Summary
Doğrulma refleksinin kaybı uzun laboratuvar hayvanlarında, aynı zamanda hipnoz denilen, bilinç kaybı için standart bir davranış vekil olarak görev yapmıştır. Farmakolojik müdahaleler kaynaklanan uçucu anestetik duyarlılıkla değişiklikler herhangi bir solunan terapötik teslim için adapte edilebilir, dikkatli bir şekilde kontrol edilen yüksek verimli değerlendirme sistemi ile tespit edilebilir.
Abstract
Genel anestezi istenen bir uç nokta da hipnoz olarak da bilinen, bilinçsizlik durumudur. Hayvanlarda hipnotik durum tanımlama insan hastalarda daha az basittir. Kemirgenlerde hipnoz için yaygın olarak kullanılan davranış vekil refleksini (lorr), ya da hayvan artık dorsal kırılganlığını önlemek için onların doğuştan içgüdüsü yanıt noktayı doğrulma kaybıdır. Biz dikkatle sıcaklık dalgalanmaları dahil ve gaz akışlarını değişen potansiyeli karıştırıcılar, kontrol altında tutarken, aynı anda 24 farelerde lorr değerlendirmek için bir sistem geliştirdik. Sabit bir anestetik maruz kaldıktan sonra doğrulma refleksi (RORR) içinde dönmek için gecikme ile ölçüldüğü gibi bu odalar anestetik duyarlılığının değerlendirilmesinde güvenilir izin verir. Ile ölçülen Alternatif olarak, anestezik konsantrasyonunda kademeli artış (veya düşüş) kullanılarak, odaları da indüksiyon (ya da ortaya çıkması) bir halkın duyarlılığının tespitine imkanEC 50 ve Tepesi yamaç. Son olarak, burada açıklanan kontrollü çevre odaları solunan diğer ilaçların verilmesinde, toksikoloji çalışmaları ve vital bulgular aynı anda gerçek zamanlı izleme dahil olmak üzere alternatif kullanımları, çeşitli için adapte edilebilir.
Introduction
Genel anestezik türlerinin geniş bir yelpazede, henüz ilaç gibi farklı bir sınıfı, tüm bir tek nokta zor olmaya devam etmektedir ortaya nasıl olarak bir açıklama hipnozun bir tersinir durumuna yol kabiliyetleri ile tanımlanır. Teoriler bir dizi hipnoz 1,2 temel olarak genel membran aksaklıkları önerilen anestezi potansiyeli ve lipid çözünürlüğü arasındaki Meyer-Overton korelasyon ile başlayarak, yıllar boyunca oturtulması edilmiştir. Daha yeni bulgular nöron sinyalini etkileyen protein hedefleri anestezik etkilerine katkıda bulunmak olduğunu göstermektedir. Fareler, çünkü murin ve insan anestezi yanıt arasındaki homoloji, bu teorileri keşfetmek için vazgeçilmez bir model olduğu kanıtlanmıştır. Bir fare genel anestezi altında kendi öznel bilinci hakkında sorular olamaz rağmen, bazı ilkel refleksler kemirgen hipnoz gibi yararlı vekil önlemleri hizmet vermektedir. Doğumdan sonraki ilk birkaç gün içinde, fareler refleksif bir doğrulma resp geliştirmekonse pasif olarak yatar pozisyonda 3 konuyor engeller. Bir Fare, doğrulma refleksini kaybeder hangi anestezi dozu insan hipnotik dozlarda 4 ile iyi korelasyon.
Doğrulma refleksi (lorr) kaybının değerlendirilmesi farelerde anestezi hassasiyeti test hem de sıçan, kobay, tavşan, gelincik, koyun, köpek ve 5-8 dahil olmak üzere diğer türlerin çeşitli için yaygın olarak kullanılan bir laboratuvar standart haline gelmiştir. Lorr bir türün üyelerinin ortaya çıkar, verilen bir anestetik dozu oldukça tutarlıdır ancak çevresel faktörlerden önemli ölçüde değiştirilebilir. Örneğin, uyku-yoksun fareler volatil ve intravenöz anestezik 9 ve yüksek aerobik kapasite ile sıçanlarda hem de daha duyarlı izofluran 10 daha az duyarlıdır. Hipotermi da türlerin 11-14 geniş bir spektrum hipnozun için gerekli olan pek çok anestetik dozunu azaltmak için gösterilmiştir. Sıraylagüvenilir bir lorr deney hayvanlarının bir grup meydana geldiği anestezi dozu belirlemek için, bu değerlendirme ortam dikkatlice, stres en aza indirmek euthermia korumak ve tüm deneklere ilaç eşit miktarda sunmak için kontrol edilmesi çok önemlidir. Doğal olarak, genetik faktörler de anestetik hassasiyeti 15-18 değiştirmek bilinmektedir. Sonuç olarak, dikkatli bir göz, aynı zamanda genetik kökenli 19 için kontrol verilmelidir.
Bir sürekli 37 o C ortamı muhafaza ederken 24 fareden her birine denk bir şekilde temin edilebilir gaz halinde anestetik bir cihaz geliştirdiler. Bizim maruz odaları şeffaf silindirik tasarımı hızlı lorr değerlendirilmesi ve telemetrik fizyolojik ölçümlerin kolay entegrasyon sağlar. Bu sistem, doğru bir vahşi tip farelerde 20 çıkması için izofluran, halotan ve sevofluran indüksiyon EC 50 ve zamanı ölçmek için gösterilmiştir. Ayrıca kullanmışgenetik mutasyonlar ve hedeflenen hipotalamik lezyonlar 21-23 ile farelerde anestezi duyarlılık değişimleri gözlemlemek için bu sistem. Burada anestezik duyarlılığı bizim kontrollü bir ortam aygıtını kullanarak farmakolojik müdahalenin ardından değerlendirilebilir hangi iki yolu açıklanmaktadır. Volatil anestezi indüksiyon ve ortaya duyarlılık kararlı hal fenotipleme 8-10 saat gerektirir ve dolayısıyla en iyi şekilde kronik veya uzun etkili farmakolojik müdahaleler gibi deneysel koşullar değişmez, hangi çalışmalar için hazırlanmıştır. Ancak, olan etkileri zaman içinde önemli ölçüde dağıtmak kısa etkili tedaviler için biz de stereotaksi hedefli mikroenjeksiyon ya da önemli ölçüde anestezi çıkmasını etkileyebilir intravenöz ilaç tedavileri aşağıdaki refleksi değişiklikleri değerlendirmek için basit bir prosedür mevcut. Bu testler Subj herhangi bir sayı için adapte olabilir, bu kontrollü bir çevre sistemi için potansiyel uygulamalar küçük bir alt kümesini temsil edertürlerin çeşitli ects inhale terapötik herhangi bir tür almak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada özetlenen hayvanları kapsayan tüm işlemler Pennsylvania Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1.. Test Düzeneği genel bakış
- Test düzeneği 24 açık akrilik silindir odalarında, uzunluğu 10 cm ve çapı 5 cm (200 ml toplam hacim) oluşur. Bu boyut, tipik bir yetişkin için 25 g bir fare için uygundur. Chambers gaz giriş ve çıkışı için her bir ucunda bağlantı noktaları vardır. Hayvanların kolayca odacık içine yüklenebilir, böylece çıkış ucu çıkarılabilir. Kauçuk o-ring contalar silindir odaları çıkarılabilir sonunu mühürlemek için kullanılır ise gaz liman açıklıklar dikkatle, teflon bant ile kapatılır.
- Her bir odacık, bir su banyosu içine oturan bir raf üzerine monte edilir. (Gaz giriş altında) bölmelerin sadece alt kısmı sular, böylece raf monte edilir. Kararlılık için, bölmenin arka ucu bir destek üzerinde durur, böylece tüm odacıklıer yatay oturur. Bu banyosu ile tüm odasının Hatta teması sağlar.
- Polietilen boru bir anestezik bir buharlaştırıcı, bir oksijen tankı bağlanır, ve daha sonra bir 10 L / dk akış ölçer geçer. Boru eşit akış 24 bölmelerin her birine ve bir ajan analiz teslim sağlamak için eşit uzunlukta 25 küçük çaplı bir direnç ayrılır.
- Vakum hatları gaz girişine karşı sonunda her odası çıkış. Bu üfledi karbondioksit rebreathing ortadan kaldıran tek yönlü akışını destekler. Vakum hatları bir in-house emiş hattına bağlamak için bir manifoldunda birleştirir. Ana vakum hattı boyunca bir pop-off vanası, her odasının içinde atmosferik basınç koşulları sağlar.
- Banyo tam olarak her bölmenin tabanına temas etmesine yeterli miktarda su ile doldurulur. Su, pompa ile sürekli bir 37 o C banyo içinde döndürülür ve korunur.
2. Önce Pozlama Sistemini Kontrol
- Chalt su banyosunun sıcaklığı banyosu boyunca 37 o C.
- 5 L / dk 'lık bir oranda (bölmesinin + madde analiz için 200 ml / dakika) oksijen akış. Su altında her bir bölmeyi daldırın ve sızıntı gösteren her ikisi de kabarcıkların veya bölmenin içine su girişi için, bak. Deneye başlamadan önce herhangi bir sızıntı mühür.
- Her bölme için, akışı, 25 gaz hatlarının her biri boyunca dengeli olduğundan emin olmak için, odacık doğrultusunda sonra, 500 ml / dk bir akış ölçer bağlayın. Bu, her bir odacık 200 ml / dk bir akış alır, böylece giriş 5 L / dak akışları eşit olarak dağıtılacak sağlar. Beklenen akışı almayan herhangi bir bölmesi, giriş ve tıkanmaları kontrol çıkışının boru olmalıdır.
- % 100 oksijen akan 0.00% izofluran bir okuma sağlamak için ajan analizörü kalibre.
3. İmplant Sıcaklık Transponder
- Bir hafta öncesinde alışkanlık için,% 2 izofluran ile her fare uyutmak.
- Betadin dorsal boyun alan sterilize.
- Steril, paketlenmiş enjektör iğnesi kullanarak kürek kemikleri arasında bir sıcaklık transponder deri altına enjekte edilir.
- Enfeksiyon ve transponder göç günlük enjeksiyon siteyi izleyin.
4. Test Chambers Hayvanlar alışmakta
- Dört gün ilk tarhiyat öncesi,% 100 oksijen akan ile 2 saat boyunca tek tek odalarına tüm fareleri yerleştirin.
- Önceki nedeniyle yeni bir çevreye stresin karıştırıcı etkilerini önlemek için değerlendirmesine dört gün için yineleyin günlük 4.1.
5. Sen Anestezik Duyarlılık etkilerini test etmek için İstek Farmakolojik Müdahale gerçekleştirin
- Bu müdahale kanül 26 ile beyin 24, intravenöz veya intraperitonal enjeksiyonla 25, ya da belirli bir beyin bölgesinde bir ilacın teslimat belirli bir kısmını bir stereotaksik enjeksiyonu olabilir,.
- Bu işlemler kendilerini naif bir hayvana göre anestezik duyarlılığı değişebilir Çünkü, uygun bir kontrol grubu araç enjeksiyonları ile aynı prosedürü geçmesi gerekir.
- Adım aşağıda 6'da gösterildiği gibi anestezik duyarlılığı belirlenmesi artırılması ve / veya azalan bir adım adım yapmak planlıyorsanız farmakolojik müdahale eylem uygun bir şekilde uzun bir süreye sahip olduğundan emin olun, aksi halde 7. adıma geçin.
6. Basamaklı EC 50 İndüksiyonunda Belirlenmesine ve Doğuşu kullanarak Anestezik Hassasiyeti değerlendirin
- % 100 oksijen akan bireysel odalarına her hayvan yerleştirin.
- 15 dakika boyunca% 0.4 * için izofluran konsantrasyonu ayarlayın. Bu sürenin son 2 dakika boyunca, fare sırt üstüne yatınldı kadar yavaşça bölmeyi haddeleme her hayvanın doğrulma refleksini değerlendirmek. Doğrulma refleksi fare tüm geri yükleme yapabiliyor, ancak ve ancak sağlam kabul edilir2 dakika içinde odasının zemini olan pençelerin.
- *% 0.4 izofluran C57BL/6J fareler bir subhypnotic doz olduğuna dikkat edin. Her farenin ilk adımda doğrulma reflekslerini kesilmesi durumunda, başlangıç dozu çok büyüktü ve sonraki günlerde azaltılmalıdır.
- Her bir fare için düzeltme refleksi durumunu kaydetme ve sıcaklık verileri her bir fare için tarar. Şablon kayıt Tablo 1 'de gösterilmiştir.
- 15 dakika boyunca% 0,05 ~ tarafından izofluran konsantrasyonu artırmak ve adım 7.2 tekrarlayın. Tüm hayvanlar doğrulma refleksini kaybetmiş kadar bu yapmaya devam.
- İsteğe bağlı: (adım 6.3) tüm hayvanlar doğrulma refleksini kavuştular kadar adım adım izofluran azalan dozlarda için aynı işlemi tekrarlayın.
- , Deney sonunda izofluran kapatın ve 15 dakika boyunca% 100 oksijen ile tüm sistemi temizlemek için. Bu fareler evlerinde kafeslerde iade edilmeden önce kurtarmak gibi hipoksiyi önlemek için yardımcı olacak ve experime koruyacakanestezik maruz nter.
- İsteğe bağlı: hayvan veya anestezik konsantrasyonları sayısı sayısı nedeniyle kaynak veya süre kısıtlamaları ile sınırlı ise, eğri-fit parametre tahminleri-özellikle Tepesi yamaç olabilir hakir, yanlış düşük hata tahmin var. Bu gibi durumlarda, tam doğru Tepesi eteğinden parametresini ve ilgili hata tahmini elde etmek için en fazla iki ek deneysel gün adımda 6,1-6,6 'de tarif edilen anestezi hassasiyet ölçümü tekrar etmek gerekli olabilir.
7. Ortaya Time ile Anestezik Hassasiyet Kısa vadeli Değişiklikleri değerlendirin
- % 100 oksijen akan bireysel odalarına her hayvan yerleştirin.
- Vahşi tip C57BL/6J fareler 20 için indüksiyon ED 99 karşılık% 1.2, izofluran konsantrasyonu ayarlayın. Akut müdahale aksiyon beklenen süresine bağlı olarak, 30-60 dakika boyunca muhafaza edilir.
- In lorr Onaylanazikçe fareler kadar her odasını haddeleme bütün hayvanların sırtlarında yerleştirilir.
- Izofluran kapatın ve% 100 oksijen akışı. Her hayvan kendi doğrulma refleksini kavuşur kadar ölçün. Bu, haznenin kat Dört bacak yerleştirilmesi ile tanımlanan ve sağlam bir doğrulma refleksi ile arka arkaya üç testin varlığı ile teyit edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, bir farmakolojik müdahale uzun vadeli etkileri belirlemek için bir adım adım lorr deneyinin yararlı olduğunu göstermektedir. Ibotenik asit (IBA) çoğu zaman sürekli nöronal lezyonlara neden olduğu bir eksitotoksin olarak kullanılan glutamaterjik N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptör bir agonisttir. Burada iki taraflı olarak C57BL/6J fareler ventrolateral preoptik alanı (VLPO) bir hafta önce testten içine% 1 IBA 10 nl enjekte edilir. Bu çekirdekteki nöronların çoğunluğu uyanıklık sırasında ateş düşük oranları gösteren ve özellikle sigara-hızlı göz hareketleri uyku, hızlı göz hareketleri uyku ve genel anestezik 23,27-29 hipnotik dozlarda maruz kalma ile sırasında aktivitesini artırır. VLPO Başarılı lezyonlar izofluran neden hipnoza direnç neden olmalıdır. Izofluran artan her seviyede, doğrulma refleksini yitirmiş olan farelerin fraksiyonu bir günlük 10 ölçekte anestezik konsantrasyona göre çizilmiştir. VeriHer bir fare grubu için (araç-enjeksiyon ve IBA enjekte), daha sonra, bir sigmoidal doz-yanıt eğrisi ile uyum oldu. Bu deney her zaman tüm hayvanlar kayıp olan dik bütün hayvanlar ile başlar ve her zaman biter çünkü düzeltilmesi refleks, alt ve üst sabitleri sırasıyla, 0 ve 1 için kısıtlı. Eğrilerin kalan serbest parametreler hipnotik geçiş sırasında popülasyon varyansını yansıtan EC 50 ya da farelerin% 50'si doğrulma refleksini yitirmiş hangi de anestetik konsantrasyonu ve Hill eğimi vardır. Bir F-testi paylaşılan EC 50 ve Tepesi yamaç parametreleri ile tek indüksiyon eğrisi en iyi araç ve IBA grupları hem de uygun olsun ya da daha farklı parametreleri ile ayrı endüksiyon eğrileri veri sığdırmak olmadığını sorgulamak için kullanılmıştır. Bu testte serbestlik dereceleri eğri uyum temel ham veri noktaları ortaya çıkar ve buna bağlı olarak anestezi test edilen konsantrasyonlarda sayısına ve parametreler fi olma sayısına bağlıdırt-EC 50 ve bu durumda Hill eğimi. Adım-bilge çıkması veriler analiz ve indüksiyon için veri aynı modellenmiştir. Çıkması için AK 50 hemen hemen her zaman nedeniyle aynı zamanda nöral atalet 30 olarak bilinen anestezi histerezis indüksiyon daha düşük olduğunu unutmayın. Beklenen sonuçların aksine, VLPO de IBA alınan hayvanlar, AB 50 veya araç-enjekte kontroller (F 2,80 = 1.73 ve p = 0.184 indüksiyon için, F 2 karşılaştırıldığında indüksiyon ya da ortaya çıkması için Tepesi yamacında anlamlı farklılık gösterdi 88 = 2.89 ve ortaya çıkması için p = 0.061). Bu fare VLPO nöronların% 1 IBA, post-mortem histoloji (gösterilmemiştir) ile teyit bir gerçek lezyon dirençli olduğunu gösterir. Lu ve diğ. Daha önce% 10 IBA bir doz% 10 enjeksiyonunun ardından sıçan VLPO 31, ama fare VLPO histolojik inceleme lezyon için gerekli olduğunu göstermiştir IBA de hiçbir belirgin olarak artmış gösterdiedemez hücre kaybı (gösterilmemiştir). Sıçan VLPO NMDA reseptörlerini 32 eksprese olduğu bilinmektedir. 10% IBA VLPO enjekte edildiğinde (Şekil 2, aşağıdaki konuya bakın) anestezik duyarlılığı üzerinde akut etkisi uygulamak mümkün olduğundan, bu fare VLPO de IBA'nın eylemleri için gerekli NMDA reseptörlerine sahip gerektiğini savunuyor. Böylece türler arasındaki farkın nedeni belirsizdir. Başarılı fare VLPO lezyonlar bir hedef galanin saporin 23 kullanılarak elde edilmiştir.
VLPO enjekte edildiğinde IBA izofluran duyarlılığı üzerinde uzun vadeli bir etkisi yoktur rağmen, bu ilacın akut uyarıcı niteliği VLPO nöronları uyarmak ve geçici anestezik duyarlılığı artırmak için beklenir. Şekil 2'de, uzun süreli belirgin ile kanıtlandığı gibi hemen VLPO içine ikili IBA mikroenjeksiyon aşağıdaki izofluran duyarlılıkta büyük bir akut değişim göstermek için ortaya testi için zaman kullanmışanestezik teslim (p <0.001) kesilmesinden sonra hipnoz. Tersine, at medial septum içine IBA mikroenjeksiyonu aracı ile enjekte edilmiş kontrol grubu (p> 0.05) ortaya çıkması için zaman hiçbir değişime neden olmadı. Bu bulgu, bu çekirdeğin inaktivasyonu çıkması 33,34 zamanı uzatır olduğunu gösteren önceki çalışma için ilginç bir faset ekler. Ortaya test etmek için zaman içinde deney ve kontrol grupları için veriler ortalama ve bir tek yönlü ANOVA ile karşılaştırılmıştır.
| Zaman | Isoflurane (% atm) | Mouse # 1 | Mouse # 2 | Mouse # 3 | ... |
| 0.4 | - | - | - | - | |
| 12:15 | 0.45 | - | X | - | - |
| 12:30 | 0.5 | - | X | X | - |
| 12:45 | 0.55 | - | X | X | |
| ... | 0.6 | - | X | X | X |
. Uzun vadeli Anestezik Hassasiyet Değerlendirme için bir Log Sheet Tablo 1 Örnek: anestezik doz% 0,05 oranında artmış ve refleksi olan her 15 dk her bir hayvan için değerlendirildi. "X", belirli bir zaman noktası için, doğrulma refleksini yitirmiş ve sahada hayvanları belirtir, "-" doğrulma reflekslerini muhafaza olanlar anlamına gelir.
Ventrolateral bölgeleri Preoptic Nuc içinde ibotenik Asit Enjeksiyonu Sonrası düzeltilmesi refleks One Week Şekil 1.. DeğerlendirmeLeus: Uzun süreli anestezi hassasiyet deneyi, bir araç ya da ibotenik asit (IBA) ya da fareler üzerinde yapılmıştır ventrolateral preoptik alanı (VLPO) bir hafta testten önce enjekte edildi. Her grup için indüksiyon ve ortaya veriler en uygun eğrileri (gölgeli çubuklar) parantez% 95 güven aralığı ile birlikte (düz çizgi, kesikli çizgilerle ortaya çıkışında indüksiyon) bir sigmoidal doz-yanıt eğrisi ile uygun edildi. Anestezik konsantrasyonu günlük 10 ölçekte çizildi. Çakışan% 95 güven aralıkları mor gösterilmiştir. Sigmoidal doz-repsonse araç ve IBA grupları EC 50 ve Tepesi yamacında göre ayrı en uygun eğriler için hiçbir delil önermek hem de uyuyor. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. E zamanıibotenik asit lokal Mikroenjeksiyon sonra mergence: hemen önce değerlendirilmesi için, fareler ventrolateral preoptik çekirdeği (VLPO) içine N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptör agonisti ibotenik asit (IBA) bir mikroenjeksiyon aldı. Bu alan, izofluran neden olmuş, hipnoz sırasında aktif olduğu bilinmektedir. IBA enjeksiyon aracı ile enjekte edilmiş kontrol grubu (p <0.001) kıyasla düzeltme refleksi dönmek için zaman içinde akut bir artışa yol açtı. IBA ile hayvanlar için ortaya çıkması zamanı (p> 0.05) kontrollerden farklı değildi medial septum içine enjekte. resmi büyütmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tek bir fare lorr değerlendirilmesi bir görünüşte basit bir görev olmasına rağmen, bu hayvanların bir grup güvenilir veri toplamak amacıyla konular arasında aynı fizyolojik koşullarını korumak için temeldir. Burada sunulan sıkı düzenlenmiş, yüksek kapasiteli lorr cihaz deneyler standardize ve verimliliği en üst düzeye çıkarmak için bir yol sunar. Termoregülasyonu ve eşit akış dağılımının temel ilkelerini izleyerek, bu sistem kolaylıkla yeniden ve bireysel deneyselciler ihtiyaçlarına uyacak şekilde özelleştirilebilir. Oda boyutu, sıçan gibi diğer türler için ölçekli olabilir ve ek bölmeleri girişi ve vakum daha fazla dal noktalarını takılarak yerleştirilebilinir. Tüm denekler mümkün sonuçlarının ikincil post-hoc onay video rekor denemeleri için yapar, şeffaf akrilik odaları aracılığıyla kolayca görülebilir. Akrilik da tempera izlemek için kullanılabilen radyo frekansı telemetri sistemleri ile uyumluTure, kan basıncı ve biyopotansiyel.
Biz bir farmakolojik müdahalenin ardından anestezi hassasiyetini değerlendirmek için iki farklı yöntem mevcut. Çıkması için zaman ve aşamalı indüksiyon testler her ikisi de doğrulma refleksi varlığını veya yokluğunu skoru deneyci gerektirir. Hatta böyle "onun sırtına haddelenmiş sonra iki dakika içinde odası katta dört pençeleri koyamayan", değerlendirme biraz subjektif olabilir gibi lorr açık bir tanımı ile. Bu, aynı tedavi tek-kör tutarlılığı sağlamak için deney süresince her bir hayvan puan olması en iyisidir. Anestezik duyarlılık değerlendirilmesi için hangi testi seçerken, farmakolojik müdahale etkisinin beklenen uzunluğu belirleyici bir faktör olmalıdır. Birçok ilaç çıkması paradigmaya akut zaman sınırlı bir süre anestezik duyarlılığı hakkında yararlı bilgiler sağlayabilir için eylem kısa bir süresi varzaman. Ancak, ilaç tercihen hipnoz ziyade ortaya çıkmasına indüksiyon bir hayvanın duyarlılığını etkileyebilir; indüksiyon zaman değişiklikler indüksiyon hızla oluşur ve böylece sürekli değerlendirmeyi gerektirdiğinden tespit etmek genellikle zordur. Indüksiyon ve uyanma AB 50 için artık adım adım testi girişinde ve hipnoz çıkmak hem de bilgi verebilir. Deneyin toplam süresi anestetik konsantrasyonu, yaklaşık 8 saat süren tipik indüksiyon + ortaya testleri ile, her adımda değiştirilmiş edildiği artış boyutuna bağlı olacaktır. EC 50 civarında beklenen anestezi aşaması boyutu azaltılması ve her bir gruptaki hayvanların sayısı arttıkça daha iyi bir donatılmış doz-yanıt eğrisi verecek ama aynı zamanda tahlil tamamlanması için gereken süreyi uzatmak olacaktır.
Kendi kontrolleri ile karşılaştırıldığında bazı farmakolojik müdahaleler farklı olarak deney hayvanlarının dakikalık havalandırma değiştirebilir. TOnun bir grup böylece sonuçları karıştırıcı, daha hızlı bir şekilde ortaya çıkması, diğer daha test etmek için zaman içinde uçucu anestetik nefes neden olabilir. Solt et al. Bu senaryoda 35 anestezi hassasiyeti test etmek için iyi bir alternatif bir yöntem tarif etmektedir. Bunların bir deneyde, sistemik metilfenidat önce anestezi ile dengelenmiş olan hayvanlarda izofluran sürekli maruz kalma sırasında teslim edilir. Kararlı hal koşullarında anestezi alımı ve dağıtım hassas metabolizması ve eliminasyonu ile dengeli olarak dakikalık havalandırma potansiyel karıştırıcı etkileri dolayısıyla sürekli anestezik pozlama sırasında dışındadır. Biz tarif Hazneler kolayca damar içine veya intraserebral ilaç iletimi için boru geçişine izin vermek için ek bir gaz geçirmez bir bağlantı noktası ile değiştirilebilir. Ayrıca, aşamalı bir deneyde anestezik her bir konsantrasyonu için dengeleme tarif edilen 15 dakika bazı durumlarda yeterli olmayabilir unutulmamalıdır. AnesthetBöyle halotan gibi izofluran, daha yüksek bir çözünürlüğe sahip olan ics, dokusunda tam konsantrasyonlarını ulaşmak için daha uzun sürer. Anestezik konsantrasyonu daha büyük adımları geçmesi büyük hayvanların ve hayvanlar da dengelenmesi için daha fazla zaman gerektirebilir. 15 dakika dengeleme için gerçekten yeterli olup olmadığını belirlemek için, artan ve azalan maruz bacaklarda hem anestetik aynı konsantrasyonda anestezi doku düzeyleri ölçülmelidir.
Taşımak için bir hayvanın yeteneği fiziksel ya da farmakolojik olarak engellendiği durumlarda, lorr hipnoz iyi bir vekil tedbir olarak hizmet olmayabilir. En güvenilir ve yaygın olarak kullanılan alternatif kortikal elektroensefalografi (EEG) kayıtları olduğunu. EEG anestezik duyarlılığı daha ince değişiklikleri almak için daha mümkün olabilir rağmen, önemli ölçüde daha pahalı biz tarif aparat daha kurmak olduğunu. EEG elektrotları implante invaziv ve zaman alan bir işlemdir ve obta yeteneğiBirden çok farelerden alınan verilerin eş zamanlı olarak çoğu ekipman durumu ile sınırlıdır. Ayrıca, EEG analizi lorr değerlendirmesinin basit ikili çıkış daha yorumlamak için kavramsal daha soyut ve zordur. Bu nedenlerden dolayı, burada tarif edilenler gibi davranışsal testler genellikle hızlı bir şekilde anestezi hassasiyeti taranması için daha uygun yöntem vardır. Uyarılma ve hipnoz düşündüren EEG desenleri davranışı ile iyi bir korelasyon unutmayın. Lorr ve EEG olasılıkla anestezik duyarlılığı ile ilgili yararlı bilgiler sağlayan iki ayrı bitiş noktaları vardır.
Dakika havalandırma ve hareket potansiyel ilaca bağlı değişikliklerin yanı sıra, burada tarif edilen yöntemlerin çeşitli başka sınırlamalar vardır. Lorr tarlada hipnoz için standart bir vekil olsa, onun ölçümü için kullanılan kriterler ve metodoloji laboratuvarlar genelinde farklılık göstermektedir. Farenin doğrulma refleksini değerlendirmek için sabit bir hızda döndürülmesi gerekmektedir Bazı avukat. Sürekli değerlendirme mantıksal düzeltilmesi refleks kayıp ve / veya döner olduğu ile hassas zamanlama daraltır, ancak sırtüstü döndü olma eylemidir sadece sırtüstü kalan daha uyarıcı olabilir. Buna ek olarak, adım adım lorr değerlendirme her adımında dengeye 15 dakika yetersiz olduğu tespit edilmesi halinde daha da uzatılabilir zaman alıcı bir tahlildir.
Bu kısıtlamalara rağmen, bu protokol için potansiyel uygulamalar uzak biz sunduk, belirli durumlarda ötesine. Hedef lezyonlar, anatomik anormallikler ve genetik mutasyonlar aynı aşamalı EC 50 saptaması kullanılarak test edilebilir; Açıkçası, farmakolojik müdahaleler anestezi duyarlılık değişmiş olabilir sadece bir yöntem değildir. Burada sunulan kontrollü bir ortam sistemi, kortikosteroidler, antibiyotikler, veya deneysel terapötik olarak solunan ilacın, herhangi bir teslim etmek için kullanılabilir. Aynı amo birçok fareler maruz yeteneğiİlacın unt kerede toksikoloji çalışmaları için bu kurulum idealdir. Buna ek olarak, odalar düzenlenmiş çevre sıcaklığına getirilmiş ve taze oksijen akışı ile bir yere, ameliyat sonrası iyileşme ortamı olarak hizmet vermektedir. Bu cihaz, temel hayvan vital işaretler izlenmesi ve kontrol edilmesi gerekir ki herhangi bir örneği için yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, R01 GM088156 ve T32 HL007713-18 tarafından desteklenmiştir. Biz doğrulma refleks cihazı montaj yardım ettikleri için Pennsylvania Araştırma Enstrümantasyon Shop Üniversitesi'nden Bill Pennie ve Michael Carman teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Oxygen | Airgas | OX300 | |
| Isoflurane | Butler Schein | Any volatile anesthetic of interest may be substituted | |
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| Mass flow meter- 10 SLPM | Omega Engineering | FMA-A2309 | |
| Mass flow meter- 500 SCCM | Omega Engineering | FMA-A2305 | |
| Anesthetic agent analyzer/gas indicator | AM Bickford | FI-21 Riken | |
| Heating water pump | Fisher Scientific | 13-874-175 | |
| Temperature transponders | BMDS | IPTT-300 | |
| RF temperature reader | BMDS | DAS-6007 |
References
- Meyer, H. H. Zur theorie der alkoholnarkose. I. Mittheilung. Welche Eigenschaft der An#228;sthetica bedingt ihre narkotische Wirkung? Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 42, 109-137 Forthcoming.
- Overton, C. E. Studien über die Narkose: Zugleich ein Beitrag zur allgemeinen Pharmakologie. , Fischer. Jena. (1901).
- Bignall, K. E. Ontogeny of levels of neural organization: the righting reflex as a model. Exp. Neurol. 3 (3), 566-573 (1974).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nat. Rev. Neurosci. 9 (5), 370-386 (2008).
- Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab. Anim. 27 (1), 30-39 (1993).
- Schernthaner, A., Lendl, C., Busch, R., Henke, J. Clinical evaluation of three medetomidine--midazolam--ketamine combinations for neutering of ferrets (Mustela putorius furo)]. Berliner und Münchener tierärztliche Wochenschrift. 121 (1-2), 1-10 (2008).
- Mohammad, F. K., Zangana, I. K., Abdul-Latif, A. R.
- Nicholls, E. A., Louie, G. L., Prokocimer, P. G., Maze, M. Halothane anesthetic requirements are not affected by aminophylline treatment in rats and dogs. Anesthesiology. 65 (6), 637-641 (1986).
- Tung, A., Szafran, M. J., Bluhm, B., Mendelson, W. B. Sleep Deprivation Potentiates the Onset and Duration of Loss of Righting Reflex Induced by Propofol and Isoflurane. Anesthesiology. 97 (4), 906-911 (2002).
- Pal, D., et al. Determination of Minimum Alveolar Concentration for Isoflurane and Sevoflurane in a Rodent Model of Human Metabolic Syndrome. Anesth. 2 (2), 297-302 (2012).
- Eger, E. I., Saidman 2nd,, J, L., Brandstater, B. Temperature dependence of halothane and cyclopropane anesthesia in dogs: correlation with some theories of anesthetic action. Anesthesiology. 26 (6), 764-770 (1965).
- Vitez, T. S., White, P. F., Eger, E. I. 2nd Effects of hypothermia on halothane MAC and isoflurane MAC in the rat. Anesthesiology. 41 (1), 80-81 (1974).
- Antognini, J. F. Hypothermia eliminates isoflurane requirements at 20 degrees C. Anesthesiology. 78 (6), 1152-1156 (1993).
- McKenzie, J. D., et al. Effects of temperature on the anaesthetic potency of halothane, enflurane and ethanol in Daphnia magna (Cladocera: Crustacea). Comp. Biochem. Physiol. C. 101 (1), 15-19 (1992).
- Icaza, E. E., et al. Isoflurane-Induced Changes in Righting Response and Breathing are Modulated by RGS Proteins. Anesth. Analg. 109 (5), 1500-1505 (2009).
- Drexler, B., Antkowiak, B., Engin, E., Rudolph, U. Identification and characterization of anesthetic targets by mouse molecular genetics approaches. Can. 2 (2), 178-190 (2011).
- Wafford, K. A., et al. Differentiating the role of gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptor subtypes. Biochem. 32 (Pt3), 553-556 (2004).
- Lakhlani, P. P., et al. Substitution of a mutant α2a-adrenergic receptor via "hit and run" gene targeting reveals the role of this subtype in sedative, analgesic, and anesthetic-sparing responses in. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (18), 9950-9955 (1997).
- Sonner, J. M., Gong, D., Eger, E. I. Naturally Occurring Variability in Anesthetic Potency Among Inbred Mouse Strains. Anesth. 91 (3), 720-726 (2000).
- Sun, Y., et al. High throughput modular chambers for rapid evaluation of anesthetic sensitivity. BMC Anesthesiol. 6 (1), 13 (2006).
- Hu, F. Y., et al. Hypnotic Hypersensitivity to Volatile Anesthetics and Dexmedetomidine in Dopamine β-Hydroxylase Knockout Mice. Anesthesiology. , (2012).
- Kelz, M. B., et al. An essential role for orexins in emergence from general anesthesia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (4), 1309-1314 (2008).
- Moore, J. T., et al. Direct Activation of Sleep-Promoting VLPO Neurons by Volatile Anesthetics Contributes to Anesthetic Hypnosis. Curr. 22 (21), 2008-2016 (2012).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (65), e4079 (2012).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. J. Vis. Exp. (67), e2771 (2012).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N.
- Szymusiak, R., Alam, N., Steininger, T. L., McGinty, D. Sleep-waking discharge patterns of ventrolateral preoptic/anterior hypothalamic neurons in rats. Brain Res. (1-2), 178-188 (1998).
- Nelson, L. E., et al. The sedative component of anesthesia is mediated by GABAA receptors in an endogenous sleep pathway. Nat. Neurosci. 5 (10), 979-984 (2002).
- Li, K. Y., Guan, Y., Krnjević, K., Ye, J. H. Propofol Facilitates Glutamatergic Transmission to Neurons of the Ventrolateral Preoptic Nucleus. Anesthesiology. 111 (6), 1271-1278 (2009).
- Friedman, E. B., et al. A Conserved Behavioral State Barrier Impedes Transitions between Anesthetic-Induced Unconsciousness and Wakefulness: Evidence for Neural Inertia. PLoS ONE. 5 (7), e11903 (2010).
- Lu, J., Greco, M. A., Shiromani, P., Saper, C. B. Effect of lesions of the ventrolateral preoptic nucleus on NREM and REM sleep. J. Neurosci. 20 (10), 3830-3842 (2000).
- Sun, X., Whitefield, S., Rusak, B., Semba, K. Electrophysiological analysis of suprachiasmatic nucleus projections to the ventrolateral preoptic area in the rat. Eur. J. Neurosci. 14 (8), 1257-1274 (2001).
- Ma, J., Shen, B., Stewart, L. S., Herrick, I. A., Leung, L. S. The septohippocampal system participates in general anesthesia. J. Neurosci. 22 (2), RC200 (2002).
- Leung, L. S., Ma, J., Shen, B., Nachim, I., Luo, T. Medial septal lesion enhances general anesthesia response. Exp. Neurol. , (2013).
- Solt, K., et al. Methylphenidate Actively Induces Emergence from General Anesthesia. Anesthesiology. 115 (4), 791-803 (2011).
