ou l'émergence par rapport à des contrôles de véhicules à injection (F 2,80 = 1,73 et p = 0,184 pour l'induction, F 2, 88 = 2,89 et p = 0,061 pour l'émergence). Ceci indique que les neurones VLPO souris sont résistantes à la lésion avec 1% d'IBA, ce qui est confirmé par l'histologie post-mortem (non représenté). Lu et al. ont précédemment montré que la dose de 10% IBA est nécessaire à la lésion chez le rat VLPO 31, mais l'examen histologique de la VLPO de souris après injection de 10% IBA a également montré aucune signifila perte de cellules dévers (non représentée). Le VLPO de rat est connue pour exprimer des récepteurs de NMDA 32. Depuis le 10% IBA est en mesure d'exercer un effet aigu sur la sensibilité anesthésie lorsqu'il est injecté dans la VLPO (voir la figure 2, ci-après), le rapport préconise de VLPO souris doit également posséder des récepteurs NMDA nécessaires pour les actions d'IBA. Ainsi, la raison de la divergence entre les espèces reste incertaine. Lésions VLPO de la souris succès ont été obtenus en utilisant un galanine saporine ciblé 23.
Bien IBA n'a pas un effet à long terme sur la sensibilité de l'isoflurane lorsqu'il est injecté dans la VLPO, on pourrait s'attendre de la nature excitatrice aiguë de ce médicament pour stimuler les neurones VLPO et transitoirement augmenter la sensibilité anesthésie. Dans la figure 2, nous avons utilisé le temps de test de l'émergence de démontrer un grand changement dans la sensibilité aiguë isoflurane immédiatement après microinjection IBA bilatérale dans le VLPO comme en témoigne nettement prolongéehypnose après l'arrêt de la livraison anesthésie (p <0,001). Inversement, la micro-injection d'IBA dans le septum médian proximité causé aucun changement dans le temps de l'émergence par rapport à des contrôles de véhicules à injection (p> 0,05). Cette constatation ajoute une facette intéressante de travaux antérieurs montrant que l'inactivation de ce noyau s'étend temps à l'émergence 33,34. Les données pour les groupes expérimentaux et de contrôle dans le temps de test de l'émergence a été pondérées et comparées avec une ANOVA à un facteur.
| Temps | Isoflurane (% atm) | Souris # 1 | Souris # 2 | Souris # 3 | ... |
| 0,4 | - | - | - | - | |
| 12:15 | 0,45 | - | X | - | - |
| 12:30 | 0,5 | - | X | X | - |
| 12:45 | 0,55 | - | X | X | |
| ... | 0,6 | - | X | X | X |
. Tableau 1 Exemple d'une feuille de journal pour longue durée anesthésique évaluation Sensibilité: toutes les 15 min, la dose anesthésique a été augmenté de 0,05% et le réflexe de redressement a été évaluée pour chaque animal. "X" désigne les animaux qui avaient perdu leur réflexe de redressement pour un point de temps donné, et "-" désigne ceux qui ont maintenu leur réflexe de redressement.
Figure 1. L'évaluation de l'réflexe de redressement Une semaine après l'injection d'acide iboténique dans le ventrolatérale préoptique Nucleus: Le long terme test de sensibilité de l'anesthésie a été réalisée sur des souris avec le véhicule ou l'acide iboténique (IBA) injecté dans la zone préoptique ventro (VLPO) une semaine avant le test. Induction et données d'émergence pour chaque groupe était apte à une courbe dose-réponse sigmoïde (induction en traits pleins, l'émergence en pointillés) avec l'intervalle de confiance de 95% entre crochets les courbes de meilleur ajustement (barres grisées). Concentration anesthésique a été tracée sur une échelle log 10. Intervalles qui se chevauchent de confiance à 95% sont indiqués en violet. La dose-repsonse sigmoïde s'adapte à la fois véhicule et IBA groupes suggèrent aucune preuve distinctes courbes de meilleur ajustement sur la base de la CE 50 et la pente de Hill. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Temps à EFusion Après local microinjection de l'acide iboténique: Immédiatement avant l'évaluation, les souris ont reçu une micro-injection de la N-méthyl-D-aspartate (NMDA), agoniste des récepteurs de l'acide iboténique (IBA) dans le noyau ventro préoptique (VLPO). Cette zone est connue pour être activé pendant l'hypnose induite par l'isoflurane. IBA injection conduit à une augmentation de courte durée dans le temps de retour du réflexe de redressement par rapport aux témoins de véhicule à injection (p <0,001). Temps à l'émergence des animaux avec IBA injecté dans septum médian ne diffère pas de témoins (p> 0,05). Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
Bien que l'évaluation de LORR en un seul clic est une tâche apparemment simple, il est néanmoins essentiel de maintenir des conditions physiologiques identiques entre les sujets afin de recueillir des données fiables à partir d'un groupe d'animaux. L', appareil de LORR haute capacité strictement réglementé présenté ici propose une façon de normaliser les expériences et de maximiser l'efficacité. En suivant les principes de base de la thermorégulation et la distribution de débit égal, ce système peut être facilement recréé et personnalisé pour répondre aux besoins des expérimentateurs individuels. taille de la chambre peut être adapté pour d'autres espèces, comme les rats, et les chambres supplémentaires peuvent être logés en attachant plus de points de branchement à l'entrée et vide. Tous les sujets sont facilement visibles à travers les chambres acryliques claires, ce qui permet d'enregistrer des vidéo des expériences de confirmation post-hoc secondaire des résultats. L'acrylique est également compatible avec les systèmes de télémétrie de radiofréquence, qui peuvent être utilisés pour surveiller la températureture, la pression artérielle, et biopotentiels.
Nous présentons deux méthodes différentes pour évaluer la sensibilité anesthésie suite à une intervention pharmacologique. À la fois le temps d'apparition et les essais d'induction par étapes nécessitent l'expérimentateur pour marquer la présence ou l'absence du réflexe de redressement. Même avec une définition explicite de LORR, comme «incapable de placer les quatre pattes sur le plancher de la chambre dans les deux minutes après avoir roulé sur le dos", l'évaluation peut être un peu subjective. Il est préférable d'avoir le même traitement aveugle score de chaque chaque animal pour la durée de l'expérience pour assurer la cohérence. Lorsque vous choisissez le test à utiliser pour l'évaluation de la sensibilité d'anesthésie, la durée prévue de l'effet de l'intervention pharmacologique devrait être le facteur décisif. De nombreux médicaments ont une courte durée d'action, pour qui le temps aiguë à l'émergence paradigme peut fournir des informations utiles sur la sensibilité anesthésique dans une période limitéede temps. Toutefois, un médicament peut affecter préférentiellement la sensibilité d'un animal à l'induction de l'hypnose plutôt que sur l'émergence, les changements dans le temps de l'induction sont souvent difficiles à détecter car induction est rapide et nécessite une évaluation continue ainsi. Le test pas à pas plus de 50 CE de l'induction et de l'émergence peut donner des informations à la fois sur l'entrée et à la sortie de l'hypnose. La longueur totale de l'expérience dépendra de la taille de l'incrément par lequel la concentration anesthésique est modifié à chaque étape, des tests d'induction + émergence typiques d'une durée d'environ 8 heures. La diminution de la taille de pas anesthésique autour prévue le CE 50 et l'augmentation du nombre d'animaux dans chaque groupe donnera une courbe dose-réponse mieux adaptée mais aussi allonger le temps nécessaire pour compléter le test.
Certaines interventions pharmacologiques peuvent modifier de façon différentielle la ventilation-minute d'animaux de laboratoire par rapport à leurs témoins. Tsa pourrait provoquer un groupe d'expirer l'anesthésique volatil dans le temps de test émergence plus rapidement que l'autre, confondant ainsi les résultats. Solt et al. décrire une bonne méthode alternative pour tester la sensibilité anesthésique dans ce scénario 35. Dans leur expérience, le méthylphénidate systémique est livré lors de l'exposition constante isoflurane chez les animaux qui ont déjà équilibrée avec anesthésie. Effets confondants potentiels sur la ventilation-minute sont donc exclues lors de l'exposition anesthésique continu que l'absorption d'anesthésie et de la distribution au cours de l'état d'équilibre sont précisément équilibrées par le métabolisme et l'élimination. Les chambres que nous décrivons peuvent être facilement modifiés avec un port étanche aux gaz supplémentaires pour permettre le passage de tubes pour l'administration de médicaments par voie intraveineuse ou par voie intracérébrale. Il convient également de noter que le décrit 15 min d'équilibrage à chaque concentration d'anesthésique dans le dosage par étapes peut ne pas être suffisant dans certains cas. Anesthésiqueci avec une plus grande solubilité que l'isoflurane, comme l'halothane, prendra plus de temps pour atteindre leurs pleins concentrations dans les tissus. Les plus gros animaux et les animaux qui subissent les grandes étapes de concentration anesthésique peuvent également nécessiter plus de temps pour s'équilibrer. Pour déterminer si 15 min est vraiment suffisant pour atteindre l'équilibre, les concentrations tissulaires anesthésiques à la même concentration d'anesthésique à la fois sur l'ascendant et descendant membres d'exposition doivent être mesurés.
Dans les cas où la capacité d'un animal à se déplacer est physiquement ou pharmacologiquement gênée, LORR peut pas servir comme une bonne mesure de substitution de l'hypnose. L'alternative la plus fiable et la plus utilisée est électroencéphalographiques (EEG) corticales. Bien que l'EEG peut être mieux en mesure de détecter les changements plus subtils de la sensibilité d'anesthésie, il est beaucoup plus coûteux à mettre en place que l'appareil nous décrivons. L'implantation d'électrodes EEG est une procédure invasive et prend du temps, et la possibilité de bénéficier du droitdans les données de plusieurs souris simultanément est souvent limitée par la disponibilité des équipements. En outre, l'analyse des enregistrements EEG est conceptuellement plus abstrait et difficile à interpréter que la sortie binaire simple évaluation LORR. Pour ces raisons, des tests comportementaux comme ceux décrits ici sont souvent des méthodes plus réalistes pour le dépistage rapide sensibilité anesthésie. Notez que les motifs EEG évocateurs de l'excitation et l'hypnose peuvent pas bonne corrélation avec le comportement. LORR et EEG sont des paramètres distincts qui offrent à la fois probable des informations utiles concernant la sensibilité anesthésie.
En plus des modifications induites par le médicament potentielles dans la ventilation minute et la mobilité, il existe plusieurs autres limitations des procédés décrits ici. Bien LORR est une substitution standard pour l'hypnose dans le champ, les critères et la méthodologie utilisés pour sa mesure diffèrent selon les laboratoires. Certains préconisent que les souris doivent être mis en rotation à une vitesse constante pour évaluer le réflexe de redressement. L'évaluation continue rétrécit logiquement le moment précis auquel le réflexe de redressement est perdu et / ou retours, mais le fait d'être tourné en position couchée peut être plus stimulant que de simplement en restant couchée. En outre, par étapes évaluation LORR est un essai de temps qui peut être prorogé si les 15 minutes de l'équilibre à chaque étape est jugée insuffisante.
Malgré ces limites, les applications potentielles de ce protocole s'étendent bien au-delà des cas particuliers que nous avons présentées. De toute évidence, les interventions pharmacologiques ne sont pas la seule méthode par laquelle la sensibilité anesthésie peut être modifié; lésions ciblées, des anomalies anatomiques, et des mutations génétiques peuvent tous être testés en utilisant la même progressive CE 50 détermination. Le système à environnement contrôlé présenté ici peut être utilisé pour délivrer des médicaments à base d'inhalation, tels que des corticostéroïdes, des antibiotiques, des agents thérapeutiques ou expérimentaux. La capacité à exposer beaucoup de souris à la même amount de drogue rend à la fois cette configuration idéale pour les études de toxicologie. De plus, les chambres servent d'environnement de récupération post-opératoire idéal avec la température ambiante réglementé et de nouveaux flux d'oxygène. Cet appareil est utile pour toute instance dans laquelle les signes vitaux des animaux de base doivent être surveillés et contrôlés.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par R01 et T32 GM088156 HL007713-18. Nous tenons à remercier Bill Pennie et Michael Carman de l'Université de Pennsylvanie recherche Instrumentation Boutique pour leur aide dans le montage de notre appareil de réflexe de redressement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
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