Summary
Потеря рефлекса выпрямления долгое время служил в качестве стандартного поведенческого суррогата бессознательности, которая также называется гипноз, у лабораторных животных. Изменения в летучее анестезирующее чувствительности, вызванные фармакологических вмешательств могут быть обнаружены с тщательно контролируемой системы оценки высокой пропускной, которые могут быть адаптированы для доставки любого ингаляционного терапевтического.
Abstract
Один желательно конечной общей анестезии является состояние бессознательности, также известный как гипноз. Определение гипнотическое состояние у животных менее очевидно, чем это у больных людей. Широко используется поведенческая суррогатом гипноза у грызунов является потеря рефлекса (Lorr), или точку, в которой животное не реагирует на их врожденной инстинкта, чтобы избежать уязвимости спинной лежачее положение. Мы разработали систему оценки Lorr в 24 мышей одновременно, тщательно контролировать для потенциальных путает, в том числе колебания температуры и различных газовых потоков. Эти камеры позволяют достоверно оценить анестетика чувствительности как измеряется латентность вернуться из рефлекса выпрямления (RORR) после фиксированной анестетика воздействия. Кроме того, с помощью ступенчатых увеличивается (или уменьшается) в анестезиологической концентрации, камеры также позволяют определять чувствительность населения к индукции (или появление) как измереноЕС 50 и Хилл склон. Наконец, контролируемые климатические камеры, описанные здесь, могут быть адаптированы для различных альтернативного использования, в том числе вдыхаемого поставки других наркотических средств, токсикологических исследований, и одновременного мониторинга в режиме реального времени жизненно важных функций.
Introduction
Общие анестетики определяются их способностью вызывать обратимое состояние гипноза в самых разнообразных видов, все же объяснения относительно того, как такой разнообразной класс препаратов может все вызвать особая конечная точка пока не удается. Ряд теорий были положены на протяжении многих лет, начиная с корреляцией Майер-Овертон между анестетика потенции и растворимости, который предложил общие мембранные нарушения в качестве основы для гипноза 1,2. Более поздние данные свидетельствуют о том, что белковые мишени, влияющие нейронного сигнала способствовать обезболивающий эффект. Мыши оказались незаменимым модель для изучения этих теорий из-за гомологии между мышиных и обезболивающий отзывчивости человека. Хотя мышь не может быть задан вопрос о его субъективной осведомленности под общим наркозом, некоторые примитивные рефлексы служат в качестве полезных суррогатные меры грызунов гипноза. В первые несколько дней после рождения, мыши разработать рефлексивный выпрямления соотвОНСЕ, что предотвращает их пассивно в лежачем положении 3. Доза наркоза, при котором мышь теряет рефлекса хорошо коррелирует с человека гипнотических дозах 4.
Оценка потери рефлекса (Lorr) стала широко использоваться лаборатория стандарт для тестирования обезболивающий чувствительность у мышей, а также целый ряд других видов, включая крыс, морских свинок, кроликов, хорьков, овец и собак 5-8. Доза данного анестетика, при которой будет происходить Lorr для представителей вида чрезвычайно последовательно, но она может быть сдвинута значительно экологическими факторами. Например, лишенные сна крыс более чувствительны к обоим летучих и внутривенных анестетиков 9 и крыс с высокой аэробной способности менее чувствительны к изофлураном 10. Переохлаждение также было показано, чтобы уменьшить дозу многочисленных анестетиков, необходимых для гипнозом в большом спектра видов 11-14. В порядкенадежно идентифицировать обезболивающий дозы, при которой Lorr происходит в группе подопытных животных, очень важно, чтобы окружающая среда оценка тщательно контролировать, чтобы минимизировать стресс, поддерживать euthermia, и доставить равное количество препарата для всех субъектов. Не удивительно, что генетические факторы, как известно, изменить чувствительность обезболивающий 15-18. Следовательно, серьезное внимание также должно быть уделено управления для генетического фона 19.
Мы разработали устройство, которое обеспечивает одинаковую газообразного доставки анестетика для каждой из 24 мышей при поддержании постоянной 37 ° С окружающей среды. Прозрачная цилиндрическая конструкция наших камер воздействия позволяет для оценки быстро Lorr и легкой интеграции телеметрических физиологических измерений. Эта система, как было показано, чтобы точно измерить изофлурана, галотан и севофлурана индукции EC 50 и время к появлению в дикого типа мышей 20. Мы также использовалиэта система наблюдать изменения анестетика чувствительности у мышей с генетическими мутациями и целевых поражении гипоталамуса 21-23. Здесь мы опишем два способа, в котором анестетик чувствительность может быть оценена после фармакологического вмешательства с помощью нашего аппарата контролируемой среде. Стационарное фенотипирование летучих индукции анестезии и чувствительности появления требуется 8-10 часов и, следовательно, лучше приспособлены для исследований, в которых условия эксперимента не меняются, например, при хронических или длительного действия фармакологических вмешательств. Тем не менее, для короткого действия лечения, последствия которых значительно со временем исчезнет мы также представляем простую процедуру, чтобы оценить изменения в рефлекса следующие стереотаксически-целевых микроинъекций или внутривенных наркотиков лечения, что значительно повлиять обезболивающий появление. Эти тесты представляют собой небольшое подмножество потенциальных приложений для этой управляемой системы окружающей среды, которые могут быть адаптированы для любого количества выполнения надECTS из множества видов, чтобы получить любой тип вдыхаемого терапевтического.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных, изложенные в настоящем документе были одобрены Университета комитета Институциональная уходу и использованию животных в Пенсильвании.
1. Обзор устройства для тестирования
- Устройство для испытаний состоит из 24 Прозрачный акриловый цилиндрических камерах 10 см в длину и 5 см в диаметре (общий объем 200 мл). Этот размер подходит для типичного 25 г взрослой мыши. Камеры имеют порты на каждом конце для впуска и выпуска газа. Выходной конец является съемным, так что животные могут быть легко загружены в камеру. Отверстия газовый порт тщательно герметизируют тефлоновой ленты, в то время как резиновое кольцо прокладки используются для уплотнения съемный конец цилиндрического камер.
- Каждая камера установлена на стойке, которая находится внутри водяной бане. Стойка установлена так, что только нижняя часть камер (ниже газовых впускных отверстий) погружен в воду. Для устойчивости, задняя часть камеры опирается на поддержку так, чтобы вся Chambэ сидит горизонтально. Это обеспечивает равномерное контакт всей камере с ванной.
- Полиэтиленовый шланг соединяет кислородный резервуар для анестезирующего испарителем, и затем проходит через 10 л / мин расходомера. Трубка расщепляется на 25 резисторов малого диаметра равной длины, чтобы обеспечить равный поток поступает в каждой из камер 24 и к анализатору агента.
- Вакуумные линии выхода каждую камеру на противоположном конце впускное отверстие для газа. Это способствует однонаправленный поток, который устраняет возвратное дыхание выдыхаемого углекислого газа. Вакуумные линии сочетают в многообразии подключиться к в доме линии всасывания. Поп-кран вдоль главной вакуумной линии обеспечивает условия атмосферном давлении в каждой камере.
- Ванна заполнена достаточно воды, чтобы полностью связаться дно каждой камеры. Вода циркулирует через ванну и поддерживается на постоянном 37 ° С с помощью насоса.
2. Проверьте систему перед воздействием
- Счерта, что температура водяной бане составляет 37 ° С в течение всего бане.
- Поток кислорода со скоростью 5 л / мин (200 мл / мин в камере + анализатора агента). Погрузите каждую камеру под водой и отыскать пузырьков или проникновения воды в камеру, оба из которых являются показателем утечек. Уплотнение любые утечки перед началом эксперимента.
- Для каждой камеры, подключить счетчик мл / мин 500 в соответствии после камеры, чтобы убедиться, что потоки сбалансированы по каждому из газопроводов 25. Это гарантирует, что вход 5 л / мин потоки будут равномерно распределены таким образом, что каждая камера получает 200 мл / мин. Любая камера не получает ожидаемого потока должна иметь свой приток и отток труб проверяется на наличие препятствий.
- Анализатор калибруется риэлтор, чтобы обеспечить чтение 0.00% изофлураном когда 100% кислород течет.
3. Имплантат Температура транспондера
- За неделю до привыкания, обезболить каждый мышь с 2% изофлураном.
- Стерилизовать шеи спинной бетадином.
- Введите температурный транспондера подкожно между лопатками, используя стерильный, расфасованный иглу форсунки.
- Монитор место инъекции в день в течение инфекции и миграции транспондера.
4. Приучить животных к испытанию палат
- За четыре дня до первой оценки, разместить все мыши в отдельных камер в течение 2 часов с 100% кислорода течет.
- Повторите шаг 4.1 в день в течение четырех дней до оценки, чтобы избежать смешанное воздействие стресса из-за новой среде.
5. Выполните фармакологического вмешательства, что вы хотите проверить по воздействию на обезболивающий Чувствительность
- Это вмешательство может быть стереотаксической инъекции в определенной части мозга 24 внутривенного или внутрибрюшинного введения 25 или доставки лекарственного средства к определенной области мозга с помощью канюли 26.
- Потому что сами эти процедуры могут изменить обезболивающий чувствительность по сравнению с наивной животного, надлежащий контроль группы должны пройти ту же процедуру с инъекциями транспортных средств.
- Убедитесь, что фармакологические вмешательства имеет надлежащим образом большую продолжительность действия, если вы планируете сделать поэтапно все большее и / или уменьшения определение анестетика чувствительности, как показано в шаге 6 ниже, в противном случае, перейдите к шагу 7.
6. Оценка обезболивающий чувствительность с помощью Поэтапное ЕС 50 Определение для индукции и появление
- Поместите каждое животное в отдельных камер со 100% кислорода течет.
- Установите концентрацию ИФ до 0,4% * в течение 15 мин. В течение последнего 2 мин этого периода, оценить каждого животного рефлекса на покатых камеру, пока мышь не находится на его спине. Рефлекса считается неизменным, если и только если мышь находится в состоянии восстановить всеего лапы на полу камеры в течение 2 мин.
- * Обратите внимание, что на 0,4% изофлуран является subhypnotic доза в мышей C57BL/6J. Если какие-либо мышей теряют рефлекса на первом шаге, начальная доза слишком велика и должна быть уменьшена на последующие дни.
- Запишите состояние рефлекса для каждой мыши и сканировать каждый мышь для температурных данных. Запись шаблона показано в таблице 1.
- Увеличение концентрации изофлуран на ~ 0,05% в течение 15 мин и повторить шаг 7,2. Продолжайте делать это, пока все животные не потеряли свою рефлекса.
- Дополнительно: повторите эту же процедуру для уменьшения ступенчатых изофлураном дозы, пока все животные не обрели рефлекса (см. шаг 6.3).
- Для завершения эксперимента, выключите изофлуран и промойте всю систему со 100% кислородом в течение 15 мин. Это поможет предотвратить гипоксию как мыши восстановить, прежде чем вернулся в их клетки и будет защищать experimeГюнтер из любого анестетика воздействия.
- Дополнительно: если количество животных или количество анестезирующих концентрации ограничены из-за ресурсов или временных ограничений, оценки, особенно параметров кривой посадки наклон-может Хилл есть недооцененным, ложно заниженным ошибке. В таких случаях может возникнуть необходимость повторить обезболивающий измерение чувствительности, описанную в шагах 6.1-6.6 на срок до двух дополнительных экспериментальных дней, чтобы полностью получить параметр истинного склоне холма и его соответствующий оценку ошибке.
7. Оценка краткосрочных изменений в обезболивающий Чувствительность со временем, чтобы Появление
- Поместите каждое животное в отдельных камер со 100% кислорода течет.
- Установите концентрацию изофлуран до 1,2%, что соответствует индукции ED 99 для C57BL/6J мышей дикого типа 20. Поддерживать в течение 30-60 мин в зависимости от ожидаемой продолжительности действия острой вмешательства.
- Подтвердите Lorr ввсе животные, осторожно не прокатки каждую камеру, пока мышей помещают на своих спинах.
- Выключите изофлурана и расхода 100% кислорода. Измерьте время, пока каждое животное не восстанавливает свою рефлекса. Это определяется путем размещения всех четырех лапах на полу камеры и подтверждается наличием трех последовательных тестов с неповрежденной рефлекса выпрямления.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 демонстрирует полезность поэтапного Lorr анализа для определения долгосрочных последствий фармакологического вмешательства. Иботеновая кислоты (МБА) является агонистом глутаматэргическую N-метил-D-аспарат (NMDA) рецепторов, который часто используется в качестве excitotoxin вызывать постоянные нейронные повреждения. Здесь мы вводили 10 NL 1% МБА двусторонней основе в вентролатеральной преоптической области (VLPO) от мышей C57BL/6J за неделю до тестирования. Большинство нейронов в этом ядре обнаруживают низкие показатели стрельбы во время бодрствования и, в частности увеличить свою активность в течение не-быстрого сна движения глаз, быстрого сна движения глаз, и с воздействием гипнотических доз общих анестетиков 23,27-29. Успешные поражения в VLPO должно вызывать сопротивление изофлурана вызванной гипнозом. На каждом увеличении уровня изофлураном, доля мышей, которые потеряли рефлекса был заговор против анестетика концентрации по шкале журнала 10. Данныедля каждой группы мышей (автомобиль с впрыском и впрыском IBA) затем согласуется с сигмоидальной кривой доза-ответ. Потому что этот анализ всегда начинается с всех животных в вертикальном положении и всегда заканчивается все животные потеряв рефлекса, нижний и верхний константы были вынуждены 0 и 1, соответственно. Остальные свободные параметры этих кривых ЕК 50, или концентрация анестетика, при которой 50% мышей утратили рефлекса, а наклон Хилл, который отражает дисперсию населения во время их гипнотическое состояние перехода. F-тест был использован для запроса ли один индукции кривая с общей EC 50 и Hill параметров наклона наилучшим образом соответствует как транспортное средство и IBA группы или же отдельные кривые индукции с различными параметрами, лучшими соответствии с данными. Степени свободы в этом тесте возникают из исходных точек данных, лежащих в основе подбора кривой и, следовательно, зависит от количества анестезирующих испытанных концентрациях и числа параметров будучи Fiт-ЕС 50 и Хилл склон в этом случае. Поэтапный данных Возникновение были проанализированы и смоделированы идентично данных для индукции. Следует отметить, что EC 50 для возникновения почти всегда ниже, чем у индукции анестезии из-за гистерезиса также известный как нейронной инерции 30. Вопреки ожидаемых результатов, животные, получавшие МБА в VLPO не показали существенных различий в ЕС 50 или Hill склон для индукции или возникновения по сравнению с транспортных средств с впрыском управления (F 2,80 = 1,73 и р = 0,184 для индукции, F 2, 88 = 2,89 и р = 0,061 для появления). Это означает, что мышь VLPO нейроны устойчивы к поражения с 1% IBA, и этот факт подтвержден с посмертного гистологического (не показан). Лу и др.. Ранее было продемонстрировано, что доза 10% IBA требуется для поражения крысу VLPO 31, но Гистологическое исследование VLPO мыши после инъекции 10% IBA также не показали существеннобрус потери клеток (не показан). Крыса VLPO, как известно, экспрессируют рецепторы NMDA 32. Поскольку 10% МБА способны оказывать острый влияние на анестетика чувствительности при введении в VLPO (см. рисунок 2, обсуждение ниже), это доказывает, что мышь VLPO должны также обладать рецепторы NMDA, необходимые для действий МБА. Таким образом, причина расхождения между видами, остается неясным. Успешные поражения мыши VLPO были достигнуты с помощью целевой Галанин-сапорин 23.
Хотя МБА не имеет долгосрочный эффект на изофлурана чувствительности при введении в VLPO, острая возбуждающим природа этого препарата можно было бы ожидать, чтобы стимулировать VLPO нейроны и временно увеличить обезболивающий чувствительность. На рисунке 2 мы использовали время, чтобы тест появления продемонстрировать большой острый сдвиг в изофлурана чувствительности сразу после двустороннего IBA микроинъекции в VLPO о чем свидетельствует заметно продленгипноз после прекращения анестезии поставки (р <0,001). И наоборот, микроинъекции МБА в соседний медиальной перегородки не вызывает изменений во времени к появлению сравнению с транспортных средств с впрыском управления (р> 0,05). Это открытие добавляет интересный аспект в предыдущей работе, показывая, что инактивация этого ядра увеличивает время к появлению 33,34. Данные для экспериментальной и контрольной групп в то время в тесте появления усреднялся и по сравнению с односторонним ANOVA.
| Время | Изофлюран (% атм) | Мышь # 1 | Мышь # 2 | Мышь # 3 | ... |
| 0,4 | - | - | - | - | |
| 12:15 вечера | 0.45 | - | X | - | - |
| 12:30 вечера | 0.5 | - | X | X | - |
| 12:45 вечера | 0.55 | - | X | X | |
| ... | 0,6 | - | X | X | X |
. Таблица 1 Пример Войдите лист для долгосрочного обезболивающий чувствительности оценке: каждые 15 мин анестетик доза была увеличена на 0,05% и рефлекса оценивали для каждого животного. "Х" обозначает животных, которые потеряли их рефлекса на данный момент времени и "-" обозначает те, которые сохранили свою рефлекса.
Рисунок 1. Оценка рефлекса через неделю после иботеновой кислоты инъекций в вентролатеральной преоптической Nucлеев: Долгосрочная анализ чувствительности анестетик был проведен на мышах или с транспортного средства или иботеновой кислоты (МБА) вводят в вентролатеральной преоптической области (VLPO) за неделю до тестирования. Индукционные и данные Возникновение для каждой группы был соответствовать с сигмоидальной кривой доза-реакция (индукции в сплошных линий, появления в пунктирными линиями) вместе с 95% доверительным интервалом брекетинга наиболее подходящее кривые (заштрихованные столбики). Обезболивающий концентрация построена по шкале журнала 10. Перекрытие 95% доверительные интервалы показаны фиолетовым цветом. Сигмоидальная доза-repsonse подходит как для автомобиля и МБА группы не предлагаю никаких доказательств для различных наиболее Fit Curves на основе EC 50 и Hill склона. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Время Еслияние После местного микроинъекции иботеновой кислоты: Непосредственно перед оценки, мыши получали микроинъекции в N-метил-D-аспартат (NMDA) агониста иботеновой кислоты (МБА) в вентролатеральной преоптическое ядро (VLPO). Эта область, как известно, активируется во время изофлуран, вызванной гипнозом. МБА инъекции привели к острым увеличением времени, чтобы вернуться из рефлекса по сравнению с транспортных средств с впрыском управления (р <0,001). Время появления на животных с МБА вводят в медиальной перегородки не отличались от контроля (р> 0,05). Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя оценка Lorr в одном мыши, казалось бы, простая задача, тем не менее важное значение для поддержания одинаковых физиологических условий между субъектами с целью сбора достоверных данных от группы животных. Жестко регулируется, высокой емкости Lorr аппарат, представленные здесь предлагает способ стандартизировать эксперименты и максимальной эффективности. Соблюдая основные принципы терморегуляции и равномерного распределения потока, эта система может быть легко воссоздать и настроены с учетом потребностей отдельных экспериментаторов. Размер камеры могут быть расширены для других видов, таких как крысы, и дополнительные камеры могут быть размещены за счет присоединения других точек ветвления с притоком и вакуума. Все предметы хорошо видны через прозрачные акриловые камер, что дает возможность для видео запись эксперименты для вторичного подтверждения после специальной результатов. Акриловый также совместима с системами телеметрии радиочастотных, которые могут быть использованы для мониторинга температуры, кровяное давление, и биопотенциалы.
Мы представляем два различных методов оценки обезболивающий чувствительность после фармакологического вмешательства. И время появления и ступенчатые Тесты индукционные требуют экспериментатору забить наличие или отсутствие рефлекса выпрямления. Даже с явным определением Lorr, например, "не удалось разместить все четыре лапы на полу камеры в течение двух минут перекатываться на спину", оценка может быть несколько субъективным. Лучше всего, чтобы иметь такой же режим слепом индивидуальный счет каждого животного в течение всего срока эксперимента для обеспечения согласованности. При выборе, какой тест, чтобы использовать для анестезии оценки чувствительности, ожидаемой продолжительности эффекта от фармакологического вмешательства должны быть решающим фактором. Многие препараты имеют короткую продолжительность действия, для которых остро время появления парадигмы может дать полезную информацию о анестетика чувствительности в течение ограниченного периодавремени. Тем не менее, препарат может преимущественно влияют чувствительность животного к индукции гипноза, а не появления, изменения во времени, чтобы индукции часто трудно обнаружить, поскольку индукция происходит быстро и, следовательно, требует непрерывной оценки. Чем дольше ступенчато испытанием для ЕС 50 индукции и появление может дать информацию как входе и выходе из гипноза. Общая длина эксперимента будет зависеть от размера приращения на котором анестетик концентрация изменяется на каждом этапе, с типичными асинхронными + всходов испытаний длительностью около 8 час. Уменьшение размера шага обезболивающий вокруг ожидаемого EC 50 и увеличение количества животных в каждой группе даст лучше приспособленную кривую доза-ответ, но также будет время, требуемое для завершения анализа.
Некоторые фармакологические вмешательства могут дифференцированно изменить минутную вентиляцию подопытных животных по сравнению с их управления. Тего может привести к одной группе выдыхать в летучее анестезирующее средство в момент появления в тесте быстрее, чем другой, таким образом смешивая результаты. Солт др.. описать хорошую альтернативный метод для тестирования обезболивающий чувствительность в этом сценарии 35. В их эксперименте, системная метилфенидат поставляется на постоянной изофлурана воздействия на животных, которые уже равновесии с анестезией. Потенциальные вмешивающиеся воздействие на минутной вентиляции при этом исключаются во время непрерывной анестетика воздействия как анестетик поглощение и распределение во стационарных условиях точно уравновешивается обмена веществ и ликвидации. Камеры мы описываем может быть легко модифицирована с дополнительным газонепроницаемой порта, чтобы позволить прохождение трубки для внутривенного или внутримозгового доставки лекарств. Следует также отметить, что описанный 15 мин уравновешивания к каждой концентрации анестезирующего средства в ступенчатом анализе не может быть достаточно в некоторых случаях. AnesthetИС с более высокой растворимостью, чем изофлураном, таких как галотан, займет больше времени, чтобы полностью раскрыть свой концентрации в ткани. Большие животные и животные, которые подвергаются более крупные шаги в анестезиологической концентрации могут также потребовать больше времени, чтобы уравновесить. Чтобы определить, 15 мин действительно достаточно для уравновешивания, уровни анестезирующие ткани в той же концентрации анестетика как на восходящих и нисходящих конечностей воздействия должна быть измерена.
В случаях, когда способность животного двигаться физически или фармакологически затрудненных, Lorr может не служить хорошим косвенного показателя гипноза. Наиболее надежным и широко используемым альтернатива корковых электроэнцефалографические (ЭЭГ) записи. Хотя ЭЭГ могут лучше подобрать более тонкие изменения в анестезиологической чувствительности, это значительно дороже, установить, чем устройства мы описываем. Имплантация электродов ЭЭГ является инвазивной и трудоемким процедура, и способность obtaв данных из нескольких мышей одновременно часто ограничивается наличием оборудования. Кроме того, анализ ЭЭГ концептуально более абстрактным и трудно интерпретировать, чем простой бинарный выход оценки Lorr. По этим причинам, поведенческие тесты, такие как те, что описаны здесь, часто более возможные методы скрининга быстро обезболивающий чувствительность. Обратите внимание, что ЭЭГ паттерны, указывающие на возбуждение и гипноза, возможно, не хорошо коррелируют с поведением. Lorr и ЭЭГ-различные конечные точки, которые как скорее всего предоставляют полезную информацию о анестетика чувствительности.
В дополнение к возможным изменениям лекарственно-индуцированного в минутной вентиляции и мобильности, существует несколько других ограничений в способах, описанных здесь. Хотя Lorr является стандартным суррогатом гипноза поперек поля, критерии и методологию, использованные для ее измерения различаются в разных лабораториях. Некоторые выступают, что мыши, должны быть повернуты с постоянной скоростью, чтобы оценить рефлекса. Постоянная оценка логически сужает точного времени, с которым рефлекса теряется и / или возвращается, однако, акт превращается лежа может быть более стимулирующим, чем просто оставаясь на спине. Кроме того, поэтапно оценка Lorr является трудоемким анализ, который может быть продлен, если 15 минут уравновешивания на каждом шаге оказывается недостаточно.
Несмотря на эти ограничения, потенциальные применения этого протокола выходит далеко за рамки конкретных случаях мы представлены. Очевидно, фармакологических вмешательств не единственный метод, которым анестетик чувствительность может быть изменена; целевые поражения, анатомические аномалии, генетические мутации могут быть протестированы с использованием того же поэтапный ЕС 50 решимость. Управляемая система среда, представленные здесь могут быть использованы для доставки любого вида вдыхаемого препарата, такие как кортикостероиды, антибиотики, или экспериментальных терапевтических средств. Возможность выставить много мышей с аналогичным AMOЕНТ препарата сразу делает этот настройки идеально подходит для токсикологических исследований. Кроме того, камеры служат идеальным послеоперационной среды восстановления с регулируемой температурой окружающей среды и расхода свежего кислорода. Этот аппарат является полезным для любого экземпляра, в котором основные жизненные показатели животных должны контролироваться и управляться.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана R01 GM088156 и T32 HL007713-18. Мы хотели бы поблагодарить Билла Пенни и Майкл Carman из Университета Пенсильвании исследовательского инструментария магазин за помощь в сборке нашу рефлекса аппарат.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
- Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , Fischer. Jena. (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R.
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
